Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех членов трансляционной медицины в AstraZeneca Oncology Research and Early Development за их отзывы о протоколе, особенно Хедли Карр, Тамми Йе и Натан Стэндифер за советы по подготовке плазмы к анализу ctDNA, по выделению PBMC и криоконсервации и иммунофенотипированию PBMC соответственно.

Все авторы являются или были сотрудниками и акционерами компании «АстраЗенека». VM является сотрудником Acerta Pharma, владеет акциями AstraZeneca и Gilead Sciences.

Высококачественные препараты PBMCs и плазмы, которые могут быть надежно и воспроизводимо приготовлены в местах клинических испытаний, неоценимы для информирования периферических прогностических и фармакодинамических трансляционных биомаркеров конечных точек клинических испытаний. Здесь мы предоставили короткий, четкий протокол, который рассматривает типично проблемные шаги, которые до сих пор были уязвимы для ошибок выполнения в условиях клинических испытаний. Тем не менее, протокол может быть дополнительно оптимизирован для удовлетворения конкретных требований, таких как временные ограничения в клинической площадке или тип последующих анализов (см. Дополнительный файл).
С этой целью мы показали, как изолировать как PBMCs, так и плазму из цельной крови с использованием пробирок для подготовки мононуклеарных клеток для получения замороженных гранул PBMC и замороженной плазмы, подходящей для различных последующих анализов. Мы обратили внимание на особенно важные этапы протокола, включающие центрифугирование и идентификацию слоя PBMC на этапе 2.5 и гранул PBMC на этапах 3.3 и 3.6. Исторически сложилось так, что клинические центры часто ошибались в установке центрифуги на правильные единицы (путая значение RCF или x g со значением RPM), задерживая обработку образцов крови, температуру и наличие больших объемов PBS над замороженными гранулами клеток. В большинстве роторов центрифуг ошибочное внесение значения x g в качестве настройки RPM приведет к значительному недоцентрифугированию с результатом плохо определенного или отсутствующего слоя PBMC и потенциальному непреднамеренному отбрасыванию PBMC во время этапов промывки из-за неэффективного гранулирования ячейки. Тем не менее, существует вероятность того, что слой PBMC не виден, несмотря на использование правильных настроек центрифугирования и адаптера ротора, если у пациента развилась лейкопения. Это состояние может повлиять на пациентов, включенных в онкологические испытания из-за химиотерапии или лучевой терапии, и его следует учитывать. Еще один критический момент, который был четко указан в протоколе, заключается в том, что образцы должны быть обработаны в течение 1-2 ч от забора крови, чтобы уменьшить возможность негативного влияния гемолиза на протокол. Кроме того, цель обработки образцов в течение первого часа забора крови снижает изменчивость ex vivo, что может оказать большое влияние на показания фармакокинетики и на биомаркеры, на которые влияет сохранение крови или активные сигнальные пути, такие как случай, показанный на рисунке 4. Задержки в обработке образцов также могут оказать пагубное влияние на жизнеспособность клеток, если клетки будут криоконсервироваться34. Другим фактором, который может повлиять как на выход, так и загрязнение эритроцитов, является температура хранения и центрифугирования, которую следует поддерживать при комнатной температуре (18-25 °C). Более низкие температуры увеличивают плотность среды градиента плотности, что приводит к более высокой степени загрязнения эритроцитов и гранулоцитов, поскольку эти клетки также не агрегируются. С другой стороны, более высокие температуры приводят к тому, что МПК попадают в ловушку между агрегированными эритроцитами, что снижает выход препаратана 15,27,28. И, наконец, крайне важно, чтобы в криовиальной грануле клетки присутствовало не более 50-100 мкл жидкости, так как это негативно влияет на концентрацию любых белковых лизатов, полученных при последующей переработке этих препаратов PBMC. Избыток жидкости приведет к чрезмерному размасливающим образцам, что приведет к лизатам с очень низкой концентрацией белка, не подходящим для анализа биомаркеров. Кроме того, будет нарушено сохранение любых постпереводных модификаций, а также значительно снизится эффективность лизиса.
