Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Vi vil gjerne takke alle medlemmene av Translational Medicine ved AstraZeneca Oncology Research and Early Development for deres tilbakemelding på protokollen, spesielt Hedley Carr, Tammie Yeh og Nathan Standifer for råd om plasmaforberedelse for henholdsvis ctDNA-analyse, PBMC-isolasjon og PBMC-kryopreservering og immunofenotyping.

Informert pasientsamtykke og full overholdelse av relevante nasjonale etiske krav i hver jurisdiksjon, for eksempel Human Tissues Act (HTA – Storbritannia, 2004) og Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA – UNITED States, 1996) er obligatoriske. Sørg for å ha fullt dokumentert etikkgodkjenning før du begynner på arbeid med menneskeavledede materialer. Blod som ble brukt i optimaliseringen av denne protokollen ble gitt passende samtykke fra Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (etikkreferanse 16/EE/0459, studie CRF494, delstudie 001) drevet av NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Storbritannia, under en human biologisk prøveavtale med National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. AstraZeneca Biobank i Storbritannia er lisensiert av Human Tissue Authority (Lisens nr. 12109) og har National Research Ethics Service Committee (NREC) Approval as a Research Tissue Bank (RTB) (REC No 17/NW/0207).
1. Generell forberedelsesveiledning
MERK: Alt arbeid med uløst menneskelig materiale som blod, plasma og PBMCer i denne protokollen må fungere under forutsetning av at disse materialene kan bære potensielt smittsomme stoffer og derfor må utføres under egnede biosikkerhetsforanstaltninger. For pasienter som er testet som negative for kjente patogener, må du ikke anta at prøver ikke er smittsomme, og at egnede sikkerhetsforanstaltninger fortsatt må brukes. Avfallsprodukter generert fra disse materialene skal behandles med de samme biosikkerhetsforanstaltningene og avhendes i henhold til lokale regler.
<ol><li>Velg mellom de to typer mononukleære celleforberedelsesrør som bruker enten natriumsitrat eller natrium heparin som antikoagulantia. For mange nedstrømsapplikasjoner kan disse to antikoagulantia brukes om hverandre, men begge antikoagulantia bør testes før du velger en for studien.</li>
	<li>Merk ett 8 ml mononukleært celleforberedelsesrør som skal brukes til blodoppsamling med pasientens kodede ID. Hold rørene ved romtemperatur (18-25 °C).</li>
	<li>Oppbevar 1x PBS ved romtemperatur (18-25 °C). Bruk 30 ml per tilberedning.</li>
	<li>Sørg for at rørene for separate plasmaprøver og kryonalen for PBMC-prøven er nøyaktig merket med unike identifikatorer, som angitt i den aktuelle delen av laboratoriehåndboken.</li>
	<li>Hvis PBMCer skal brukes til å overvåke fosforylaterte proteiner, lag PBS supplert med fosfatasehemmere: bland 5 ml PBS med 50 μL fosfatasehemmercocktail 2 + 50 μL fosfatasehemmercocktail 3. Forbered deg frisk og hold på is til bruk.</li>
	<li>Hvis PBMCer skal kryopreserveres, klargjør du 1 ml fryseblanding per prøve ved å blande 90% FBS + 10% DMSO.</li>
</ol>2. PBMC-samling (figur 1A)
<ol><li>Trekk 8 ml blod inn i det mononukleære cellepreparatrøret ved hjelp av standardteknikken beskrevet av produsenten. Snu røret forsiktig 8 til 10 ganger for å blande det antikoagulerende tilsetningsstoffet med blod. Ikke rist for å unngå hemolyse. Registrer tidspunktet da blodet ble trukket.</li>
	<li>Etter oppsamling, oppbevar røret oppreist ved romtemperatur til sentrifugering. Behandle prøvene så snart som mulig, ideelt innen en time etter denne blodsamlingen, men ikke senere enn 4 timer etter innsamling. Registrer timingen når du starter behandlingen av blodet.</li>
	<li>Umiddelbart før sentrifugering remiks blodprøven ved å forsiktig invertere røret 8 til 10 ganger til.</li>
	<li>Sentrifuger rør/blodprøverør i en horisontal rotor (utsvingshode) ved 1500 – 1800 x g i 30 minutter ved romtemperatur (18-25 °C). Pass på at alle rørene er riktig balansert.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg"> Figur 1: Generell oversikt over protokollen og representative bilder av sentrifugen. (A) Skjematisk oversikt over protokollen for fremstilling av PBMCer og plasma. *Hvis det er tidsbegrensninger, kan trinn 2.4 forkortes til 20 minutter, og trinn 3.3 til 3.6 kan fjernes. ** Ta en aliquot for å telle celler, om nødvendig. 2 ekstra sentrifugeringstrinn som kreves for ctDNA-analyse/ metabolomics (B) bilde av et utsvingshoderotor sentrifugesett for trinn 2.4. (C) Bilde av rotoren, som inkluderer to skuffer som inneholder adapterne for å spinne mononukleære celleforberedelsesrør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
MERK: x g (også kalt RCF, relative sentrifugalenheter) og RPM (omdreininger per minutt) er forskjellige enheter. Pass på å stille sentrifugen for x g (RCF). Bruk den elektroniske kalkulatoren (se Tabell over materialer) for konverteringen. Hvis bare fastvinklet rotor er tilgjengelig, utfører du dette trinnet i 10 minutter ved 1500 – 1800 x g.
<ol start="5"><li>Etter sentrifugering, sjekk om det er et mørkt rødt lag under barrieren (som for det meste inneholder røde blodlegemer), og 2 lag over barrieren. Det øverste laget er plasmaet (halmfarget) og det hvite laget under er den buffy kappen som inneholder PBMC-ene. Disse lagene kan lett skilles når du ser på røret mot en mørk / svart bakgrunn.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg"> Figur 2: Rør for å isolere PBMCer. (A) Bilde av rørene før sentrifugering (trinn 2.4), enten tom (venstre) eller inneholder blod (høyre). (B) Vellykket separasjon av PBMC-laget etter sentrifugering (trinn 2.5). (C) Bilde av PBMC-laget etter sentrifugering og litt plasma igjen for å sikre at alle PBMCer samles inn (trinn 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
MERK: Hvis disse lagene ikke er synlige, indikerer dette sannsynligvis en feil i oppsettet av sentrifugeringsenhetene. Kontroller at riktig sentrifugeadapter brukes og at riktig "x g" er stilt inn. Gjenta trinn 2.4.
<ol start="6"><li>Umiddelbart etter sentrifugering, bruk en serologisk pipette for å overføre omtrent halvparten av plasmaet til et merket 15 ml størrelse konisk sentrifugerør med hette, mens du er forsiktig så du ikke forstyrrer PBMC-laget (ca. 4-5 ml). Oppbevar dette røret midlertidig med plasma på våt is som skal brukes senere i trinn 4. Sett til side for nå.</li>
	<li>Samle hele PBMC-laget med en Pasteur pipette ved å plassere pipetten i cellelaget og overføre til et annet konisk sentrifugerør på 15 ml med hette. Det er akseptabelt å også ta en liten mengde plasma, om nødvendig, for å få hele PBMC-laget helt. Volumet er vanligvis 1-2 ml. Fortsett umiddelbart med trinn 3 nedenfor.</li>
</ol>3. PBMC vasketrinn
MERK: Formålet med vasketrinnene er å fortynne og fjerne restplater og plasma fra PBMC-pelletsen. Alle sentrifugeringstrinn skal utføres ved romtemperatur (18-25 °C).
<ol><li>Legg romtemperatur PBS til PBMC-røret for å bringe volumet til 15 ml. Hette røret. Bland celler ved å invertere røret forsiktig 5 ganger.</li>
	<li>Sentrifuge i 15 min ved 300 x g. Merk at dette er en mye mildere sentrifugering enn den første sentrifugeringen.</li>
