Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a todos os membros da Translational Medicine da AstraZeneca Oncology Research and Early Development por seu feedback sobre o protocolo, especialmente Hedley Carr, Tammie Yeh e Nathan Standifer por conselhos sobre a preparação do plasma para análise de CTDNA, sobre o isolamento do PBMC e criopreservação e imunofenofoteping da PBMC, respectivamente.

O consentimento informado do paciente e o cumprimento integral dos requisitos de ética nacional relevantes em cada jurisdição, por exemplo, a Lei de Tecidos Humanos (HTA – Reino Unido, 2004) e a Lei de Portabilidade e Responsabilização de Seguros de Saúde (HIPAA – Estados Unidos, 1996) são obrigatórias. Certifique-se de ter plena aprovação ética documentada antes de iniciar qualquer trabalho sobre materiais derivados do homem. O sangue utilizado na otimização deste protocolo foi fornecido com o consentimento adequado do Volunteers Advanceing Medicine Panel (VAMP) (referência ética 16/EE/0459, estudo CRF494, subsarto 001) executado pelo NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Reino Unido, sob um acordo de fornecimento de amostras biológicas humanas com o National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. O AstraZeneca Biobank no Reino Unido é licenciado pela Human Tissue Authority (Licença nº 12109) e tem aprovação do National Research Ethics Service Committee (NREC) como um Banco de Tecidos de Pesquisa (RTB) (REC No 17/NW/0207).
1. Orientação geral de preparação
NOTA: Todo o trabalho com material humano não fixado, como o sangue, plasma e PBMCs neste protocolo, deve operar sob a suposição de que esses materiais podem transportar agentes potencialmente infecciosos e, portanto, devem ser realizados sob precauções adequadas de biossegurança. Para pacientes que foram testados como negativos para patógenos conhecidos, não assuma que as amostras não são infecciosas e, portanto, precauções de segurança adequadas ainda devem ser aplicadas. Os resíduos gerados a partir desses materiais devem ser tratados com as mesmas precauções de biossegurança e descartados de acordo com as regras locais.
<ol><li>Escolha entre os dois tipos de tubos de preparação de células mononucleares que utilizam citrato de sódio ou heparina de sódio como anticoagulantes. Para muitas aplicações a jusante, esses dois anticoagulantes podem ser usados de forma intercambiável, mas ambos os anticoagulantes devem ser testados antes de selecionar um para o teste.</li>
	<li>Rotule um tubo de preparação de célula mononuclear de 8 mL a ser usado para a coleta de sangue com o ID codificado do paciente. Mantenha os tubos à temperatura ambiente (18-25 °C).</li>
	<li>Armazene 1x PBS à temperatura ambiente (18-25 °C). Use 30 mL por preparação.</li>
	<li>Certifique-se de que os tubos para amostras de plasma separadas e o criovial para a amostra PBMC sejam rotulados com precisão com identificadores exclusivos, conforme especificado na seção apropriada do manual de laboratório.</li>
	<li>Se os PBMCs forem usados para monitorar proteínas fosfoiladas, prepare o PBS complementado com inibidores de fosfatase: misture 5 mL de PBS com 50 μL de coquetel inibidor de fosfatose 2 + 50 μL de coquetel inibidor de fosfatase 3. Prepare-se fresco e mantenha no gelo até o uso.</li>
	<li>Se os PBMCs forem criopreservados, prepare a mistura de congelamento de 1 mL por amostra misturando 90% de FBS + 10% DMSO.</li>
</ol>2. Coleção PBMC (Figura 1A)
<ol><li>Desenhe 8 mL de sangue no tubo de preparação de células mononucleares usando a técnica padrão descrita pelo fabricante. Inverta o tubo suavemente 8 a 10 vezes para misturar o aditivo anticoagulante com sangue. Não se agite para evitar hemólise. Regissou o tempo em que o sangue foi retirado.</li>
	<li>Após a coleta, armazene o tubo ereto à temperatura ambiente até a centrifugação. Processe as amostras o mais rápido possível, idealmente dentro de uma hora dessa coleta de sangue, mas não mais tarde do que 4h de coleta pós. Regissuça o tempo ao iniciar o processamento do sangue.</li>
	<li>Imediatamente antes da centrifugação remixar a amostra de sangue invertendo suavemente o tubo 8 a 10 vezes mais.</li>
	<li>Centrifugar os tubos de amostra de tubo/sangue em um rotor horizontal (cabeça de balanço) a 1.500 – 1.800 x g por 30 min à temperatura ambiente (18-25 °C). Certifique-se de que todos os tubos estejam equilibrados corretamente.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo e imagens representativas da centrífuga. (A) Visão geral esquemática do protocolo para a preparação de PBMCs e plasma. *Se houver restrições de tempo, a etapa 2.4 pode ser reduzida para 20 minutos e as etapas 3.3 a 3.6 podem ser removidas. ** Tome uma alíquota para contar células, se necessário. 2 etapas extras de centrifugação necessárias para a análise ctDNA/metabolômica (B) imagem de uma centrífuga de rotor de cabeça swing-out definida para a etapa 2.4. (C) Imagem do rotor, que inclui dois baldes contendo os adaptadores para girar tubos de preparação de células mononucleares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NOTA: x g (também referido como RCF, unidades centrífugas relativas) e RPM (revoluções por minuto) são unidades diferentes. Certifique-se de definir a centrífuga para x g (RCF). Use a calculadora online (ver Tabela de Materiais) para a conversão. Se estiver disponível apenas rotor de ângulo fixo, execute esta etapa por 10 min a 1.500 – 1.800 x g.
<ol start="5"><li>Após a centrifugação, verifique a presença de uma camada vermelha escura sob a barreira (contendo principalmente glóbulos vermelhos) e 2 camadas acima da barreira. A camada superior é o plasma (cor de palha) e a camada esbranquiçada por baixo é o casaco buffy contendo os PBMCs. Essas camadas podem ser facilmente distinguidas ao visualizar o tubo contra um fundo escuro/preto.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg"> Figura 2: Tubos para isolar PBMCs. (A) Imagem dos tubos antes da centrifugação (passo 2.4), vazia (esquerda) ou contendo sangue (direita). (B) Separação bem sucedida da camada PBMC após centrifugação (etapa 2.5). (C) Imagem da camada PBMC após centrifugação e um pouco de plasma deixado para garantir que todos os PBMCs sejam coletados (etapa 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NOTA: Se essas camadas não estiverem visíveis, isso provavelmente indicará um erro na configuração das unidades de centrifugação. Certifique-se de que o adaptador de centrífuga certo é usado e o "x g" correto está definido. Repita o passo 2.4.
<ol start="6"><li>Imediatamente após a centrifugação, use uma pipeta sorológica para transferir aproximadamente metade do plasma para um tubo de centrífuga de tamanho cônico de 15 mL com tampa, tomando o cuidado de não perturbar a camada PBMC (aproximadamente 4-5 mL). Armazene temporariamente este tubo com plasma em gelo molhado para ser usado mais tarde na etapa 4. Reserve por enquanto.</li>
	<li>Colete toda a camada PBMC com uma pipeta Pasteur colocando a pipeta dentro da camada de células e transfira para um tubo de centrífuga cônico de tamanho diferente de 15 mL com tampa. É aceitável também tomar uma pequena quantidade de plasma, se necessário, para obter completamente toda a camada PBMC. O volume geralmente é de 1-2 mL. Imediatamente continue com o passo 3 abaixo.</li>
</ol>3. Etapas de lavagem do PBMC
NOTA: O objetivo das etapas de lavagem é diluir e remover plaquetas residuais e plasma da pelota PBMC. Todas as etapas de centrifugação devem ser realizadas à temperatura ambiente (18-25 °C).
<ol><li>Adicione PBS de temperatura ambiente ao tubo PBMC para levar o volume a 15 mL. Tampa o tubo. Misture as células invertendo suavemente o tubo 5 vezes.</li>
	<li>Centrífuga por 15 min a 300 x g. Note que esta é uma centrifugação muito mais suave do que a centrifugação inicial.</li>