Были выбраны пробирки для подготовки мононуклеарных клеток, поскольку они предлагают наиболее простой способ выделения как PBMCs, так и плазмы в одном заборе крови для клинических испытаний с отличной воспроизводимостью, по нашему опыту. Обработка крови не требует высококвалифицированных операторов, а использование одной трубки устраняет необходимость разбавления крови и ее переноса в другую пробирку, снижая риск опасности; сокращает протокол за счет выполнения этапов центрифугирования с включенными тормозами; и все реагенты находятся в пробирке, что снижает изменчивость. По нашему опыту, эти преимущества перевешивают более высокую стоимость этих трубок по сравнению с другими классическими методами, включающими только использование среды разделения градиента плотности27,28 (£ 410 за 60 единиц, в то время как лимфопрепная среда для 66 препаратов 50 мл составляет £ 215). Они доступны в двух типах антикоагулянтов, гепарине и цитрате, оба из которых сопоставимы при поддержании функциональности выделенных PBMCs35,поэтому выбор одного антикоагулянта над другим будет основываться на возможном влиянии гепарина или цитрата в последующих исследованиях биомаркеров. Хотя было показано, что трубки ЭДТА обеспечивают самый высокий выход изоляции PBMC по сравнению с гепарином или цитратом13,преимущество простоты использования манипуляции только с одной трубкой уравновешивает это соображение. Если цитокины будут проанализированы, антикоагулянты могут оказывать влияние на уровни, обнаруженные в плазме, следовательно, оба антикоагулянта должны быть протестированы перед выбором одного для клинического исследования36. Если плазма будет использоваться для метаболомных исследований, то использование гепарина в качестве антикоагулянта будетпредпочтительным 37. Таким образом, единственный вопрос, остающемся конечному пользователю или ученому-трансляционщику клинических испытаний, заключается в том, будут ли цитрат или гепарин более подходящими для их целей после оценки затрат.
Хотя преимущества использования пробирок для клеточного препарата многочисленны по сравнению с ограничениями, которые они представляют (более высокая стоимость и доступность ограниченного диапазона антикоагулянтов), основное ограничение использования МПК или плазмы для получения биомаркеров БП в клинических испытаниях, особенно в онкологии, может быть не связано с методом выделения. За исключением гематологических раковых заболеваний, где опухоль непосредственно отбирается из периферической крови, для других показаний рака плазма и МПК являются суррогатными тканями, которые не обязательно имитируют первичную опухоль. Периферическая ткань может не разделять геном и эпигеном с первичной опухолью, поэтому периферический анализ биомаркеров, зависящих от конкретной опухолевой мутации, в основном ограничивается анализом ctDNA (из плазмы) или CTC (путем последующей сортировки слоя PBMC). Кроме того, сигнальные каскады, приводящие к разрастанию опухоли или способствующие пролиферации опухоли, могут быть не такими активными в периферической крови. Эта проблема может быть преодолена путем применения подходов к обнаружению биомаркеров, нацеленных на кровь8, для выявления альтернативных биомаркеров или связи методов лечения ex vivo с выделением плазмы38 и препаратов PBMC26.
В текущем протоколе замороженные гранулы PBMC могут быть легко обработаны вне клинического центра с получением белковых лизатов, которые могут быть оценены с помощью методов вестерн-блоттинга или ИФА. Также были представлены альтернативные методы использования НБК для включения методов IHC (Дополнительный файл). Кроме того, мы также подробно описали возможность криоконсервирования PBMCs (см. Дополнительный файл)для мониторинга иммунных клеток, соответствующего применения в онкологии, с ингибиторами иммунных контрольных точек и АЦП, которые все чаще тестируются в клинических испытаниях. Оценка иммунных функций, таких как ADCC16 и иммунофенотипирование, являются приложениями, совместимыми с криоконсервируемыми PBMCs, выделенными из пробирок для подготовки мононуклеарных клеток15. Существует предостережение в отношении криоконсервации, поскольку она может способствовать понижению регуляции определенных поверхностных и внутренних маркеров и может ухудшить определенные функции клеток, однако криоконсервация PBMC является единственным возможным способом выполнения этих анализов из-за временных ограничений при обработке образцов из нескольких клинических объектов для обработки во внешних лабораториях14,15,и эти пагубные эффекты могут быть значительно преодолены хорошими методами оттаивания и периодами покоя39.
В заключение, протокол, представленный здесь, позволит надежно подготовить МПК и образцы плазмы в любом клиническом учреждении с общим оборудованием и материалами, чтобы трансляционные конечные точки из периферической крови могли быть надежно включены в глобальных клинических испытаниях.
Наконец, мы демонстрируем, как анализ лизатов PBMC может механистически информировать реакцию на повреждающие ДНК агенты, показывая дозозависимую постпереходную модификацию ключевых факторов DDR, которая может быть использована для формирования клинического развития. Перспективная реализация методов, которые являются более количественными, чем западное блоттинг (например, масс-спектрометрия40)и требуют меньшего количества входного материала (таких как капиллярное западное блоттирование и ИФА), поможет продвинуть эти доклинические результаты к более надежной, систематической оценке образцов пациентов PBMC.