	<li>Visualiser pelletsen ved å se røret mot en mørk / svart bakgrunn. Fjern supernatanten ved vakuumaspirasjon eller med en pipette (figur 3A). Kast supernatanten og la et volum på ca. 500 μL over den hvite PBMC-pelletsen.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg"> Figur 3: PBMC-pellets. (A) Pellet oppnådd i første vask trinn 3.3. (B) Pellet isolert i den andre vasken (trinn 3.7). (C) Pellets med høyt hemolysenivå hentet fra blod behandlet senere enn 4 timer fra blodet, trekkes isolert i den andre vasken (trinn 3.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol start="4"><li>Resuspend cellepellet ved forsiktig pipettering opp og ned i gjenværende supernatant.</li>
	<li>Legg til ekstra 1x PBS for å bringe volumet til 10 ml. Hette røret. Bland cellene ved å invertere røret forsiktig 5x. Hvis celletelling kreves i studieprotokollen, går du til trinn 3.5.1, hvis det ikke er nødvendig, går du direkte til trinn 3.6.<ol>
<li>Ta en 40 μL aliquot av de re-suspenderte cellene og bland med 40 μL trypan blå. Tell levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisk celleteller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sentrifuger suspensjonen fra trinn 3.5 i 10 min ved 300 x g. Fjern så mye supernatant som det er rimelig mulig uten å forstyrre cellepellet.</li>
	<li>Fjern og kast forsiktig eventuelle gjenværende supernatanter over cellepellet ved å pipettere med en fin spiss Pasteur pipette eller en mikropipette uten å forstyrre cellepellet. La det være lite eller ingen væske over pelletsen etter å ha fullført dette trinnet. Hvis endepunktet for denne protokollen er en PBMC-pellets, går du til trinn 3.8. Hvis endepunktet er kryopreserverte PBMCer, går du til trinn 3.10.</li>
	<li>Tilsett 50 μL ny PBS (eller den ekstra PBS som er klargjort i trinn 1.5 hvis det er aktuelt for endepunktet) til pellets og pipette opp og ned forsiktig ved hjelp av en mikropipette for å homogent resuspendere alle cellene. Overfør hele cellefjæringen til en merket 1,5 ml kryo toårig og legg umiddelbart på våt is til du fryser prøvene.</li>
	<li>Frys de merkede prøvene ved å plassere dem i flytende nitrogen eller direkte i tørris. Celler kan også fryses ved -80 °C fryser ved hjelp av cellefrysingsbokser. I dette tilfellet, prechill boksene helt i -80 °C før du legger til cellerørene. Registrer tidspunktet da cellepellets ble frosset. Når cellene fryser, oppbevars ved -80 °C, sendes frosset på tørris.</li>
	<li>Eventuelt, for å kryopreservere PBMC-ene, re-suspendere pellet i 1 ml av fryseblandingen (trinn 1.6) og overføre til en merket kryo toårig. Fortsett som beskrevet i trinn 3.9, men i dette tilfellet er det bare akseptabelt å bruke cellefrysingsbokser for å fryse ned prøvene. Overfør til flytende nitrogen for frakt og lagring etter å ha vært i fryseboksen i minst 24 timer.</li>
</ol>4. Tiltak for plasmaforberedelse (Figur 1A)
<ol><li>Etter -80 °C lagring av PBMC pellets, nå forberede plasma aliquot som ble midlertidig lagret på våt is i trinn 2.6. Utfør følgende sentrifugeringstrinn for å avklare plasmaet hvis formålet med prøven er ctDNA-analyse, ellers gå direkte til trinn 4.2.<ol>
<li>Sentrifuger plasmaet i 10 min ved 1600 - 2000 x g ved 4 – 8 °C i en fastvinklet rotor (eller 15 min i en utsvingsrotor).</li>
		<li>Rør forsiktig av plasma supernatanten, pass på at du ikke forstyrrer pellets og overfører til et nytt 15 ml rør. Kast røret som inneholder det pelleterte materialet.</li>
		<li>Sentrifuger plasmaet i 10 min ved 1600 - 2000 x g ved 4 – 8 °C i en fastvinklet rotor (eller 15 min i en utsvingsrotor).</li>
		<li>Overfør plasma supernatanten forsiktig til et nytt 15 ml rør, sørg for ikke å forstyrre noe pelletert materiale. Kast røret som inneholder det pelleterte materialet. MERK: Hvis en nedkjølt sentrifuge ikke er tilgjengelig, må du holde celler på is i 5 minutter mellom hvert spinn, eller sentrifugeprøver i et kaldt rom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overfør plasma i 1 ml aliquots til 5 friske 2 ml mikrorør. Bruk færre enn 5 hetteglass hvis det ikke er nok plasma til å fylle 5 hetteglass med 1 ml aliquots, og det forventes at det siste hetteglasset vil inneholde mindre enn 1 ml plasma. Hvis det er mer enn 5 ml plasma, kast resten. Registrer det totale volumet av plasma i hvert rør.</li>
	<li>Umiddelbart fryse plasma aliquots oppreist, ved å lagre dem ved -80 °C.</li>
</ol>5. Eksempel på forsendelse
<ol><li>Send både PBMC pellets og plasmaprøver på tørris.</li>
	<li>Påse at prøven ikke tines før og under forsendelsen. Pakk tilstrekkelig tørris med prøvene for å sikre at de forblir frosset i hele forsendelsesprosessen, med tanke på mulige forsinkelser som kan oppstå under transport.</li>
</ol>6. Helblodsbestråling og vestlig blotanalyse av DDR biomarkører (Figur 4A)
MERK: Dette er en ex vivo-behandling som i de fleste tilfeller ikke vil være nødvendig i klinikken, men disse eksperimentene er en verdifull utforskende strategi for å finne egnede kliniske biomarkører. Blodprøver bør behandles så snart som mulig ved innsamling for å sikre best mulig resultat.
<ol><li>Varm opp røntgenskapet. Merk tre 15 ml rør som henholdsvis 0, 0,2 og 7 Gy.</li>
	<li>Ta tre mononukleære celleforberedelsesrør som inneholder ferskt trukket blod fra et enkelt individ, og etter forsiktig å invertere rørene 8 til 10 ganger overføre blodet til de tre 15 ml rørene.</li>
	<li>Plasser 0,2 Gy-røret i røntgenskapet, lukk døren og påfør 0,2 Gy dose på røret ved å velge hyllenummer og dose. Påfør 7 Gy strålingsdose på 7 Gy-røret ved å justere dosen som er valgt i skapet.</li>
	<li>Inkuber de tre rørene ved 37 °C i en time.</li>
	<li>Overfør blodet tilbake til de mononukleære celleforberedelsesrørene og utfør PBMC-forberedelsesprotokollen som for en klinisk innstilling fra trinn 2.4 til trinn 3.8.</li>
	<li>Tilsett et volum lysisbuffer supplert med protease- og fosfatasehemmere lik cellepelletsvolumet (i dette tilfellet 70 μL RIPA-buffer) til hver av cellepellets, pipette opp og ned og inkuber på is i 10 minutter. Soniker prøvene hvis en soniker er tilgjengelig (3 sykluser, 30 s PÅ / 30 s AV, 4 °C), alternativt sprøyte prøvene for å bryte nukleinsyrene for å eliminere viskositet i prøven.</li>
	<li>Sentrifuger prøvene i 10 min ved ≥ 15 000 x g, ved 4 °C. Overfør hver supernatant til et nytt 1,5 ml rør, kvalitativt vurdere nivået av hemolyse (visuell inspeksjon) og måle proteinkonsentrasjonen ved en hvilken som helst foretrukket metode.</li>
	<li>Bland 40 μg total lysat med prøvelastebuffer som inneholder SDS og prøvereduserende middel. Kok prøver i 5 min i en varmeblokk.</li>
	<li>Last 20 μg av hver prøve per bane i duplikat i en 4-12% bis-tris proteingel og kjør en SDS-PAGE.</li>
	<li>Etter separasjon, overfør proteinene til en nitrocellulosemembran ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system (20 V, 10 min) og blokker med 5% melk i TBST.</li>
	<li>Klipp membranen i relevante molekylære størrelser og inkuber med de primære antistoffene over natten ved 4 °C (se Tabell over materialer for antistoffer og fortynning).</li>
	<li>Fjern de primære antistoffene og vask membranene 3 ganger med TBST i 5 minutter ved romtemperatur. Inkuber med HRP-konjugede sekundære antistoffer i 45 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Vask 3 ganger med TBST i 5 min.</li>
	<li>Påfør ECL-reagenset og analyser bildene som er oppnådd i forhold til HRP-signal.</li>
</ol>

