Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Vi vill tacka alla medlemmar i Translational Medicine vid AstraZeneca Oncology Research and Early Development för deras feedback på protokollet, särskilt Hedley Carr, Tammie Yeh och Nathan Standifer för råd om plasmapreparat för ctDNA-analys, om PBMC-isolering respektive PBMC-kryopreservation respektive immunofenotypning.

Informerat patientmedgivande och full överensstämmelse med relevanta nationella etiska krav i varje jurisdiktion, t.ex. Human Tissues Act (HTA – United Kingdom, 2004) och Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA – United States, 1996) är obligatoriska. Var säker på att ha fullt dokumenterat etikgodkännande innan du påbörjar något arbete med material som härrör från människor. Blod som användes vid optimeringen av detta protokoll gavs med lämpligt samtycke från Volunteers Advanceing Medicine Panel (VAMP) (etikreferens 16/EE/0459, studie CRF494, delstudie 001) som drivs av NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Storbritannien, enligt ett leveransavtal för mänskliga biologiska prover med National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. AstraZeneca Biobank i Storbritannien är licensierad av Human Tissue Authority (Licens nr 12109) och har National Research Ethics Service Committee (NREC) Approval as a Research Tissue Bank (RTB) (REC No. 17/NW/0207).
1. Allmän vägledning för förberedelse
OBS: Allt arbete med obesatt mänskligt material såsom blod, plasma och PBMCs i detta protokoll måste fungera under förutsättning att dessa material kan bära potentiellt smittämnen och därför måste utföras under lämpliga biosäkerhetsåtgärder. För patienter som har testats som negativa för kända patogener ska du inte anta att prover inte är infektiösa och att lämpliga säkerhetsåtgärder därför fortfarande måste tillämpas. Avfallsprodukter som genereras av dessa material bör behandlas med samma säkerhetsföreskrifter och kasseras i enlighet med lokala regler.
<ol><li>Välj mellan de två typerna av mononukleära cellberedningsrör som använder antingen natriumcitrat eller natrium heparin som antikoagulantia. För många nedströmsapplikationer kan dessa två antikoagulantia användas omväxlande, men båda antikoagulantia bör testas innan de väljer en för studien.</li>
	<li>Etikett ett 8 ml mononukleärt cellberedningsrör som ska användas för bloduppsamling med patientens kodade ID. Förvara rören i rumstemperatur (18-25 °C).</li>
	<li>Förvara 1x PBS vid rumstemperatur (18-25 °C). Använd 30 ml per beredning.</li>
	<li>Se till att rören för separata plasmaprover och kryovialen för PBMC-provet är korrekt märkta med unika identifierare, enligt vad som anges i lämplig del av labbhandboken.</li>
	<li>Om PBMCs ska användas för att övervaka fosforylerade proteiner, bered PBS kompletterat med fosfatashämmare: blanda 5 ml PBS med 50 μL fosfatashämmare cocktail 2 + 50 μL fosfatashämmare cocktail 3. Förbered färsk och håll på is tills den används.</li>
	<li>Om PBMCs ska kryopreserveras, förbered 1 ml frysblandning per prov genom att blanda 90% FBS + 10% DMSO.</li>
</ol>2. PBMC-insamling(figur 1A)
<ol><li>Dra in 8 ml blod i det mononukleära cellberedningsröret med hjälp av den standardteknik som beskrivs av tillverkaren. Vänd försiktigt röret 8 till 10 gånger för att blanda antikoaguleringstillsatsen med blod. Skaka inte för att undvika hemolys. Registrera den tid då blodet drogs.</li>
	<li>Förvara röret upprätt vid rumstemperatur efter uppsamlingen tills centrifugationen är centrerad. Bearbeta proverna så snart som möjligt, helst inom en timme efter denna blodinsamling men senast 4 timmar efter insamling. Registrera tidpunkten när behandlingen av blodet påbörjas.</li>
	<li>Omedelbart före centrifugationen remixar blodprovet genom att försiktigt invertera röret 8 till 10 gånger till.</li>
	<li>Centrifugera röret/blodprovsrören i en horisontell rotor (utsvängt huvud) vid 1 500 – 1 800 x g i 30 min vid rumstemperatur (18–25 °C). Se till att alla rör är ordentligt balanserade.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg"> Figur 1: Allmän översikt över protokollet och representativa bilder av centrifugen. A)Schematisk översikt över protokollet för beredning av PBMCs och plasma. *Om det finns tidsbegränsningar kan steg 2.4 förkortas till 20 min och steg 3.3 till 3.6 kan tas bort. ** Ta en alikvot för att räkna celler, om det behövs. 2 extra centrifugeringssteg som krävs för ctDNA-analys/metabolomik(B)bild av en utsvängd huvudrotorcentrifugering inställd för steg 2.4. C)Rotorens bild, som innehåller två skopor som innehåller adaptrar för att snurra mononukleära cellberedningsrör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
OBS: x g (även kallad RCF, relativa centrifugalenheter) och RPM (varv per minut) är olika enheter. Var noga med att ställa in centrifugen för x g (RCF). Använd onlinekalkylatorn (se Materialförteckning)för konverteringen. Om endast rotor med fast vinkel är tillgänglig, utför detta steg i 10 min vid 1 500 – 1 800 x g.