Разработка лекарств направлена на предоставление новых терапевтических средств, удовлетворяемых неудовлетворенным медицинским потребностям, и более целенаправленной, персонализированной медицины. В настоящее время активно исследуются многочисленные лекарственные механизмы, включая ферментативное ингибирование, такое как киназа1,протеаза2или ингибиторы поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP)3,деградация белка4,терапевтические антитела5и антитело-конъюгированные препараты (АЦП)6,среди многих других. Примером усилий по получению лучшего лечения в онкологии является использование ингибиторов киназы с целью остановки сигнальных каскадов, которые удерживают пролиферирование раковых клеток1,7. Измерение уровней субстратного фосфорилирования, специфичных для этих киназ, является лучшим фармакодинамическим биомаркером для количественной оценки механизма действия этих ингибиторов8. Другие препараты могут модулировать экспрессию данного белка, и в этом случае возможность количественной оценки изменений концентрации их целевого белка продольно на протяжении всего курса лечения имеет первостепенное значение. Поэтому, независимо от характеристик лекарственного средства или патологии, оценка биомаркеров для установления фармакокинетической (ПК)/фармакодинамической (ФД) взаимосвязи между воздействием лекарственного средства и целевой модуляцией является наилучшей практикой в ранней клинической разработке и позволяет определить безопасную и переносимую фармакологически активную дозу/список9.
В то время как в онкологических клинических разработках анализ биомаркеров в биопсии может быть лучшим средством для установления доказательства механизма лекарственного средства, количество доступных биопсий в исследовании обычно довольно ограничено10,11. В качестве альтернативы, образцы периферической крови очень ценны для клинических испытаний, поскольку они включают минимально инвазивную процедуру, быстро и легко получить, облегчая продольный анализ, дешевле, чем биопсия, и предоставляют обширную информацию для мониторинга результатов лечения в режиме реального времени. Дополнительным преимуществом оценки биомаркеров БП в периферической крови является возможность использования биопроста для количественной оценки ПК, что позволяет точно определить количественные соотношения ПК/ФД и последующее моделирование ПК/ФД12,13. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) из цельной крови могут быть выделены для изучения белковых маркеров, которые испытывают либо изменения в уровне их экспрессии, либо в их постперекьерных модификациях. Кроме того, PBMCs могут быть использованы для иммунофенотипирования14,15,анализов иммунной функциональности, таких как оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC)16 и эпигенетический анализ посредством выделения РНК. Аналогичным образом, плазма из цельной крови может быть использована для количественной оценки цитокинов для характеристики иммунологического ответа пациента, для выполнения метаболических исследований, а также для выделения и секвенирования циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) для мониторинга клональной эволюции заболевания при отборе из терапевтического агента, часто обеспечивая механистическую основу для резистентности к лечению17,18,19, позволяя разработать последующие поколения терапевтических средств20. Наконец, выделение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из периферической крови позволяет оценить прогрессирование заболевания путем продольного перечисления, секвенирования ДНК/РНК и анализа белково-биомаркеров21. Хотя эта изоляция совместима с протоколом, описанным в настоящемописании 22,низкое содержание ЦОК во многих типах рака и на ранних стадиях заболевания делает использование специализированных трубок более подходящим для минимизации деградации CTC23.
В последние годы использование жидких биопсий улучшило информацию, полученную в клинических испытаниях, и коллекции PBMC были включены во многие исследования для мониторинга взаимодействия с мишенью и доказательства механизма либо непосредственно в опухолевых клетках для некоторых типов гематологических злокачественных новообразований, либо на самих НБМК в качестве суррогатов БП опухолевых клеток24,25,26. Подготовка высококачественных образцов положительно влияет на определение наиболее безопасного и эффективного лечения данной патологии, но, по нашему опыту, качество препаратов PBMC, полученных из разных клинических объектов, подвергается широкой вариабельности качества, в результате чего образцы не подходят для целей последующего анализа. Это повлияло на объем данных о БП, которые могут быть собраны из этих исследований.
Здесь мы подробно описываем простой в использовании протокол, который показывает, как эффективно изолировать как PBMCs, так и образцы плазмы из одного забора крови в клинических условиях. Протокол основан на инструкциях, предоставленных производителем пробирок для подготовки мононуклеарных клеток, которые включают в себя модификации, в которых реальный опыт выявил трудности в выполнении протокола, о которых сообщают клинические центрифугирование, такие как проблемы центрифугирования, задержки обработки и передача образцов криовиалам. Существуют альтернативные коммерчески доступные способы применения пробирок для подготовки мононуклеарных клеток на основе разделения градиентов плотности с использованием растворов полисахаридов с барьером или без него, отделяющих раствор от крови27. Если соответствующий клинический центр уже имеет хороший опыт работы с этими альтернативными методологиями, этот протокол может быть приемлемо заменен ими. В таких случаях можно учитывать два фактора: некоторые альтернативные методы требуют переноса цельной крови из пробирки для сбора в отдельную пробирку для подготовки, где дополнительная передача первичного биологического материала человека может представлять несколько повышенный риск безопасности, и успех методов без барьеров, отделяющих кровь от раствора полисахарида, зависит от критических этапов, таких как наслоение образца крови на среде градиента плотности, требующей развития уточненного уровня технических знаний, не всегда встречающихся в лабораторных условиях больницы. Несмотря на вышеуказанные моменты, общая жизнеспособность и восстановление клеток сопоставимы между этими методами15,28. Таким образом, выбор методологии в некоторой степени зависит от предыдущего технического опыта, но в наших руках трубки для подготовки мононуклеарных клеток могут успешно использоваться в широком клиническом контексте и являются нашей рекомендацией.
В то время как одной из конечных точек этого протокола является производство гранул PBMC для дальнейшей переработки в лизаты, могут быть реализованы другие конечные применения сбора PBMC, такие как выделение нуклеиновых кислот или производство мазков PBMC или блоков PBMC, подходящих для методов иммуногистохимии (IHC). Важно отметить, что, поскольку каждый биопроигрок, взятый у пациентов, представляет собой инвазивную процедуру, по крайней мере, на некотором уровне, этот протокол максимизирует полезный материал из каждого образца, также выделив плазму, которая может быть использована для анализа цитокинов, метаболомных исследований или секвенирования ctDNA.
Анализ периферических биомаркеров в онкологических исследованиях является одним из многих применений лизатов PBMC. Одним из примеров является оценка ответа на повреждение ДНК (DDR) в таких методах лечения, как химиотерапия, лучевая терапия или использование ингибиторов ферментов, участвующих в DDR, таких как киназы, связанные с фосфатидилинозитол-3 (PIKKs)7 и PARPs3,13. Целью этих методов лечения является увеличение повреждения ДНК в пролиферирующих клетках, что создает высокую токсичность в клетках с нарушенными механизмами DDR и контрольными точками клеточного цикла, такими как раковые клетки. Здесь мы представляем пример с исследованием биомаркеров ГДР в периферической крови, подвергаемой рентгеновским лучам.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