Alle forfatterne er eller var ansatte og stavsholdere i AstraZeneca. VM er ansatt i Acerta Pharma, eier aksjer i AstraZeneca og Gilead Sciences.

Preparater av høy kvalitet av PBMCer og plasma som kan tilberedes robust og reprodusert på kliniske prøvesteder, er uvurderlige for å informere kliniske studier om perifere prediktive og farmakodynamiske translasjonelle biomarkørendepunkter. Her har vi gitt en kort, klar protokoll som tar for seg de typisk problematiske trinnene som hertil har vært sårbare for utførelsesfeil i en klinisk studieinnstilling. Protokollen kan imidlertid optimaliseres ytterligere for å oppfylle spesifikke krav, for eksempel tidsbegrensninger på det kliniske stedet eller typen nedstrømsanalyser (se Tilleggsfil).
Til dette målet har vi vist hvordan du isolerer både PBMCer og plasma fra fullblod ved hjelp av mononukleære cellepreparatrør for å produsere frosne PBMC-pellets og frossent plasma egnet for en rekke nedstrømsanalyser. Vi har rettet oppmerksomheten mot spesielt kritiske protokolltrinn som involverer sentrifugering og identifisering av PBMC-laget i trinn 2.5, og PBMC-pellets i trinn 3.3 og 3.6. Historisk sett, hvor kliniske steder ofte har gått galt, er det å sette sentrifugen til de riktige enhetene (forvirre en RCF- eller x g-verdi med en RPM-verdi), forsinke behandlingen av blodprøver, temperatur og tilstedeværelsen av store mengder PBS over den frosne cellepelleten. I de fleste sentrifugerotorer feilaktig inn i en x g-verdi som en RPM-innstilling vil resultere i betydelig under-sentrifugering med et resulterende dårlig definert eller fraværende PBMC-lag, og potensiell utilsiktet PBMC-kasting under vasketrinn på grunn av ineffektiv cellepelleting. Det er imidlertid en mulighet for at et PBMC-lag ikke er synlig til tross for at du bruker de riktige sentrifugeringsinnstillingene og rotoradapteren hvis pasienten har utviklet leukopeni. Denne tilstanden kan påvirke pasienter som er inkludert i onkologistudier på grunn av kjemoterapi eller strålebehandling og bør vurderes. Et annet kritisk punkt som er gjort klart i protokollen er at prøver må behandles innen 1-2 timer fra blodtrekningen for å redusere muligheten for hemolyse som påvirker protokollen negativt. Videre reduserer målet om å behandle prøvene i løpet av den første timen av blodtrekningen ex vivo variabilitet, noe som kan ha stor innvirkning på farmakokinetikkavlesninger og på biomarkører påvirket av blodbevaring eller aktive signalveier, for eksempel tilfellet vist i figur 4. Forsinkelser i prøvebehandling kan også ha en skadelig effekt i celle levedyktighet hvis celler skal kryopreserveres34. En annen faktor som kan påvirke både utbyttet og rød blodcelleforurensning er lagring og sentrifugeringstemperatur, som bør holdes ved romtemperatur (18-25 °C). Lavere temperaturer øker tettheten av tetthet gradient medium, noe som resulterer i en høyere grad av rød blodlegeme og granulocytt forurensning som disse cellene ikke aggregerer også. På den annen side fører høyere temperaturer til PBMCer fanget mellom aggregerte erytrocytter, og reduserer dermed utbyttet avpreparatet 15,27,28. Og til slutt er det avgjørende at ikke mer enn 50-100 μL væske er til stede med cellepellet i kryo toårig, da dette påvirker konsentrasjonen av proteinlysater oppnådd i nedstrømsbehandling av disse PBMC-preparatene negativt. Et overskudd av væske vil overdilute prøver, noe som fører til lysater med svært lav proteinkonsentrasjon som ikke er egnet for biomarkøranalyse. I tillegg vil bevaring av eventuelle post-translasjonelle modifikasjoner bli svekket, og effektiviteten av lysis vil også bli sterkt redusert.
Mononukleære celleforberedelsesrør ble valgt da de tilbyr den mest enkle måten å isolere både PBMCer og plasma i en enkelt blodtrekning for kliniske studier med, etter vår erfaring, utmerket reproduserbarhet. Blodbehandlingen krever ikke høyt utdannede operatører, og bruken av et enkelt rør fjerner behovet for å fortynne blodet og dets overføring til et annet rør, noe som reduserer farerisikoen; forkorter protokollen på grunn av å utføre sentrifugeringstrinnene med bremser på; og alle reagenser er i røret, noe som reduserer variasjonen. Vår erfaring er at disse fordelene oppveier de høyere kostnadene for disse rørene sammenlignet med andre klassiske metoder som bare består av bruk av en tetthet gradient separasjon medium27,28 (£ 410 per 60 enheter mens lymfoprep medium for 66 50 ml preparater er £ 215). De er tilgjengelige i to typer antikoagulantia, heparin og sitrat, som begge er sammenlignbare med å opprettholde funksjonaliteten til de isolerte PBMCene35, derfor vil valget av en antikoagulant over den andre være basert på mulig påvirkning av heparin eller sitrat i nedstrøms biomarkørstudier. Mens det har vist seg at EDTA-rør gir det høyeste PBMC-isolasjonsutbyttet sammenlignet med heparin eller sitrat13, fordelen med brukervennlighet av en-rør-bare manipulasjon motvekter denne vurderingen. Hvis cytokiner skal analyseres antikoagulantia kan ha en effekt av nivåene som oppdages i plasma, bør derfor begge antikoagulantia testes før du velger en for den kliniske studien36. Hvis plasma skal brukes til metabolomics studier, vil bruk av heparin som antikoagulant foretrekkes37. Derfor er det eneste punktet som er overlatt til sluttbrukeren eller den kliniske studiens oversettelsesforsker om sitrat eller heparin vil være mer hensiktsmessig for deres formål når kostnadene er vurdert.
Mens fordelene ved å bruke celleforberedelsesrør er mange sammenlignet med begrensningene de utgjør (høyere kostnader og tilgjengelighet av et begrenset utvalg av antikoagulantia), kan hovedbegrensningen for bruk av PBMCer eller plasma for å oppnå PD biomarkører i kliniske studier, spesielt i onkologi, ikke være relatert til isolasjonsmetoden. Bortsett fra hematologiske kreftformer, hvor svulst er direkte samplet fra perifert blod, for andre kreftindikasjoner plasma og PBMCs er surrogatvev som ikke nødvendigvis etterligner den primære svulsten. Perifert vev kan ikke dele genomet og epigenomet med primærsvulsten, derfor er den perifere analysen av biomarkører avhengig av en bestemt tumormutasjon hovedsakelig begrenset til ctDNA-analyse (fra plasma) eller CTCer (ved etterfølgende sortering av PBMC-laget). I tillegg kan det hende at signalisering av kaskader som kjører eller bidrar til tumorproliferasjonen ikke er like aktiv i perifert blod. Denne utfordringen kan overvinnes ved å bruke biomarkør oppdagelse tilnærminger rettet mot blod8 for å identifisere alternative biomarkører eller kobling ex vivo behandlinger til isolering av plasma38 og PBMC preparater26.
I den nåværende protokollen kan frosne PBMC-pellets enkelt behandles utenfor det kliniske stedet for å gi proteinlysater som kan evalueres ved vestlig blotting eller ELISA-teknikker. Det er også presentert alternative metoder for å bruke PBMCer for å aktivere IHC-metoder (Supplementary File). I tillegg har vi også detaljert muligheten for kryopreserverende PBMCer (se Tilleggsfil) for overvåking av immunceller, en relevant anvendelse i onkologi, med immunkontrollpunkthemmere og ADC-er som i økende grad testes i kliniske studier. Vurderingen av immunfunksjoner som ADCC16 og immunofenotyping er applikasjoner som er kompatible med kryopreserverte PBMCer isolert fra mononukleære cellepreparatrør15. Det er en advarsel om kryopreservering, da det kan fremme nedregulering av visse overflate- og interne markører og kan svekke visse cellefunksjoner, men PBMC kryopreservering er den eneste mulige måten å utføre disse analysene på grunn av tidsbegrensninger når du håndterer prøver fra flere kliniske steder til behandling i eksterne laboratorier14,15, og disse skadelige effektene kan i stor grad overvinnes av gode tiningsmetoder og hvileperioder39.
Til slutt vil protokollen som er gitt her tillate pålitelig forberedelse av PBMCer og plasmaprøver i enhver klinisk institusjon med vanlig utstyr og materialer, slik at translasjonelle endepunkter fra perifert blod kan aktiveres robust i globale kliniske studier.
Til slutt demonstrerer vi hvordan analysen av PBMC-lysater mekanistisk kan informere responsen på DNA-skadelige midler ved å vise en doseavhengig postoversettelsesendring av viktige DDR-faktorer, som kan brukes til å forme klinisk utvikling. Fremtidsrettet implementering av metoder som er mer kvantitative enn vestlig blotting (f.eks. massespektrometri40) og krever mindre inngangsmateriale (som kapillær vestlig blotting og ELISA) vil bidra til å flytte disse prekliniske resultatene mot en mer robust, systematisk evaluering av PBMC-pasientprøver.