	<li>Visualize a pelota visualizando o tubo contra um fundo escuro/preto. Remova o supernatante por aspiração a vácuo ou com uma pipeta(Figura 3A). Descarte o supernatante deixando um volume de aproximadamente 500 μL acima da pelota PBMC colorida esbranquiçada.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg"> Figura 3: Pelotas PBMC. (A) Pelota obtida na primeira etapa de lavagem 3.3. (B) Pelota isolada na segunda lavagem (passo 3.7). (C) Pelota com alto nível de hemólise obtida a partir de sangue processado mais de 4h a partir da coleta de sangue isolada na segunda lavagem (passo 3.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="4"><li>Resuspenque a pelota da célula, encanar suavemente para cima e para baixo no supernatante residual.</li>
	<li>Adicione 1x PBS adicionais para levar o volume a 10 mL. Tampa o tubo. Misture as células invertendo o tubo suavemente 5x. Se a contagem de células for necessária no protocolo de estudo vá para a etapa 3.5.1, se não for necessário mover-se diretamente para a etapa 3.6.<ol>
<li>Pegue uma alíquota de 40 μL das células re-suspensas e misture com 40 μL de azul trypan. Conte as células viáveis usando um hemócito ou um contador automático de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a suspensão da etapa 3.5 por 10 min a 300 x g. Remova o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Remova e descarte cuidadosamente qualquer supernascer restante acima da pelota celular através de pipetização usando uma pipeta pasteur fina ou uma micropipette sem perturbar a pelota celular. Deixe pouco ou nenhum líquido acima da pelota depois de completar esta etapa. Se o ponto final deste protocolo for uma pelota PBMC mover-se para a etapa 3.8; se o ponto final for criopreservado PBMCs vão para o passo 3.10.</li>
	<li>Adicione 50 μL de novo PBS (ou o PBS suplementado preparado na etapa 1.5 se aplicável ao seu ponto final) à pelota e pipeta para cima e para baixo suavemente usando uma micropipette para resuspensar de forma homogênea todas as células. Transfira toda a suspensão celular para um criovial de 1,5 mL rotulado e coloque imediatamente em gelo molhado até congelar as amostras.</li>
	<li>Congele as amostras rotuladas colocando-as em nitrogênio líquido ou diretamente em gelo seco. As células também podem ser congeladas no congelador de -80 °C usando caixas de congelamento celular. Neste caso, prechill as caixas completamente em -80 °C antes de adicionar os tubos de célula. Registo o tempo em que as pelotas de célula foram congeladas. Uma vez que as células congelem, armazene a -80 °C, navio congelado em gelo seco.</li>
	<li>Opcionalmente, para criopreservar os PBMCs suspender a pelota em 1 mL da mistura de congelamento (passo 1.6) e transferir para um criovial rotulado. Continue como descrito na etapa 3.9, mas, neste caso, só é aceitável usar caixas de congelamento celular para congelar as amostras. Transfira para nitrogênio líquido para envio e armazenamento depois de estar na caixa de congelamento por um mínimo de 24 horas.</li>
</ol>4. Etapas de preparação de plasma(Figura 1A)
<ol><li>Após -80 °C de armazenamento das pelotas PBMC, agora prepare a alíquota de plasma que foi temporariamente armazenada em gelo molhado na etapa 2.6. Realize as seguintes etapas de centrifugação para esclarecer o plasma se o propósito da amostra for a análise ctDNA, de outra forma mover-se diretamente para a etapa 4.2.<ol>
<li>Centrifugar o plasma por 10 minutos a 1.600 - 2.000 x g a 4 - 8 °C em um rotor de ângulo fixo (ou 15 min em um rotor swing-out).</li>
		<li>Pipeta cuidadosamente fora do supernasce de plasma, tomando cuidado para não perturbar qualquer pelota e transferir para um novo tubo de 15 mL. Descarte o tubo que contém o material pelleted.</li>
		<li>Centrifugar o plasma por 10 minutos a 1.600 - 2.000 x g a 4 - 8 °C em um rotor de ângulo fixo (ou 15 min em um rotor swing-out).</li>
		<li>Transfira cuidadosamente o supernasce de plasma para um novo tubo de 15 mL, com certeza não perturbará nenhum material pelleted. Descarte o tubo que contém o material pelleted. NOTA: Se uma centrífuga refrigerada não estiver disponível, mantenha as células no gelo por 5 minutos entre cada giro ou amostras de centrífuga em uma sala fria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira plasma em alíquotas de 1 mL em 5 microtubos frescos de 2 mL. Use menos de 5 frascos se não houver plasma suficiente para encher 5 frascos com alíquotas de 1 mL e espera-se que o último frasco contenha menos de 1 mL de plasma. Se houver mais de 5 mL de plasma, descarte o restante. Regisso volume total de plasma em cada tubo.</li>
	<li>Congele imediatamente as alíquotas de plasma ereto, armazenando-as a -80 °C.</li>
</ol>5. Envio de amostras
<ol><li>Envie as balas PBMC e amostras de plasma em gelo seco.</li>
	<li>Certifique-se de que a amostra não está descongelada antes e durante o embarque. Embale gelo seco suficiente com as amostras para garantir que elas permaneçam congeladas durante todo o processo de transporte, considerando possíveis atrasos que possam ocorrer no trânsito.</li>
</ol>6. Irradiação sanguínea total e análise de manchas ocidentais de biomarcadores DDR(Figura 4A)
NOTA: Trata-se de um tratamento ex vivo que não será exigido na maioria dos casos na clínica, mas esses experimentos são uma valiosa estratégia exploratória para encontrar biomarcadores clínicos adequados. As amostras de sangue devem ser tratadas o mais rápido possível após a coleta para garantir melhores resultados.
<ol><li>Aqueça o armário de raios-X. Rotule três tubos de 15 mL como 0, 0,2 e 7 Gy, respectivamente.</li>
	<li>Tome três tubos de preparação de células mononucleares contendo sangue recém-extraído de um único indivíduo e depois de inverter suavemente os tubos 8 a 10 vezes transfira os sangues para os três tubos de 15 mL.</li>
	<li>Coloque o tubo 0.2 Gy no armário de raios-X, feche a porta e aplique 0,2 dose gy no tubo selecionando o número e a dose da prateleira. Aplique 7 dose de radiação gy no tubo 7 Gy ajustando a dose selecionada no gabinete.</li>
	<li>Incubar os três tubos a 37 °C durante uma hora.</li>
	<li>Transfira o sangue de volta para os tubos de preparação da célula mononuclear e realize o protocolo de preparação do PBMC para um ajuste clínico da etapa 2.4 para a etapa 3.8.</li>
	<li>Adicione um volume de tampão de lise suplementado com inibidores de protease e fosfatase iguais ao volume de pelotas celulares (neste caso 70 μL de tampão RIPA) a cada uma das pelotas celulares, pipeta para cima e para baixo e incubar no gelo por 10 minutos. Sonicar as amostras se um sônico estiver disponível (3 ciclos, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), alternativamente seringa as amostras para quebrar os ácidos nucleicos para eliminar a viscosidade na amostra.</li>
	<li>Centrifugar as amostras por 10 minutos a ≥ 15.000 x g,a 4 °C. Transfira cada supernante para um novo tubo de 1,5 mL, avalie qualitativamente o nível de hemólise (inspeção visual) e meça a concentração de proteína por qualquer método preferido.</li>
	<li>Misture 40 μg de lise total com tampão de carga de amostra contendo SDS e agente redutor de amostras. Ferva amostras por 5 minutos em um bloco de calor.</li>
	<li>Carregue 20 μg de cada amostra por faixa em duplicata em um gel de proteína bis-tris de 4-12% e execute um SDS-PAGE.</li>
	<li>Após a separação, transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose utilizando um sistema comercialmente disponível (20 V, 10 min) e bloqueie com 5 % de leite em TBST.</li>
	<li>Corte a membrana nos tamanhos moleculares relevantes e incubar com os anticorpos primários durante a noite a 4 °C (ver Tabela de Materiais para anticorpos e diluições).</li>
	<li>Remova os anticorpos primários e lave as membranas 3 vezes com TBST por 5 minutos à temperatura ambiente. Incubar com os anticorpos secundários conjugados pelo HRP por 45 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave 3 vezes com TBST por 5 min.</li>
	<li>Aplique o reagente ECL e analise as imagens obtidas em relação ao sinal HRP.</li>
</ol>