Анализ биомаркеров в периферической крови становится все более важным в клинических испытаниях, чтобы установить доказательство механизма оценки эффектов лечения и помочь определить дозу и график терапевтических средств. Из одного забора крови мононуклеарные клетки периферической крови могут быть выделены и обработаны для анализа и количественной оценки белковых маркеров, а образцы плазмы могут быть использованы для анализа циркулирующей опухолевой ДНК, цитокинов и метаболомики плазмы. Продольные образцы из лечения предоставляют информацию об эволюции данного белкового маркера, мутационном статусе и иммунологическом ландшафте пациента. Это может быть достигнуто только в том случае, если обработка периферической крови эффективно проводится в клинических центрах и образцы должным образом сохраняются от постели до скамейки. Здесь мы представляем оптимизированный протокол общего назначения, который может быть реализован на клинических площадках для получения гранул PBMC и образцов плазмы в многоцентровых клинических испытаниях, что позволит клиническим специалистам в больничных лабораториях успешно предоставлять образцы высокого качества, независимо от их уровня технической экспертизы. Также представлены альтернативные варианты протоколов, оптимизированные для более конкретных последующих аналитических методов. Мы применяем этот протокол для изучения белковых биомаркеров против реакции на повреждение ДНК (DDR) на рентгеновской облученной крови, чтобы продемонстрировать пригодность подхода в онкологических условиях, где практиковаются препараты DDR и / или лучевая терапия, а также на доклинических стадиях, где требуется механистическая проверка гипотез.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Этот протокол детализирует клинически реализуемую подготовку высококачественных бионамплов PBMC и плазмы на месте клинического испытания, которые могут быть использованы для анализа трансляционных биомаркеров.