Narkotikautvikling tar sikte på å levere nye terapeutiske stoffer som adresserer udekkede medisinske behov og mer målrettet, personlig medisin. Flere legemiddelmekanismer er under aktiv undersøkelse, inkludert enzymatisk hemming som kinase1, protease2eller poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hemmere3, proteinforringelser4, terapeutiske antistoffer5, og antistoffkonjugede legemidler (ADC)6, blant mange andre. Et eksempel på innsatsen for å oppnå bedre behandlinger i onkologi er bruk av kinasehemmere med sikte på å stoppe signalkaskadene som holder kreftceller som sprer seg1,7. Måling av nivåene av substratfosforylering som er spesifikk for disse kinasene, er den beste farmakodynamiske biomarkøren for å kvantifisere virkningsmekanismen til disse inhibitorene8. Andre legemidler kan modulere uttrykket av et gitt protein, og i så fall er det viktig å kunne kvantifisere endringene i konsentrasjonen av målproteinet i løpet av behandlingen. Derfor, uavhengig av egenskapene til et stoff eller en patologi, evaluering av biomarkører for å etablere farmakokinetikk (PK)/ farmakodynamikk (PD) forholdet mellom legemiddeleksponering og målmodulering er den beste praksisen i tidlig klinisk utvikling og muliggjør bestemmelse av en sikker og tolerert farmakologisk aktiv dose / tidsplan9.
Mens i onkologi klinisk utvikling, biomarkør analyse i biopsier kan være den beste innstillingen for å etablere bevis på mekanismen til et stoff, antall tilgjengelige biopsier i en studie er vanligvis ganske begrenset10,11. Alternativt er perifere blodprøver svært verdifulle for kliniske studier fordi de innebærer en minimal invasiv prosedyre, er raske og enkle å oppnå for å lette langsgående analyse, er billigere enn biopsier og gir enorm informasjon for sanntidsovervåking av utfallet av en behandling. En ekstra fordel med å vurdere PD biomarkører i perifert blod er kapasiteten til å bruke biosample til også å kvantifisere PK slik at nøyaktighet i å bestemme PK / PD kvantitative relasjoner og påfølgende PK / PD modellering12,13. Perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer) fra fullblod kan isoleres for å studere proteinmarkører, som enten opplever endringer i uttrykksnivået eller i deres postoversettelsesendringer. I tillegg kan PBMCer brukes til immunofenotypingsformål14,15, immunfunksjonalitetsanalyser som å vurdere antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC)16 og epigenetisk analyse gjennom RNA-isolasjon. På samme måte kan plasma fra fullblod brukes til å kvantifisere cytokiner for å karakterisere pasientens immunologiske respons, for å utføre metabolske studier, og også til å isolere og sekvensere sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) for å overvåke den kloniske utviklingen av sykdom under valg fra terapeutisk middel, som ofte gir et mekanistisk grunnlag for behandlingsresistens17,18,19 muliggjør utvikling av etterfølgende generasjoner av terapeutiskemidler 20. Til slutt tillater isolering av sirkulerende tumorceller (CTCer) fra perifert blod evaluering av sykdomsprogresjon ved langsgående opplisting, DNA / RNA-sekvensering og proteinbiomarkøranalyse21. Selv om denne isolasjonen er kompatibel med protokollen beskrevet heri22, gjør den lave overfloden av CTCer i mange krefttyper og tidlige stadier av sykdommen bruk av spesialiserte rør mer egnet for å minimere CTC-nedbrytning23.
De siste årene har bruken av flytende biopsier forbedret informasjonen som er oppnådd i kliniske studier, og PBMC-samlinger har blitt inkludert i mange studier for å overvåke målengasjement og bevis på mekanisme enten direkte i tumorceller for noen typer hematologiske maligniteter, eller på PBMC-ene selv som PD-surrogater av tumorceller24,25,26. Utarbeidelsen av høykvalitetsprøver påvirker positivt den sikreste og mest effektive behandlingen for en gitt patologi, men etter vår erfaring har kvaliteten på PBMC-preparater oppnådd fra forskjellige kliniske steder blitt utsatt for stor variasjon i kvalitet, noe som resulterer i prøver som ikke er egnet for nedstrømsanalyse. Dette har påvirket mengden PD-data som kan samles inn fra disse studiene.
Her beskriver vi i detalj en lettfattelig protokoll som viser hvordan man effektivt isolerer både PBMCer og plasmaprøver fra en enkelt blodtrekning i en klinisk setting. Protokollen er basert på instruksjonene fra produsenten av mononukleære celleforberedelsesrør, som inneholder modifikasjoner der reell erfaring har fremhevet vanskeligheter med protokollutførelse som rapportert av kliniske steder, for eksempel sentrifugeringsproblemer, behandlingsforsinkelser og prøveoverføring til kryovarier. Det finnes alternative kommersielt tilgjengelige metoder for bruk av mononukleære celleforberedelsesrør basert på tetthet gradient separasjon ved hjelp av polysakkaridløsninger med eller uten en barriere som skiller løsningen fra blodet27. Hvis det relevante kliniske stedet allerede har god erfaring med disse alternative metodene, kan denne protokollen aksepteres erstattet med disse. I slike tilfeller kan to faktorer vurderes: Noen alternative metoder krever overføring av fullblod fra et oppsamlingsrør til et eget forberedelsesrør der en ekstra overføring av humant primærbiologisk materiale kan utgjøre en litt økt sikkerhetsrisiko, og suksessen til metoder uten barrierer som skiller blodet fra polysakkaridløsningen, er avhengig av kritiske trinn som å legge blodprøven på tetthetsgradientmediet som krever utvikling av et raffinert nivå av teknisk ekspertise som ikke alltid finnes i et laboratorium. Ovennevnte punkter til tross, den generelle levedyktigheten og cellegjenoppretting er sammenlignbare mellom disse teknikkene15,28. Valg av metodikk er derfor noe avhengig av tidligere teknisk erfaring, men i våre hender kan mononukleære celleforberedelsesrør brukes vellykket i en bred klinisk sammenheng og er vår ellers anbefaling.
Mens et endepunkt i denne protokollen er å produsere PBMC-pellets for videre behandling i lysater, kan andre endelige anvendelser av PBMC-samlingen implementeres, for eksempel isolering av nukleinsyrer, eller produsere PBMC-smør eller PBMC-blokker egnet for immunhiistokjemi (IHC) metoder. Viktig, siden hver biosample tatt fra pasienter representerer en invasiv prosedyre på minst et visst nivå, maksimerer denne protokollen det nyttige materialet fra hver prøve ved også å isolere plasma som kan brukes til cytokinanalyser, metabolomiske studier eller ctDNA-sekvensering.
Analysen av perifere biomarkører i onkologiforsøk er en av de mange bruksområdene til PBMC-lysater. Et eksempel er evalueringen av DNA-skaderesponsen (DDR) i behandlinger som kjemoterapi, strålebehandling eller bruk av inhibitorer av enzymer involvert i DDR som fosfatidylinositol-3 kinase-relaterte kinaser (PIKKs)7 og PARPs3,13. Målet med disse behandlingene er å øke DNA-skaden i spredningsceller, noe som genererer høy toksisitet i celler med svekkede DDR-mekanismer og cellesykluskontrollpunkter, for eksempel kreftceller. Her presenterer vi et eksempel med en studie av DDR biomarkører i perifert blod utsatt for røntgenstråler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