<ol start="5"><li>Efter centrifugation, kontrollera om det finns ett mörkrött skikt under barriären (som mestadels innehåller röda blodkroppar) och 2 lager ovanför barriären. Det översta lagret är plasma (halmfärgad) och det vita lagret under är den buffiga kappan som innehåller PBMCs. Dessa lager kan lätt särskiljas när du tittar på röret mot en mörk / svart bakgrund.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg"> Figur 2: Rör för att isolera PBMCs. (A) Bild av rören före centrifugering (steg 2.4), antingen tom (vänster) eller innehållande blod (höger). (B) Lyckad separation av PBMC-skiktet efter centrifugering (steg 2.5). (C) Bild av PBMC-skiktet efter centrifugering och lite plasma kvar för att säkerställa att alla PBMC samlas in (steg 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
OBS: Om dessa lager inte är synliga indikerar detta förmodligen ett fel vid inställning av centrifugeringsenheterna. Se till att rätt centrifugeringsadapter används och att rätt "x g" är inställda. Upprepa steg 2.4.
<ol start="6"><li>Omedelbart efter centrifugering, använd en serologisk pipett för att överföra ungefär hälften av plasman till ett märkt koniskt centrifugerör i 15 ml-storlek med lock, samtidigt som du är noga med att inte störa PBMC-skiktet (ca 4-5 ml). Förvara tillfälligt detta rör med plasma på våt is som ska användas senare i steg 4. Ställ åt sidan tills vidare.</li>
	<li>Samla hela PBMC-skiktet med en Pasteur-pipett genom att placera pipetten i celllagret och överför till ett annat koniskt centrifugerör i 15 ml-storlek med lock. Det är acceptabelt att också ta en liten mängd plasma, om det behövs, för att helt få allt PBMC-lager. Volymen är vanligtvis 1-2 ml. Fortsätt omedelbart med steg 3 nedan.</li>
</ol>3. PBMC tvättsteg
OBS: Syftet med tvättstegen är att späda ut och ta bort restplättar och plasma från PBMC-pelleten. Alla centrifugeringssteg ska utföras vid rumstemperatur (18-25 °C).
<ol><li>Tillsätt pbs i rumstemperatur i PBMC-röret för att få volymen till 15 ml. Sätt på röret. Blanda celler genom att försiktigt invertera röret 5 gånger.</li>
	<li>Centrifugera i 15 min vid 300 x g. Observera att detta är en mycket mildare centrifugation än den ursprungliga centrifugationen.</li>
	<li>Visualisera pelleten genom att titta på röret mot en mörk/svart bakgrund. Avlägsna supernatanten genom vakuumambition eller med en pipett (Bild 3A). Kassera supernatanten och lämna en volym på cirka 500 μL ovanför den vitaktiga färgade PBMC-pelleten.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg"> Figur 3: PBMC pellets. A)Pellet erhölls i första tvättsteget 3.3. (B) Pellet isolerad i den andra tvätten (steg 3.7). (C) Pellet med hög hemolyshalt från blod som bearbetats senare än 4 timmar från det bloddrag som isolerats i den andra tvätten (steg 3. 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<ol start="4"><li>Återanvänd cellpelleten genom att försiktigt pipetta upp och ner i rester av supernatanten.</li>
	<li>Lägg till ytterligare 1x PBS för att få volymen till 10 ml. Sätt på röret. Blanda cellerna genom att vända röret försiktigt 5x. Om cellräkning krävs i studieprotokollet går du till steg 3.5.1, om det inte krävs, gå direkt till steg 3.6.<ol>
<li>Ta en 40 μL alikvot av de återhängda cellerna och blanda med 40 μL trypanblått. Räkna de livskraftiga cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk cellräknare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugera fjädringen från steg 3,5 i 10 min vid 300 x g. Ta bort så mycket supernatant som rimligen är möjligt utan att störa cellpelleten.</li>