Todos os autores são ou eram funcionários e detentores de participações da AstraZeneca. A VM é funcionária da Acerta Pharma, dona de ações da AstraZeneca e da Gilead Sciences.

Preparações de alta qualidade de PBMCs e plasma que podem ser robustamente e reproduzivelmente preparados em locais de ensaio clínico são inestimáveis para informar o ensaio clínico periférico preditivo e farmacodinâmico pontos finais biomarcadores translacionais. Aqui fornecemos um protocolo curto e claro que aborda as etapas tipicamente problemáticas que até então eram vulneráveis a erros de execução em um cenário de ensaio clínico. No entanto, o protocolo pode ser otimizado para atender a requisitos específicos, como restrições de tempo no local clínico ou tipo de análises a jusante (ver Arquivo Suplementar).
Para este objetivo, mostramos como isolar tanto os PBMCs quanto o plasma do sangue inteiro usando tubos de preparação de células mononucleares para produzir pelotas PBMC congeladas e plasma congelado adequado para uma variedade de análises a jusante. Chamamos a atenção para etapas de protocolo particularmente críticas envolvendo centrifugação e identificação da camada PBMC na etapa 2.5, e pelotas PBMC nas etapas 3.3 e 3.6. Historicamente, onde os locais clínicos muitas vezes deram errado é na definição da centrífuga para as unidades corretas (confundindo um valor RCF ou x g com um valor RPM), atrasando o processamento de amostras de sangue, temperatura e a presença de grandes volumes de PBS acima da pelota celular congelada. Na maioria dos rotores de centrífugas, digitar erroneamente um valor x g como uma configuração RPM resultará em uma subcrifugação significativa com uma camada PBMC mal definida ou ausente, e potencial descarte de PBMC inadvertido durante as etapas de lavagem devido à pelotização celular ineficiente. No entanto, existe a possibilidade de que uma camada PBMC não seja visível, apesar de usar as configurações de centrifugação corretas e adaptador de rotor se o paciente tiver desenvolvido leucopenia. Essa condição pode afetar pacientes matriculados em ensaios oncológicos por causa de quimioterapia ou radioterapia e deve ser considerada. Outro ponto crítico que ficou claro no protocolo é que as amostras devem ser processadas dentro de 1-2 h a partir da coleta de sangue para diminuir a possibilidade de hemólise impactar negativamente o protocolo. Além disso, o objetivo de processar as amostras durante a primeira hora do exame de sangue reduz a variabilidade ex vivo, o que pode ter um grande impacto nas leituras farmacocinéticas e nos biomarcadores afetados pela preservação do sangue ou vias de sinalização ativa, como o caso mostrado na Figura 4. Atrasos no processamento da amostra também podem ter um efeito prejudicial na viabilidade celular se as células forem criopreservadas34. Outro fator que pode afetar tanto o rendimento quanto a contaminação dos glóbulos vermelhos é a temperatura de armazenamento e centrifugação, que deve ser mantida à temperatura ambiente (18-25 °C). Temperaturas mais baixas aumentam a densidade do meio gradiente de densidade, o que resulta em um maior grau de contaminação de glóbulos vermelhos e granulocitos, pois essas células não se agregam tão bem. Por outro lado, temperaturas mais altas levam a PBMCs presos entre os eritrócitos agregados, reduzindo assim o rendimento da preparação15,27,28. E, finalmente, é crucial que não mais do que 50-100 μL de líquido estejam presentes com a pelota celular no criovial, pois isso impacta negativamente a concentração de quaisquer lisatos proteicos obtidos no processamento a jusante dessas preparações do PBMC. Um excesso de líquido irá sobredilute amostras, levando a lises com concentração de proteína muito baixa não adequada para análise biomarcadora. Além disso, a preservação de quaisquer modificações pós-translacionais será prejudicada, e a eficiência da lise também será muito reduzida.
Os tubos de preparação de células mononucleares foram escolhidos, pois oferecem a maneira mais simples de isolar tanto os PBMCs quanto o plasma em uma única coleta de sangue para ensaios clínicos com, em nossa experiência, excelente reprodutibilidade. O processamento sanguíneo não requer operadores altamente treinados, e o uso de um único tubo remove a necessidade de diluir o sangue e sua transferência para um tubo diferente, diminuindo o risco; encurta o protocolo devido à realização das etapas de centrifugação com freios ligados; e todos os reagentes estão no tubo, o que reduz a variabilidade. Em nossa experiência, esses benefícios superam o custo mais alto desses tubos quando comparados com outros métodos clássicos que compreendem apenas o uso de um gradiente de densidade médio27,28 (£ 410 por 60 unidades enquanto o meio linfoprep para 66 preparações de 50 mL é de R£ 215). Eles estão disponíveis em dois tipos de anticoagulantes, heparina e citrato, ambos comparáveis na manutenção da funcionalidade dos PBMCs isolados35, portanto, a escolha de um anticoagulante sobre o outro será baseada em possível influência de heparina ou citrato nos estudos de biomarcadores a jusante. Embora tenha sido demonstrado que os tubos EDTA fornecem o maior rendimento de isolamento pbmc em comparação com heparina ou citrato13, o benefício da facilidade de uso da manipulação de um tubo apenas contrabalança essa consideração. Se as citocinas forem analisadas anticoagulantes podem ter um efeito dos níveis detectados no plasma, portanto, ambos os anticoagulantes devem ser testados antes de selecionar um para o ensaio clínico36. Se o plasma for usado para estudos de metabolômica, usar heparina como anticoagulante seria preferido37. Portanto, o único ponto que resta para o usuário final ou o cientista translacional de ensaios clínicos é se citrato ou heparina será mais apropriado para seus propósitos uma vez que os custos tenham sido avaliados.
Embora os benefícios do uso de tubos de preparação celular sejam numerosos em comparação com as limitações que eles representam (maior custo e disponibilidade de uma gama restrita de anticoagulantes), a principal limitação do uso de PBMCs ou plasma para obter biomarcadores PD em ensaios clínicos, especialmente em oncologia, pode não estar relacionada ao método de isolamento. Exceto para cânceres hematológicos, onde o tumor é diretamente amostrado do sangue periférico, para outras indicações de câncer plasma e PBMCs são tecidos substitutos que não necessariamente imitam o tumor primário. O tecido periférico não pode compartilhar o genoma e o epigenome com o tumor primário, portanto, a análise periférica de biomarcadores dependentes de uma mutação tumoral específica é limitada principalmente à análise ctDNA (do plasma) ou CTCs (por triagem subsequente da camada PBMC). Além disso, sinalizar cascatas dirigindo ou contribuindo para a proliferação do tumor pode não ser tão ativo no sangue periférico. Esse desafio pode ser superado aplicando abordagens de descoberta de biomarcadores visando o sangue8 para identificar biomarcadores alternativos ou acoplamento de tratamentos ex vivo ao isolamento das preparações plasma38 e PBMC26.
No protocolo atual, as pelotas PBMC congeladas podem ser facilmente processadas fora do local clínico para dar lises proteicas que podem ser avaliadas por técnicas de manchas ocidentais ou ELISA. Métodos alternativos para o uso de PBMCs para habilitar métodos IHC também foram apresentados (Arquivo Suplementar). Além disso, também detalhamos a possibilidade de criopreservar PBMCs (ver Arquivo Suplementar)para monitoramento de células imunes, uma aplicação relevante em oncologia, com inibidores de checkpoint imunológico e ADCs cada vez mais testados em ensaios clínicos. A avaliação de funções imunológicas como ODCC16 e imunofenofoteping são aplicações compatíveis com PBMCs criopreservados isolados dos tubos de preparação de células mononucleares15. Há uma ressalva sobre a criopreservação, pois pode promover a regulação de certos marcadores superficiais e internos e pode prejudicar certas funções celulares, porém a criopreservação pbmc é a única maneira viável de realizar esses ensaios devido a restrições de tempo ao manusear amostras de múltiplos locais clínicos para o processamento em laboratórios externos14,15, e esses efeitos prejudiciais podem ser superados por bons métodos de descongelamento e períodos de descanso39.
Em conclusão, o protocolo aqui fornecido permitirá a preparação confiável de PBMCs e amostras de plasma em qualquer instituição clínica com equipamentos e materiais comuns para que os pontos finais translacionais do sangue periférico possam ser robustamente habilitados em ensaios clínicos globais.
Finalmente, demonstramos como a análise dos lysates do PBMC pode informar mecanicamente a resposta a agentes prejudiciais ao DNA, mostrando uma modificação pós-translacional dependente de dose dos principais fatores de DDR, que podem ser usados para ajudar a moldar o desenvolvimento clínico. Prospectiva, a implementação de métodos mais quantitativos do que a mancha ocidental (por exemplo, espectrometria de massa40) e requerem menos material de entrada (como a mancha ocidental capilar e a ELISA) ajudaria a mover esses resultados pré-clínicos para uma avaliação mais robusta e sistemática das amostras de pacientes do PBMC.