Analyse av biomarkører i perifert blod blir stadig viktigere i kliniske studier for å etablere bevis på mekanisme for å evaluere effekter av behandling, og bidra til å veilede dose og tidsplaninnstilling av terapeutiske behandlinger. Fra en enkelt blodprøve kan perifere mononukleære celler i blodet isoleres og behandles for å analysere og kvantifisere proteinmarkører, og plasmaprøver kan brukes til analyse av sirkulerende tumor-DNA, cytokiner og plasmametabolomikk. Langsgående prøver fra en behandling gir informasjon om utviklingen av en gitt proteinmarkør, pasientens mutasjonsstatus og immunologiske landskap. Dette kan bare oppnås hvis behandlingen av perifert blod utføres effektivt på kliniske steder og prøver er riktig bevart fra sengekanten til benken. Her presenterer vi en optimalisert generell protokoll som kan implementeres på kliniske steder for å skaffe PBMC-pellets- og plasmaprøver i kliniske studier med flere sentre, som vil gjøre det mulig for kliniske fagfolk i sykehuslaboratorier å gi prøver av høy kvalitet, uavhengig av deres nivå av teknisk ekspertise. Det presenteres også alternative protokollvariasjoner som er optimalisert for mer spesifikke nedstrøms analysemetoder. Vi bruker denne protokollen for å studere proteinbiomarkører mot DNA-skaderespons (DDR) på røntgenbestrålet blod for å demonstrere egnetheten av tilnærmingen i onkologiinnstillinger der DDR-legemidler og / eller strålebehandling har blitt praktisert, så vel som i prekliniske stadier der mekanistisk hypotesetesting er nødvendig.