	<li>Ta försiktigt bort och kassera eventuellt kvarvarande supernatant ovanför cellpelleten genom att pipettera med en fin spets Pasteurpipett eller en mikropipett utan att störa cellpelleten. Lämna lite eller ingen vätska ovanför pelleten efter att ha slutfört detta steg. Om slutpunkten för detta protokoll är en PBMC-pellets flyttas till steg 3.8; Om slutpunkten är cryopreserved PBMCs gå till steg 3.10.</li>
	<li>Tillsätt 50 μL nytt PBS (eller det kompletterade PBS som bereds i steg 1.5 om tillämpligt på din ändpunkt) till pelleten och pipetten upp och ner försiktigt med hjälp av en mikropipett för att homogent återanvända alla celler. Överför hela cellfjädringen till en märkt 1,5 ml kryovial och lägg omedelbart på våt is tills proverna fryser.</li>
	<li>Frys de märkta proverna genom att placera dem i flytande kväve eller direkt i torris. Celler kan också frysas vid -80 °C frys med hjälp av cellfrysningslådor. I detta fall, förshilla lådorna helt i -80 °C innan du lägger till cellrören. Registrera den tid då cellpellets frystes. När cellerna fryser, förvara vid -80 °C, fartyget fruset på torr is.</li>
	<li>För att kryopreservera PBMCs kan du eventuellt återstjälla pelleten i 1 ml av frysblandningen (steg 1.6) och överföra till en märkt kryovial. Fortsätt enligt beskrivningen i steg 3.9, men i det här fallet är det bara acceptabelt att använda cellfrysningslådor för att frysa ner proverna. Överför till flytande kväve för frakt och lagring efter att ha varit i frysboxen i minst 24 timmar.</li>
</ol>4. Plasmaberedningssteg(figur 1A)
<ol><li>Efter -80 °C lagring av PBMC pellets, förbered nu plasma alikvoten som tillfälligt lagrades på våt is i steg 2.6. Utför följande centrifugeringssteg för att klargöra plasman om provets syfte är ctDNA-analys, annars gå direkt till steg 4.2.<ol>
<li>Centrifug plasman i 10 min vid 1 600 – 2 000 x g vid 4 – 8 °C i en rotor med fast vinkel (eller 15 min i en utsvängd rotor).</li>
		<li>Försiktigt pipett från plasma supernatant, var försiktig så att du inte stör någon pellet och överför till ett nytt 15 ml rör. Kassera röret som innehåller det pelleterade materialet.</li>
		<li>Centrifug plasman i 10 min vid 1 600 – 2 000 x g vid 4 – 8 °C i en rotor med fast vinkel (eller 15 min i en utsvängd rotor).</li>
		<li>Överför försiktigt plasma supernatanten till ett nytt 15 ml-rör, var noga med att inte störa något pelleterat material. Kassera röret som innehåller det pelleterade materialet. OBS: Om en kyld centrifuger inte finns tillgänglig, förvara cellerna på is i 5 minuter mellan varje snurr eller centrifugprover i ett kylrum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Överför plasma i 1 ml alikvoter till 5 färska 2 ml mikrorör. Använd färre än 5 injektionsflaska om det inte finns tillräckligt med plasma för att fylla 5 injektionsflaskar med 1 ml alikvoter och det förväntas att den sista injektionsflaskan innehåller mindre än 1 ml plasma. Om det finns mer än 5 ml plasma, kassera resten. Registrera den totala volymen plasma i varje rör.</li>
	<li>Frys omedelbart plasma alikvoterna upprätt genom att lagra dem vid -80 °C.</li>
</ol>5. Provtransport
<ol><li>Skicka både PBMC-pellets och plasmaprover på torris.</li>
	<li>Se till att provet inte tinas före och under transporten. Packa tillräckligt med torris med proverna för att säkerställa att de förblir frysta under hela leveransprocessen, med tanke på eventuella förseningar som kan uppstå under transporten.</li>
</ol>6. Helblods bestrålning och western blot-analys av DDR-biomarkörer(figur 4A)
OBS: Detta är en ex vivo behandling som inte kommer att krävas i de flesta fall i kliniken, men dessa experiment är en värdefull undersökande strategi för att hitta lämpliga kliniska biomarkörer. Blodprover bör behandlas så snart som möjligt vid insamling för att säkerställa bästa resultat.