O desenvolvimento de medicamentos visa oferecer novas terapêuticas que abmetam as necessidades médicas não atendidas e medicamentos mais direcionados e personalizados. Múltiplos mecanismos de drogas estão sob investigação ativa, incluindo inibição enzimática como quinase1, protease2, ou poli (ADP-ribose) inibidores de polimerase (PARP)3,degradadores deproteínas 4,anticorpos terapêuticos5e drogas conjugadas por anticorpos (ADCs)6, entre muitos outros. Um exemplo dos esforços para obter melhores tratamentos em oncologia é o uso de inibidores de quinase com o objetivo de parar as cascatas sinalizadoras que mantêm as células cancerígenas proliferando1,7. Medir os níveis de fosforilação substrato específico para essas quinases é o melhor biomarcador farmacodinâmico para quantificar o mecanismo de ação desses inibidores8. Outras drogas podem modular a expressão de uma determinada proteína, e nesse caso ser capaz de quantificar as mudanças na concentração de sua proteína alvo longitudinalmente ao longo do tratamento é primordial. Portanto, independente das características de uma droga ou patologia, a avaliação dos biomarcadores para estabelecer a relação farmacocinética (PK)/ farmacodinâmica (DP) entre exposição medicamentosa e modulação de alvo é a melhor prática no desenvolvimento clínico precoce e permite a determinação de uma dose/cronograma farmacodologicamente ativo seguro e tolerado9.
Enquanto no desenvolvimento clínico da oncologia, a análise biomarcadora em biópsias pode ser o melhor cenário para estabelecer a prova do mecanismo de uma droga, o número de biópsias disponíveis em um ensaio é geralmente bastante limitado10,11. Alternativamente, as amostras de sangue periféricas são altamente valiosas para ensaios clínicos porque envolvem um procedimento minimamente invasivo, são rápidas e fáceis de obter facilitando a análise longitudinal, são menos caras que biópsias e fornecem vastas informações para o monitoramento em tempo real do resultado de um tratamento. Um benefício adicional para avaliar biomarcadores PD no sangue periférico é a capacidade de usar a biosample para também quantificar pk permitindo exatidão na determinação das relações quantitativas PK/PD e modelagem PK/PD subsequente12,13. As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) de sangue inteiro podem ser isoladas para estudar marcadores proteicos, que experimentam alterações em seu nível de expressão ou em suas modificações pós-translacionais. Além disso, os PBMCs podem ser usados para fins de imunofenofoteping14,15, ensaios de funcionalidade imunológica, como a avaliação da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC)16 e análise epigenética através do isolamento do RNA. Da mesma forma, o plasma de sangue inteiro pode ser usado para quantificar citocinas para caracterizar a resposta imunológica de um paciente, para realizar estudos metabólicos, e também para isolar e sequenciar o DNA tumoral circulante (CTDNA) para monitorar a evolução clonal da doença sob seleção do agente terapêutico, fornecendo frequentemente uma base mecanicista para resistência ao tratamento17,18,19 permitindo o desenvolvimento de gerações subsequentes de terapêutica20. Finalmente, o isolamento das células tumorais circulantes (CTCs) do sangue periférico permite a avaliação da progressão da doença por enumeração longitudinal, sequenciamento de DNA/RNA e análise de proteína-biomarcadores21. Embora esse isolamento seja compatível com o protocolo aqui descrito22, a baixa abundância de CTCs em muitos tipos de câncer e estágios iniciais da doença torna o uso de tubos especializados mais adequado para minimizar a degradação do CTC23.
Nos últimos anos, o uso de biópsias líquidas melhorou as informações obtidas em ensaios clínicos e as coleções de PBMC foram incluídas em muitos estudos para monitorar o engajamento direcionado e a prova de mecanismos diretamente em células tumorais para alguns tipos de malignidades hematológicas, ou nos próprios PBMCs como substitutos de DP das células tumorais24,25,26. A preparação de amostras de alta qualidade impacta positivamente a determinação do tratamento mais seguro e eficaz para uma determinada patologia, mas em nossa experiência, a qualidade das preparações de PBMC obtidas de diferentes sítios clínicos tem sido submetida a ampla variabilidade na qualidade, resultando em amostras que não são adequadas para fins de análise a jusante. Isso impactou a quantidade de dados de DP que poderiam ser coletados desses estudos.
Aqui descrevemos em detalhes um protocolo fácil de seguir que mostra como isolar eficientemente tanto os PBMCs quanto as amostras de plasma de uma única coleta de sangue em um ambiente clínico. O protocolo baseia-se nas instruções fornecidas pelo fabricante dos tubos de preparação de células mononucleares, que incorpora modificações onde a experiência do mundo real tem destacado dificuldades na execução de protocolos relatadas por locais clínicos, como problemas de centrifugação, atrasos de processamento e transferência de amostras para criovias. Existem métodos alternativos comercialmente disponíveis para o uso de tubos de preparação de células mononucleares baseados na separação gradiente de densidade usando soluções de polissacarídeo com ou sem uma barreira que separa a solução do sangue27. Se o local clínico relevante já for bem experimentado nessas metodologias alternativas, este protocolo pode ser substituído de forma aceitável por elas. Nesses casos, dois fatores podem ser considerados: alguns métodos alternativos exigem a transferência de sangue inteiro de um tubo de coleta para um tubo de preparação separado, onde uma transferência adicional de material biológico primário humano pode apresentar um risco de segurança ligeiramente maior, e o sucesso de métodos sem barreiras que separam o sangue da solução de polissacarídeo depende de etapas críticas, como a colocação da amostra de sangue no meio de gradiente de densidade que requer o desenvolvimento de um nível refinado de perícia técnica nem sempre encontrado em um ambiente de laboratório hospitalar. Não obstante os pontos acima, a viabilidade geral e a recuperação celular são comparáveis entre essas técnicas15,28. A escolha da metodologia é, portanto, um pouco dependente da experiência técnica prévia, mas em nossas mãos, tubos de preparação de células mononucleares podem ser usados com sucesso em um contexto clínico amplo e são nossa, caso contrário, recomendação.
Enquanto um ponto final deste protocolo é produzir pelotas PBMC para posterior processamento em lisatos, outras aplicações finais da coleção PBMC poderiam ser implementadas, como o isolamento de ácidos nucleicos, ou a produção de manchas PBMC ou blocos PBMC adequados para métodos imunohistoquímicos (IHC). É importante ressaltar que, uma vez que cada biosample retirado dos pacientes representa um procedimento invasivo em pelo menos algum nível, este protocolo maximiza o material útil de cada amostra, isolando também o plasma que pode ser usado para análises de citocinas, estudos metabolômicos ou sequenciamento ctDNA.
A análise de biomarcadores periféricos em ensaios oncológicos é uma das muitas aplicações de lysates pbmc. Um exemplo é a avaliação da resposta a danos no DNA (DDR) em tratamentos como quimioterapia, radioterapia ou o uso de inibidores de enzimas envolvidas na DDR, como as quinases relacionadas à fosfartítrica-3 quinase (PIKKs)7 e PARPs3,13. O objetivo desses tratamentos é aumentar os danos ao DNA nas células que proliferam, o que gera alta toxicidade nas células com mecanismos de DDR prejudicados e pontos de verificação do ciclo celular, como células cancerosas. Aqui apresentamos um exemplo com um estudo de biomarcadores de DDR em sangue periférico submetido a raios-X.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