For å forbedre kvaliteten på PBMC-preparater i våre kliniske studier, har vi generert en protokoll med konsise, klare trinn som kan følges av sykehuslaboratorier, uavhengig av deres molekylærbiologiske bakgrunn og laboratorieferdigheter. Vi har tilpasset produsentens protokoll med modifikasjoner på de trinnene der utførelsesproblemer er identifisert eller rapportert fra kliniske steder involvert i ulike kliniske studier på flere sentre. Protokollen kan imidlertid optimaliseres ytterligere for å oppfylle spesifikke krav, for eksempel tidsbegrensninger på det kliniske stedet eller typen nedstrømsanalyser (se Tilleggsfil). Vi viser at DDR kan analyseres i PBMCer ved å se på spesifikke biomarkører på DNA-skade generert av stråling.
De vanligste spørsmålene vi har mottatt fra kliniske steder er relatert til sentrifugeringstrinnene, som direkte påvirker å kunne isolere PBMCer og få den endelige PBMC-pelletsen. Ved hjelp av riktig type utsvingshoderotor sentrifuge (Figur 1B,C) er nøkkelen til suksessen til protokollen. Men når bare en fastvinklet rotor sentrifuge er tilgjengelig på det kliniske stedet, foreslår vi at du utfører trinn 2.4 i en fastvinklet rotor ved samme RCF som for en utsvingende hoderotor, men i bare 10 minutter. Dette sikrer at et PBMC-lag skilles fra plasmaet (se figur 2B, C). Mens lagdeling av blod på et tetthetsgradientsseparasjonsmedium krever en bremsesentriugasjon, kan blod i mononukleære celleforberedelsesrør sentrifugeres med bremser på grunn av tilstedeværelsen av en gelbarriere i røret som sikrer bevaring av PBMC-laget skilt fra tettere blodkomponenter27,28.
Minst 4 ml av høy kvalitet, ikke-fortynnet plasma ble oppnådd fra sentrifugering av blod i 8 ml rørformat, som kan avklares ytterligere for bruk i spesialiserte analyser som ctDNA sekvensering eller metabolomics studier29,30 (valgfrie trinn 4.1.1-4.1.4). Mengden isolerte PBMCer, størrelsen på pellets og hemolyse eller rød blodcelleforurensning har vært andre bekymringer som kommer fra kliniske steder og erfaring med å analysere prøver. Antall celler oppnådd fra 8 ml blod var variabelt avhengig av pasient- og sykdomsinnstillingen, men generelt er den oppnådde pellet liten i størrelse, og av gjennomsiktig / hvit farge (Figur 3A, B). På grunn av disse egenskapene er det viktig å visualisere pellet mot en mørk bakgrunn for å unngå utilsiktet aspirasjon under vasketrinnene (2,5 og 3,3). Noen ganger kan pellets ha litt rød farge på grunn av rød blodlegemeforurensning (Figur 3C), og dette har en negativ effekt på kvaliteten på preparatet. For å unngå å miste små pellets som de som er vist i figur 3, blir overføring av PBMC-pellet til en kryovial tilrettelagt av trinn 3.7 der PBMC-pelletsen resuspenderes i 50 μL PBS.
Det typiske utbyttet når du bruker disse rørene og blodet fra friske individer varierer mellom 7 til 21 x 106 celler for 8 ml, og en cellegjenoppretting mellom 70 og 80% som det er vår erfaring og som det tidligere har blitt vist27,28. Dette avhenger av både de enkelte celleantallene og operatoren, og det kan sammenlignes med cellenumrene og cellegjenopprettingsverdiene som oppnås ved hjelp av andre metoder ved hjelp av tetthetsgradient (inkludert systemer som bruker rør med en separasjonsbarriere)15,27,28. Et illustrerende eksempel på variasjonen på antall PBMCer isolert med denne metoden avhengig av sykdomsinnstilling er analysen av PBMC-markører hos kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) pasienter. Antall celler som ble gjenvunnet fra et 8 ml mononukleært celleforberedelsesrør ved påføring av denne protokollen varierte fra 1,62 x 104 til 1,99 x 109 i 45 prøver hentet fra 7 pasienter i studie NCT0332827331 (Tabell 1). En relatert parameter er proteinkonsentrasjonen av PBMC-lysatene oppnådd ved denne metoden, og dette avhenger av antall celler isolert og effektiviteten av proteinutvinningen. Cellepellets lysed i seksjon 6 ble generert med RIPA buffer og sonikering (trinn 6.6). Resuspensjonen av cellepellets i samme volum lysisbuffer resulterer vanligvis i en rekke konsentrasjoner fra 3 til 10 mg / ml, og i dette spesielle eksemplet var lysatekonsentrasjonene henholdsvis 6,8, 8,3 og 8,6 mg / ml for henholdsvis 0, 0,2 og 7 Gy. Dette utsettes imidlertid for høy variasjon ved mottak av prøver fra kliniske steder som ikke er optimalt forberedt, pasientens sykdom og tilstedeværelsen av hemoglobin fra forurensning av røde blodlegemer. For eksempel må svært små pellets resuspenderes i et volum lysisbuffer større enn cellepelletvolumet for å tillate både proteinkonsentrasjonsmåling og nedstrøms biomarkøranalyse, noe som resulterer i mer fortynnede prøver. I slike tilfeller, hvis en prøvekonsentrasjon er under 1 mg / ml, kan dette utgjøre en utfordring for å utføre analyser som vestlig blot på grunn av denne høye fortynningsfaktoren. I CLL-prøvene som tidligere ble nevnt, varierte derimot volumet av lysisbuffer som ble tilsatt for å resuspendere cellepellets fra 50 til 500 μL, og proteinkonsentrasjonen strakte seg fra 1,62 til 19,77 mg/ml (tabell 1).