Получение гранул мононуклеарных клеток периферической крови и плазмы из одного забора крови в местах клинических испытаний для анализа биомаркеров

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

Образцы PBMC и плазмы просты в приобретении и очень информативны на ранних клинических разработках. Этот надежный протокол сводит к минимуму преаналитическую изменчивость, вводимую в клинических центрах. Этот протокол является быстрым и простым, требующим базового лабораторного оборудования и минимального опыта оператора для обработки крови в МПК и плазму.Это совместимо с напряженными лабораторными днями в больницах. Последующий анализ компонентов крови, полученный в результате этого протокола, может информировать фармакокинетические и фармакодинамические отношения, планирование дозы препарата и доказательство целевого взаимодействия и давать представление о механизмах действия лекарств, поддерживая как анализ в режиме реального времени, так и интроспективный анализ. Мы используем этот протокол для онкологических исследований, в частности, для анализа механизмов реакции на повреждение ДНК.Тем не менее, материалы, собранные с помощью этого протокола, могут быть актуальны для многих областей заболевания и нескольких терапевтических методов. После получения восьми миллилитров донорской крови на образец запишите время, в течение которого кровь была взята, и осторожно инвертируйте каждую трубку от восьми до 10 раз, прежде чем перенести обработанные антикоагулянтом образцы крови в каждую из пробирок, помеченных для излучения. Для клинических образцов центрифугируют трубки сразу после их инвертирования.Поместите 0,2 серых трубки в предварительно нагретый рентгеновский шкаф, закройте дверцу и нанесите на трубки дозу 0,2 серого цвета. Замените облученные трубки с низкой дозой семью серыми трубками и скорректируйте дозу, чтобы применить дозу семи серых лучей к образцам облучения с высокой дозой. После того, как оба образца были облучены, инкубируют все три трубки при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.Перенесите образцы в пробирки для подготовки клеток перед разделением ячеек высокоскоростным центрифугированием, убедившись, что единицы установлены как x g или эквивалентный RCF. После центрифугирования просмотрите трубки на темном фоне, чтобы определить слои плазмы, эритроцитов и шерсти. Используя серологическую пипетку, перенесите примерно половину плазмы в меченую 15-миллилитровую коническую центрифугу, не нарушая слой пышного покрытия, и храните трубку плазмы на влажном льду.Затем используйте пастбищную пипетку, чтобы перенести весь PBMC, содержащий слой пышного покрытия, в новую 15-миллилитровую трубку и добавить PBS комнатной температуры к PBMC до конечного объема 15 миллилитров на образец. Осторожно перемешайте ячейки путем инверсии пять раз и соберите ячейки путем центрифугирования на более низкой скорости, обязательно проверив блоки центрифугирования. Аспирировать все, кроме последних 500 микролитров супернатанта, не нарушая гранул.Добавьте свежий PBS к конечному объему 10 миллилитров в каждую трубку и повторно суспендируйте, осторожно перевернутые трубки. Используйте 40 микролитровых аликвот клеток для подсчета. После подсчета соберите клетки с помощью другого центрифугирования и удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы.Для хранения PBMC для последующей обработки повторно суспендируют гранулы в 50 микролитрах свежего PBS на образец с мягким пипетированием и переложите каждую целую клеточную суспензию в меченый криовиал 1,5 миллилитра на влажном льду. Затем вспышкой заморозьте ячейки предпочтительным способом и поместите их в морозильную коробку при минус 80 градусах. Запишите время, в которое клетки были заморожены.Альтернативно, повторно суспендируют гранулы в одном миллилитрах или морозильной смеси на образец и переносят клеточные суспензии на отдельные меченые криовиалы. Затем помещают трубки и предварительно охлажденные морозильные ящики для хранения при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы заморозить плазму, добавьте до одного миллилитра аликвоты большого количества плазмы в каждую из пяти двух миллилитровых микротрубок, не нарушая остаточную гранулу, и запишите общий объем плазмы в каждой трубке.