A análise de biomarcadores no sangue periférico está se tornando cada vez mais importante em ensaios clínicos para estabelecer a prova de mecanismo para avaliar os efeitos do tratamento, e ajudar a orientar a dose e agendar a definição terapêutica. A partir de uma única coleta de sangue, as células mononucleares de sangue periféricas podem ser isoladas e processadas para analisar e quantificar marcadores proteicos, e amostras de plasma podem ser usadas para a análise de DNA tumoral circulante, citocinas e metabolômicas plasmáticas. Amostras longitudinais de um tratamento fornecem informações sobre a evolução de um marcador de proteína dado, o estado mutacional e a paisagem imunológica do paciente. Isso só pode ser alcançado se o processamento do sangue periférico for realizado efetivamente em locais clínicos e as amostras forem devidamente preservadas da cabeceira para o banco. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de uso geral que pode ser implementado em locais clínicos para obtenção de pelotas PBMC e amostras de plasma em ensaios clínicos multicêntricos, que permitirá aos profissionais clínicos em laboratórios hospitalares fornecer com sucesso amostras de alta qualidade, independentemente de seu nível de experiência técnica. Também são apresentadas variações alternativas de protocolo que são otimizadas para métodos analíticos mais específicos a jusante. Aplicamos este protocolo para estudar biomarcadores proteicos contra a resposta a danos de DNA (DDR) no sangue irradiado de raios-X para demonstrar a adequação da abordagem em ambientes oncológicos onde drogas DDR e/ou radioterapia têm sido praticadas, bem como em estágios pré-clínicos onde é necessário testar hipóteses mecanicistas.