Når prøver presenterer rød blodcelleforurensning eller hemolyse (figur 3C), blir proteinkonsentrasjonen av PBMC-lysatet overvurdert på grunn av inkludering av hemoglobin fra erytrocyttene. Dette er grunnen til at man bør gjøre en visuell inspeksjon og merknad av slike prøver, som beskrevet i trinn 6.7 i protokollen. Lasteprøve i overkant kan kompensere for tilstedeværelsen av hemoglobin når du utfører biomarkøranalyse så langt som en lastekontroll er inkludert i analysen. Andre mer kvantitative metoder for å måle hemolyse kan implementeres, for eksempel å måle absorbans ved 414 nm32.
DDR ble analysert i PBMCer oppnådd etter denne kliniske protokollen. For å illustrere en situasjon som etterligner DNA-skadelige kliniske behandlinger som strålebehandling eller kjemoterapi, ble fullblod fra friske frivillige eks vivo utsatt for røntgenstråling (figur 4A). Ioniserende stråling (IR) som røntgenstråler induserer ulike typer DNA-skader, inkludert DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB). DNA-skaderegistrering av disse lesjonene aktiverer PIKK-er som ataksi-telangiectasia mutert (ATM), ATM og Rad3-relatert (ATR) og DNA-avhengig proteinkinase (DNA-PK), som engasjerer DNA-reparasjonsmekanismer som homolog rekombinasjon (HR) eller ikke-homolog sluttkobling (NHEJ). Aktivering av minibank ved tilstedeværelse av DSBer skjer ved rekruttering til skadesteder av MRN -komplekset (MRE11-RAD50-NBS1), noe som forårsaker ATM autofosforylering ved flere rester, inkludert Ser1981. I sin tur, aktivert ATM fosforylater komponentene i MRN-komplekset og andre proteiner som histone variant H2AX på Ser139 (hvor pSer139-H2AX er også kjent som γH2AX) for å fremme en strukturell endring i kromatin som spenner fra DSB som letter rekrutteringen av andre DDR-faktorer33. PBMCer reagerer på ioniserende stråling til tross for at deres lave spredningshastighet og massespektrometrimetoder har tillatt kvantifisering av oppreguleringen av fosforylatert Ser635 på RAD50 ved ATM. Denne fosforylering er redusert i nærvær av ATM-hemmere og RAD50 pS635 har blitt ytterligere validert som en farmakodynamisk biomarkør for kliniske ATM-hemmerbehandlinger i svulster ved immunhiistokjemi8. For å evaluere responsen fra PBOC på stråling ble blod fra friske frivillige utsatt for forskjellige IR-doser og prøver ble samlet inn etter en 1 h inkubasjon ved 37 °C (figur 4A). Til dette formål ble blod overført til plastrør for å unngå å redusere utbyttet av PBMC-isolasjonen på grunn av høy temperatur (trinn 6.2). Vi analyserte hvordan minibank ble aktivert ikke bare ved å se på den tidligere rapporterte RAD50 pS635, men også ATM pS1981 og γH2AX. I de tre tilfellene ble det observert en økning i disse postoversettelsesendringene ved høyere IR-doser (figur 4B). Interessant nok var fosforylering av minibank og RAD50 betydelig ved den lave dosen på 0,2 Gy, noe som antyder at disse postoversettelsesendringene kan bli forhørt som PD-biomarkører for behandlinger som involverer generering av DNA-DSBer med et godt dynamisk område, ikke bare i tumorprøver, men i perifert blod. Dette gjør det mulig å overvåke PD-responsen på behandlingen ved å anskaffe langsgående prøver gjennom behandlingsforløpet. Tidspunktet fra blodtrekningen til behandlingen av prøvene er avgjørende for å sikre at disse signalkaskadene fortsatt er aktive, da forsinkelser i behandlingen vil påvirke kinetikken til slike kaskader, og man kan gå glipp av fosforyleringshendelsene som brukes som fosfomarkører.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> Figur 4: PBMCer isolert fra eks vivo bestrålet blod etter den nåværende kliniske protokollen viser biomarkører for å informere om omfanget av DNA-skaden forårsaket av behandlingen. (A) Skjematisk oversikt over protokollen for fremstilling av PBMCer og analyse av DDR ved helblodsbestråling. *2 ekstra sentrifugeringstrinn som kreves for ctDNA-analyse/metabolomikk. (B) Vestlig flekk som viser doseavhengig oppregulering av DDR fosfo-biomarkører i PBMCer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Eksempel</td>
			<td>Antall PBMCer/ 8 ml blod</td>
			<td>Ekstra RIPA-buffervolum (μL)</td>
			<td>Endelig konsentrasjon (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Langsgående PBMC-prøver tilsvarende 7 pasienter</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Cellenummer og proteinkonsentrasjon av PBMC-pellets fra kroniske lymfocytiske leukemipasienter (CLL). Dataene som presenteres i denne tabellen tilsvarer 45 PBMC-prøver fra 7 CLL-pasienter som deltar i studien NCT03328273 samlet inn i mononukleære celleforberedelsesrør. Dette er opprinnelige data generert ved hjelp av prøver fra den siterte studien31.
Tilleggsfil: Alternative protokollalternativer. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Denne protokollen beskriver klinisk implementerbar fremstilling av PBMC- og plasma-biosampler av høy kvalitet på det kliniske studiestedet som kan brukes til translasjonell biomarkøranalyse.