Затем немедленно заморозьте аликвоты плазмы в вертикальной ориентации в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия. Для западного блот-анализа образцов повторно суспендируют гранулу в каждой пробирке с соответствующим объемом буфера лизиса, дополненного ингибиторами протеазы и фосфатазы, равными объему клеточной гранулы с мягким пипетированием, и инкубируют образцы клеток в течение 10 минут на льду. В конце инкубации перенесите образцы в 1,5-миллилитровые трубки и обложите их ультразвуком тремя 30 секундами по 30 секунд вне циклов при четырех градусах Цельсия.Соберите образцы путем центрифугирования и перенесите супернатанты в новые 1,5-миллилитровые трубки. Затем смешайте 40 микрограммов на образец с буфером загрузки и кипятите образцы в течение пяти минут. Загрузите 20 микрограммов каждого образца на полосу в двух экземплярах в 4-12% белковом геле Bis-Tris и запустите SDS-PAGE.Количество клеток, полученных из восьми миллилитров крови, варьируется в зависимости от пациента и настроек заболевания. В целом, ячейка гранулы небольшого размера и прозрачного белого цвета. Иногда гранулы могут иметь некоторое загрязнение эритроцитами, что негативно сказывается на качестве препарата.Типичный выход у пациента с хроническим лимфоцитарным лейкозом, использующего этот протокол, варьируется от 1,62 раза 10 до четвертого до 1,99 раза 10-девятой клетки на восемь миллилитров мононуклеарного клеточного препарата с конечной концентрацией белка в диапазоне от 1,62 до 19,77 миллиграмма на миллилитр. В этом репрезентативном анализе образцов трех пациентов наблюдалось увеличение постпереводных модификаций при более высоких дозах ионизирующего излучения. Интересно, что фосфорилирование атаксии-телеангиэктазии мутировало и RAD50 было существенным при низкой дозе 0,2 грея, что говорит о том, что эти постпереклянтные модификации могут быть реально изучены как фармакодинамические биомаркеры для лечения, включающего генерацию двухцепочечных разрывов ДНК с хорошим динамическим диапазоном в опухоли, а также образцов периферической крови.Для оптимальной пробоподготовки обработайте кровь в течение одного часа после сбора при комнатной температуре, правильно центрифугировать образцы и просмотреть трубку на темном фоне, чтобы иметь возможность различить пышную шерсть.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Быстрое Фракционирование и выделение целых компонентов крови в образцах, полученных из Окружение сообщества, основанного

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Ортотопическая Имплантация и периферической иммунной Мониторинг сотовый в модели II-45 Сингенная Крыса мезотелиомы

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

В анализах in vitro для оценки образования и разрушения сосудов типа мозгового барьера

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Повторил забора крови из Вены хвост-наркоз крыс с системой сбора механотронное крови

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Типовых скрининг метод для микрочастиц в трансфузии тромбоцитов

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Количественный анализ клеточного состава в передовых атеросклеротическим поражением гладкомышечные клетки Lineage трассировки мышей

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Одновременное циклометрическое использование потока нескольких типов клеток, извлеченных из мозга мыши / спинного мозга с помощью различных методов гомогенизации

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Мониторинг PD-1-Блокирование антител, связанных с Т-клеток, полученных от капли периферической крови

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

Оценка анализатора тестирования в месте оказания медицинской помощи для измерения лейкоцитов периферической крови

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Повторяющийся забор крови из подключичной вены сознательной крысы

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...