Para melhorar a qualidade das preparações do PBMC em nossos ensaios clínicos, geramos um protocolo com passos concisos e claros que podem ser seguidos por profissionais de laboratório hospitalar, independente de sua formação em biologia molecular e habilidades laboratoriais. Adaptamos o protocolo do fabricante incorporando modificações nas etapas em que os problemas de execução foram identificados ou relatados a partir de locais clínicos envolvidos em vários ensaios clínicos multicêntricos. No entanto, o protocolo pode ser otimizado para atender a requisitos específicos, como restrições de tempo no local clínico ou tipo de análises a jusante (ver Arquivo Suplementar). Demonstramos que o DDR pode ser analisado em PBMCs olhando para biomarcadores específicos sobre danos de DNA gerados pela radiação.
As consultas mais comuns que recebemos de locais clínicos dizem respeito às etapas de centrifugação, que impactam diretamente em poder isolar com sucesso os PBMCs e obter a última pelota pbmc. Usar o tipo apropriado de centrífuga de rotor de cabeça swing-out (Figura 1B,C) é a chave para o sucesso do protocolo. No entanto, quando apenas uma centrífuga de rotor de ângulo fixo está disponível no local clínico, sugerimos a realização da etapa 2.4 em um rotor de ângulo fixo no mesmo RCF como para um rotor de cabeça swing-out, mas por apenas 10 minutos. Isso garante que uma camada PBMC seja separada do plasma (ver Figura 2B,C). Enquanto a camada de sangue em um meio de separação gradiente de densidade requer uma centrifugação de freio, o sangue em tubos de preparação de células mononucleares pode ser centrifuado com freios devido à presença de uma barreira de gel no tubo que garante a preservação da camada PBMC separada dos componentes sanguíneos mais densos27,28.
Pelo menos 4 mL de plasma não diluído de alta qualidade foram obtidos a partir da centrifugação de sangue no formato do tubo de 8 mL, o que poderia ser ainda mais esclarecido para seu uso em análises especializadas como sequenciamento ctDNA ou estudos metabolômicos29,30 (etapas opcionais 4.1.1-4.1.4). A quantidade de PBMCs isolados, tamanho das pelotas e hemólise ou contaminação por glóbulos vermelhos têm sido outras preocupações provenientes de locais clínicos e experiência em análise de amostras. O número de células obtidas a partir de 8 mL de sangue foi variável dependendo do quadro do paciente e da doença, mas em geral a pelota obtida é pequena em tamanho, e de uma coloração transparente/branca (Figura 3A,B). Devido a essas características, é importante visualizar a pelota contra um fundo escuro para evitar sua aspiração acidental durante as etapas de lavagem (2,5 e 3,3). Às vezes, as pelotas podem ter alguma coloração vermelha devido à contaminação dos glóbulos vermelhos(Figura 3C),e isso tem um efeito negativo na qualidade da preparação. Para evitar perder pequenas pelotas como as mostradas na Figura 3,a transferência da pelota PBMC para um criovial é facilitada pelo passo 3.7 onde a pelota PBMC é resuspendida em 50 μL de PBS.
O rendimento típico ao usar esses tubos e sangue de indivíduos saudáveis varia entre 7 a 21 x 106 células para 8 mL, e uma recuperação celular entre 70 e 80% como é nossa experiência e como foi mostrado anteriormente27,28. Isso depende tanto da contagem individual de células quanto do operador e é comparável aos números de células e valores de recuperação celular obtidos por outros métodos usando gradiente de densidade (incluindo sistemas utilizando tubos com barreira de separação)15,27,28. Um exemplo ilustrativo da variação do número de PBMCs isolados com este método dependendo da configuração da doença é a análise de marcadores PBMC em pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC). O número de células recuperadas de um tubo de preparação de células mononucleares de 8 mL ao aplicar este protocolo variou de 1,62 x 104 a 1,99 x 109 em 45 amostras obtidas de 7 pacientes no estudo NCT0332827331 (Tabela 1). Um parâmetro relacionado é a concentração proteica dos lysatos pbmc obtidos por este método, e isso depende do número de células isoladas e da eficiência da extração de proteínas. As pelotas de células lísedas na seção 6 foram geradas com tampão RIPA e sônica (etapa 6.6). A ressuspensão das pelotas celulares em seu mesmo volume de tampão de lise geralmente resulta em uma faixa de concentrações de 3 a 10 mg/mL, e neste exemplo específico as concentrações de lysate foram de 6,8, 8,3 e 8,6 mg/mL para 0, 0,2 e 7 Gy, respectivamente. No entanto, isso é submetido a uma alta variabilidade ao receber amostras de locais clínicos que não foram preparadas de forma ideal, a doença do paciente e a presença de hemoglobina de contaminação por glóbulos vermelhos. Por exemplo, pelotas muito pequenas precisam ser resuspengidas em um volume de tampão de lise maior que o volume de pelotas celulares para permitir tanto a medição da concentração de proteínas quanto a análise de biomarcadores a jusante, resultando em amostras mais diluídas. Nesse caso, se uma concentração amostral estiver abaixo de 1 mg/mL, isso pode representar um desafio para realizar ensaios como a mancha ocidental devido a este alto fator de diluição. Em contrapartida, nas amostras de LLC mencionadas anteriormente, o volume de tampão de lise adicionado para resuspensar as pelotas celulares variou de 50 a 500 μL, e a concentração de proteínas passou de 1,62 a 19,77 mg/mL(Tabela 1).