Fremstilling av perifert blod mononukleære cellepellets og plasma fra en enkelt blodprøve på kliniske prøvesteder for biomarkøranalyse

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

PBMC- og plasmaprøver er enkle å skaffe og svært informative i tidlig klinisk utvikling. Denne robuste protokollen minimerer den preanalytiske variasjonen som introduseres på kliniske steder. Denne protokollen er rask og enkel, og krever grunnleggende laboratorieutstyr og minimal operatørkompetanse for å behandle blodet i PBMCer og plasma.Den er kompatibel med travle laboratoriedager på sykehus. Nedstrømsanalyse av blodkomponenter som følge av denne protokollen kan informere farmakokinetiske og farmakodynamiske relasjoner, narkotikadoseplanlegging og bevis på målengasjement og gi innsikt i narkotikamekanismer for handling, som støtter både sanntids- og introspektive analyser. Vi bruker denne protokollen for onkologistudier, spesielt for å analysere DNA-skaderesponsmekanismer.Materialer samlet inn av denne protokollen kan imidlertid være relevante på tvers av mange sykdomsområder og flere terapeutiske modaliteter. Etter å ha mottatt åtte milliliter donorblod per prøve, registrer tidspunktet da blodet ble trukket og inverter forsiktig hvert rør åtte til 10 ganger før du overfører antikoagulantbehandlede blodprøver til hvert av rørene merket for stråling. For kliniske prøver, sentrifuger rørene rett etter invertering av dem.Plasser de 0,2 grå rørene i et forhåndsvarmet røntgenskap, lukk døren og påfør en 0,2 grå dose på rørene. Bytt ut de lavdosebestrålede rørene med de syv grå rørene og juster dosen for å påføre en syvgrå strålingsdose på høydosebestrålingsprøvene. Etter at begge prøvene har blitt bestrålet, inkuberer du alle tre rørene ved 37 grader Celsius i en time.Overfør prøvene til celleforberedelsesrør før du skiller cellene med høyhastighets sentrifugering, og sørg for å stille inn enhetene som x g eller tilsvarende RCF. Etter sentrifugeringen, se rørene mot en mørk bakgrunn for å identifisere plasma, rød blodlegeme og buffy frakklag. Bruk en serologisk pipette, overfør omtrent halvparten av plasmaet til en merket 15 milliliter konisk sentrifuge uten å forstyrre det buffy frakklaget og lagre plasmarøret på våt is.Bruk deretter en beitepipette for å overføre hele PBMC som inneholder buffy coat-lag til et nytt 15 milliliterrør og legg til romtemperatur PBS til PBMC til et endelig volum på 15 milliliter per prøve. Bland cellene forsiktig ved inversjon fem ganger og samle cellene ved sentrifugering med lavere hastighet, og sørg for å sjekke sentrifugeringsenhetene. Aspirer alle unntatt de siste 500 mikroliterne av supernatant uten å forstyrre pelletsene.Tilsett fersk PBS til et sluttvolum på 10 milliliter til hvert rør og resuspend ved å forsiktig invertere rørene. Bruk 40 mikroliter aliquots av cellene for telling. Etter telling, samle cellene med en annen sentrifugering og fjern så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pelletsene.For å lagre PBMC for senere behandling, resuspend pellets i 50 mikroliter frisk PBS per prøve med skånsom pipettering og overføre hver hele celle suspensjon til en merket 1,5 milliliter kryolys på våt is. Deretter blinker du fryse cellene ved den foretrukne metoden og plasserer dem i en fryseboks ved minus 80 grader. Registrer tidspunktet da cellene ble frosset.Alternativt kan du bruke pelletsene på nytt i en milliliter eller fryseblanding per prøve og overføre cellesuspensjonene til individuelle merkede kryolegemer. Legg deretter rørene og forhåndskjølte frysebokser for minus 80 grader Celsius-lagring. For å fryse plasmaet, legg til opptil en milliliter aliquots mye av plasmaet til opptil hver av fem to milliliter mikrorør uten å forstyrre gjenværende pellets og registrere det totale volumet av plasma i hvert rør.Deretter fryser du umiddelbart plasma aliquots i oppreist orientering i en minus 80 grader Celsius fryser. For vestlig blotanalyse av prøvene, resuspend pellet i hvert rør med et passende volum lysis buffer supplert med protease og fosfatasehemmere lik den av cellepelletsvolumet med skånsom pipettering og inkubere celleprøvene i 10 minutter på is. På slutten av inkubasjonen overfører du prøvene til 1,5 milliliter rør og sonikerer dem med tre 30 sekunder på 30 sekunder av sykluser ved fire grader Celsius.Samle prøvene ved sentrifugering og overfør supernatantene til nye 1,5 milliliterrør. Bland deretter 40 mikrogram per prøve med lastebuffer og kok prøvene i fem minutter. Last inn 20 mikrogram av hver prøve per bane i duplikat i en 4-12% Bis-Tris proteingel og kjør en SDS-PAGE.Antall celler oppnådd fra åtte milliliter blod varierer i henhold til pasient- og sykdomsinnstillingen. Generelt er cellepelletet lite i størrelse og gjennomsiktig hvitt i farge. Noen ganger kan pelletsene ha litt rød blodlegemeforurensning, noe som har en negativ effekt på kvaliteten på preparatet.Et typisk utbytte fra en kronisk lymfocytisk leukemipasient som bruker denne protokollen varierer fra 1,62 ganger 10 til fjerde til 1,99 ganger 10 til niende celler per åtte milliliter mononukleær cellepreparat med en endelig proteinkonsentrasjon som varierer mellom 1,62 og 19,77 milligram per milliliter. I denne representative analysen av tre pasientprøver ble det observert en økning i postoversettelsesendringer ved høyere ioniserende stråledoser. Interessant nok var fosforyleringen av ataksi-telangiectasia mutert og RAD50 betydelig ved den lave dosen på 0,2 gråtoner, noe som antyder at disse postoversettelsesendringene kan bli feasibly forhørt som farmakodynamiske biomarkører for behandlinger som involverer generering av DNA dobbeltstrengsbrudd med et godt dynamisk område i svulst, samt perifere blodprøver.For et optimalt prøvepreparering, behandle blodet innen en time etter innsamling ved romtemperatur, sentrifuger prøvene riktig, og se røret mot den mørke bakgrunnen for å kunne skille den buffy kappen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Rapid fraksjonering og isolering av Whole Blood komponenter i prøver tatt fra en fellesskapsbasert Setting

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Implantasjon og Peripheral Immune Cell Monitoring i II-45 syngeniske Rat Mesothelioma Model

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro- analyser for å vurdere blod-hjernebarriere Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Gjentatt blod samling fra halen fotsporene til ikke-Anesthetized rotter med vakuum blod samling System

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Rutine Screening metode for Microparticles i blodplater blodoverføringer

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analyse av mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner av glatt muskel celle avstamning-Tracing mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidige Flow analytiske karakterisering av flere celletyper Hentet fra mus Brain/ryggmarg gjennom ulike homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Overvåking av PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

Evaluering av en point-of-care testing analysator for måling av perifert blod leukocytter

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Repeterende blodprøvetaking fra den subklaviske venen hos bevisst rotte

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...