Quando as amostras apresentam contaminação por glóbulos vermelhos ou hemolise(Figura 3C),a concentração proteica do lysato PBMC torna-se superestimada devido à inclusão da hemoglobina dos eritrócitos. Esta é a razão pela qual deve-se fazer uma inspeção visual e anotação de tais amostras, conforme descrito na etapa 6.7 do protocolo. O carregamento da amostra em excesso pode compensar a presença de hemoglobina ao realizar a análise biomarcadora na medida em que um controle de carregamento está incluído no ensaio. Outros métodos mais quantitativos para medir a hemólise poderiam ser implementados, como medir a absorvência em 414 nm32.
O DDR foi analisado em PBMCs obtidos seguindo este protocolo clínico. Para ilustrar uma situação que imita o DNA prejudicando tratamentos clínicos como radioterapia ou quimioterapia, o sangue inteiro de voluntários saudáveis foi ex vivo submetido à radiação de raios-X(Figura 4A). A radiação ionizante (IR), como os raios-X, induz diferentes tipos de dano de DNA, incluindo quebras de dupla-tração de DNA (DSBs). A detecção de danos no DNA dessas lesões ativa PIKKs como ataxia-telangiectasia mutada (ATM), ATM e Rad3 (ATR) e quinase de proteína dependente de DNA (DNA-PK), que envolvem mecanismos de reparação de DNA como recombinação homólogo (RH) ou junção final não homóloga (NHEJ). A ativação do caixa eletrônico pela presença de DSBs ocorre por seu recrutamento para locais de dano pelo complexo MRN (MRE11-RAD50-NBS1), causando autofosforilação atm em diversos resíduos, incluindo Ser1981. Por sua vez, o ATM ativado fosforila os componentes do complexo mrn e outras proteínas, como a variante histone H2AX no Ser139 (onde pSer139-H2AX também é conhecido como γH2AX) para promover uma mudança estrutural na cromatina abrangendo a partir do DSB que facilita o recrutamento de outros fatores DDR33. Os PBMCs respondem à radiação ionizante, apesar de sua baixa taxa de proliferação e os métodos de espectrometria de massa permitiram quantificação da regulação da Regulação do Ser635 fosforilado no RAD50 pelo caixa eletrônico. Esta fosforilação é reduzida na presença de inibidores de caixas eletrônicos e RAD50 pS635 foi validado ainda mais como um biomarcador farmacodinâmico para tratamentos inibidores clínicos de caixas eletrônicos em tumores por imunohistoquímica8. Para avaliar a resposta dos PBMCs à radiação, sangue de voluntários saudáveis foi submetido a diferentes doses de IR e amostras foram coletadas após uma incubação de 1 h a 37 °C (Figura 4A). Para isso, os sangues foram transferidos para tubos plásticos para evitar a redução do rendimento do isolamento do PBMC devido à alta temperatura (etapa 6.2). Analisamos como o ATM foi ativado não apenas olhando para o RAD50 pS635 relatado anteriormente, mas também atm pS1981 e γH2AX. Nos três casos examinados, observou-se aumento dessas modificações pós-translacionais em doses mais elevadas de IR(Figura 4B). Curiosamente, a fosforilação do ATM e RAD50 foi substancial na baixa dose de 0,2 Gy, o que sugere que essas modificações pós-translacionais podem ser interrogadas como biomarcadores PD para tratamentos envolvendo a geração de DSBs de DNA com um bom alcance dinâmico, não apenas em amostras de tumores, mas em sangue periférico. Isso permite o monitoramento da resposta da DP ao tratamento, adquirindo amostras longitudinais ao longo do tratamento. O tempo da coleta de sangue para o processamento das amostras é fundamental para garantir que essas cascatas sinalizadoras ainda estejam ativas, pois atrasos no processamento impactarão na cinética de tais cascatas e pode-se perder os eventos de fosforilação usados como fosfomarcadores.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> Figura 4: PBMCs isolados do sangue ex vivo irradiado após o presente protocolo clínico exibem biomarcadores para informar sobre a extensão dos danos de DNA causados pelo tratamento. (A) Visão geral esquemática do protocolo para a elaboração de PBMCs e análise da DDR após irradiação de sangue inteiro. *2 etapas extras de centrifugação necessárias para análise/metabolômica ctDNA. (B) Mancha ocidental mostrando a regulação dependente de dose de bifosfo-biomarcadores de DDR em PBMCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amostra</td>
			<td>Número de PBMCs/ 8 mL de sangue</td>
			<td>Volume de buffer RIPA suplementado (μL)</td>
			<td>Concentração final (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Amostras longitudinal de PBMC correspondentes a 7 pacientes</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Número celular e concentração proteica de pelotas pbmc de pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC). Os dados apresentados nesta tabela correspondem a 45 amostras de PBMC de 7 pacientes da LLC participantes do estudo NCT03328273 coletados em tubos de preparação de células mononucleares. Estes são dados originais gerados utilizando amostras do estudocitado 31.
Arquivo Suplementar: Opções alternativas de protocolo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Este protocolo detalha a preparação clinicamente implementável de biosamples de PBMC e plasma de alta qualidade no local do ensaio clínico que pode ser usado para análise de biomarcadores translacionais.

Preparação de pelotas de células mononucleares de sangue periférico e plasma de uma única coleta de sangue em locais de ensaio clínico para análise de biomarcadores

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

As amostras de PBMC e plasma são simples de adquirir e altamente informativas no desenvolvimento clínico precoce. Este protocolo robusto minimiza a variabilidade pré-analítica introduzida nos locais clínicos. Este protocolo é rápido e fácil, exigindo equipamentos básicos de laboratório e experiência mínima do operador para processar o sangue em PBMCs e plasma.É compatível com dias de laboratório ocupados em hospitais. A análise a jusante dos componentes sanguíneos resultantes deste protocolo pode informar relações farmacocinéticas e farmacodinâmicas, agendamento de doses de drogas e prova de engajamento de alvos e fornecer insights sobre mecanismos de ação medicamentosos, apoiando análises em tempo real e introspectivas. Usamos este protocolo para estudos oncológicos, especificamente para analisar mecanismos de resposta a danos no DNA.No entanto, os materiais coletados por este protocolo podem ser relevantes em muitas áreas da doença e múltiplas modalidades terapêuticas. Depois de receber oito mililitros de sangue doador por amostra, registe o tempo em que o sangue foi extraído e inverta suavemente cada tubo oito a dez vezes antes de transferir amostras de sangue tratados anticoagulantes para cada um dos tubos rotulados para radiação. Para amostras clínicas, centrifugar os tubos logo após inverí-los.Coloque os tubos cinza 0,2 em um armário de raio-x pré-aquecido, feche a porta e aplique uma dose cinza de 0,2 nos tubos. Substitua os tubos irradiados de baixa dose pelos sete tubos cinzentos e ajuste a dose para aplicar uma dose de radiação de sete cinzas às amostras de irradiação de alta dose. Depois que ambas as amostras foram irradiadas, incubar os três tubos a 37 graus Celsius por uma hora.Transfira as amostras para tubos de preparação celular antes de separar as células com centrifugação de alta velocidade, certificando-se de definir as unidades como x g ou RCF equivalente. Após a centrifugação, veja os tubos contra um fundo escuro para identificar as camadas de plasma, glóbulos vermelhos e casacos de buffy. Usando uma pipeta sorológica, transfira aproximadamente metade do plasma para uma centrífuga cônica de 15 mililitros sem perturbar a camada do casaco e armazene o tubo de plasma em gelo molhado.Em seguida, use uma pipeta de pastagem para transferir toda a PBMC contendo camada de casaco buffy em um novo tubo de 15 mililitros e adicionar PBS de temperatura ambiente ao PBMC a um volume final de 15 mililitros por amostra. Misture suavemente as células por inversão cinco vezes e colete as células por centrifugação a uma velocidade mais baixa, certificando-se de verificar as unidades de centrifugação. Aspire todos, menos os últimos 500 microliters de supernascer sem perturbar as pelotas.Adicione PBS fresco a um volume final de 10 mililitros em cada tubo e resuspend invertendo suavemente os tubos. Use 40 alíquotas de microliter das células para contar. Após a contagem, colete as células com outra centrifugação e remova o máximo de supernanato possível sem perturbar as pelotas.Para armazenar o PBMC para processamento posterior, resuspenja as pelotas em 50 microliters de PBS fresco por amostra com tubulação suave e transfira cada suspensão celular inteira para um criovial de 1,5 mililitro rotulado em gelo molhado. Em seguida, o flash congele as células pelo método preferido e coloque-as em uma caixa de congelamento a menos 80 graus. Regissou o tempo em que as células foram congeladas.Alternativamente, resuspensar as pelotas em uma mistura de mililitro ou congelamento por amostra e transferir as suspensões celulares para criovias rotuladas individualmente. Em seguida, coloquei os tubos e caixas de congelamento pré-refrigerados para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para congelar o plasma, adicione a um mililitro aliquots lotes do plasma até cada um dos cinco microtubos mililitros sem perturbar a pelota residual e regise o volume total de plasma em cada tubo.Em seguida, congele imediatamente as alíquotas de plasma em uma orientação vertical em um congelador de menos 80 graus Celsius. Para a análise ocidental das amostras, resuspenque a pelota em cada tubo com um volume apropriado de tampão de lise complementado com inibidores de protease e fosfatase iguais aos do volume de pelotas celulares com tubulação suave e incubar as amostras de células por 10 minutos no gelo. No final da incubação, transfira as amostras para tubos de 1,5 mililitro e sonicá-las com três segundos e 30 segundos em ciclos de 30 segundos a quatro graus Celsius.Colete as amostras por centrifugação e transfira os supernacantes para novos tubos de 1,5 mililitro. Em seguida, misture 40 microgramas por amostra com tampão de carga e ferva as amostras por cinco minutos. Carregue 20 microgramas de cada amostra por faixa em duplicação em um gel de proteína Bis-Tris de 4-12% e execute um SDS-PAGE.O número de células obtidas a partir de oito mililitros de sangue varia de acordo com o paciente e a configuração da doença. Em geral, a pelota celular é pequena em tamanho e de cor branca transparente. Às vezes as pelotas podem ter alguma contaminação de glóbulos vermelhos, o que tem um efeito negativo na qualidade da preparação.Um rendimento típico de um paciente com leucemia linfocítica crônica usando este protocolo varia de 1,62 vezes 10 a 1,99 vezes 10 a nona células por oito mililitros de preparação de células mononucleares com uma concentração final de proteína variando entre 1,62 e 19,77 miligramas por mililitro. Nesta análise representativa de três amostras de pacientes, observou-se aumento das modificações pós-translacionais em doses de radiação ionizante mais elevadas. Curiosamente, a fosforilação da ataxia-telangiectasia mutada e RAD50 foi substancial na baixa dose de 0,2 cinzas, o que sugere que essas modificações pós-translacionais podem ser interrogadas como biomarcadores farmacodinâmicos para tratamentos envolvendo a geração de quebras de fios duplos de DNA com um bom alcance dinâmico no tumor, bem como amostras de sangue periféricos.Para uma preparação ótima da amostra, processe o sangue dentro de uma hora da coleta à temperatura ambiente, centrifufique as amostras corretamente e visualize o tubo contra o fundo escuro para ser capaz de distinguir o casaco buffy.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Fracionamento rápido e isolamento de componentes de sangue total em amostras obtidas a partir de uma configuração de base comunitária

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Medicina

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Implantação e Acompanhamento Peripheral Imune celular no Modelo II-45 Rat Singênico mesotelioma

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Repetiu a coleta de sangue da veia da cauda de ratos não anestesiados com um sistema de coleta de sangue do vácuo

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Método de triagem para micropartículas em transfusões de plaquetas de rotina

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

Avaliação de um analisador de teste de ponto de cuidado para medir leucócitos sanguíneos periféricos

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Amostragem Repetitiva de Sangue da Veia Subclávia de Rato Consciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...