<ol><li>Värm upp röntgenskåpet. Märk tre 15 ml-rör som 0, 0,2 respektive 7 Gy.</li>
	<li>Ta tre mononukleära cellberedningsrör som innehåller nypräst blod från en enda individ och efter att försiktigt ha inverterat rören 8 till 10 gånger överför du blodet till de tre 15 ml-rören.</li>
	<li>Placera 0,2 Gy-röret i röntgenskåpet, stäng dörren och applicera 0,2 Gy-dosen på röret genom att välja hyllnummer och dos. Applicera 7 Gy stråldos på 7 Gy-röret genom att justera den valda dosen i skåpet.</li>
	<li>Inkubera de tre rören vid 37 °C i en timme.</li>
	<li>Överför blodet tillbaka till de mononukleära cellberedningsrören och utför PBMC-förberedelseprotokollet som för en klinisk inställning från steg 2,4 till steg 3, 8.</li>
	<li>Tillsätt en volym lysbuffert kompletterad med proteas- och fosfatashämmare som motsvarar cellpelletvolymen (i detta fall 70 μL RIPA-buffert) till var och en av cellpellets, pipett upp och ner och inkubera på is i 10 minuter. Sonicate proverna om en ljuddatorn är tillgänglig (3 cykler, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), alternativt spruta proverna för att bryta nukleinsyrorna för att eliminera viskositet i provet.</li>
	<li>Centrifuga proverna i 10 minuter vid ≥ 15 000 x g, vid 4 °C. Överför varje supernatant till ett nytt 1,5 ml-rör, bedöm kvalitativt nivån av hemolys (visuell inspektion) och mät proteinkoncentrationen med vilken metod som helst.</li>
	<li>Blanda 40 μg totalt lysat med provbelastningsbuffert som innehåller SDS och provreducerande medel. Koka prover i 5 minuter i ett värmeblock.</li>
	<li>Ladda 20 μg av varje prov per körfält i duplikat i en 4-12% bis-tris proteingel och kör en SDS-PAGE.</li>
	<li>Efter separationen, överför proteinerna till ett nitrocellulosamembran med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system (20 V, 10 min) och blockera med 5 % mjölk i TBST.</li>
	<li>Skär membranet i relevanta molekylstorlekar och inkubera med de primära antikropparna över natten vid 4 °C (se Materialförteckning för antikroppar och utspädningar).</li>
	<li>Ta bort de primära antikropparna och tvätta membranen 3 gånger med TBST i 5 minuter vid rumstemperatur. Inkubera med hrp-konjugerade sekundära antikroppar i 45 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Tvätta 3 gånger med TBST i 5 min.</li>
	<li>Applicera ECL-reagenset och analysera de bilder som erhålls i förhållande till HRP-signalen.</li>
</ol>

Alla författare är eller var anställda och intressenter i AstraZeneca. VM är anställd på Acerta Pharma, äger aktier i AstraZeneca och Gilead Sciences.

Högkvalitativa preparat av PBMCs och plasma som kan beredas robust och reproducerbart vid kliniska prövningsplatser är ovärderliga för att informera kliniska prövningar perifera prediktiva och farmakodynamiska translationella biomarkör endpoints. Här har vi tillhandahållit ett kort, tydligt protokoll som tar itu med de typiskt problematiska stegen som hittills har varit sårbara för avrättningsfel i en klinisk prövningsinställning. Protokollet kan dock optimeras ytterligare för att uppfylla specifika krav, till exempel tidsbegränsningar på den kliniska platsen eller typ av nedströmsanalyser (se Kompletterande fil).
I detta syfte har vi visat hur man isolerar både PBMCs och plasma från helblod med hjälp av mononukleära cellberedningsrör för att producera frysta PBMC-pellets och fryst plasma som är lämpliga för en mängd olika nedströmsanalyser. Vi har uppmärksammat särskilt kritiska protokollsteg som inbegriper centrifugering och identifiering av PBMC-skiktet i steg 2.5 och PBMC-pellets i steg 3.3 och 3.6. Historiskt sett, där kliniska platser ofta har gått fel är att ställa in centrifugen till rätt enheter (förvirra ett RCF- eller x g-värde med ett RPM-värde), vilket fördröjer bearbetningen av blodprover, temperatur och närvaron av stora volymer PBS ovanför den frysta cellpelleten. I de flesta centrifugering kommer rotorer felaktigt att ange ett x g-värde som en RPM-inställning resultera i betydande undercentrifugering med ett resulterande dåligt definierat eller frånvarande PBMC-skikt och potentiellt oavsiktlig PBMC-kassering under tvättsteg på grund av ineffektiv cellpellets. Det finns dock en möjlighet att ett PBMC-skikt inte är synligt trots att man använder rätt centrifugationsinställningar och rotoradapter om patienten har utvecklat leukopeni. Detta tillstånd kan påverka patienter som är inskrivna i onkologiförsök på grund av kemoterapi eller strålbehandling och bör övervägas. En annan kritisk punkt som har klargjorts i protokollet är att prover måste bearbetas inom 1-2 h från bloddragningen för att minska risken för hemolys negativt påverka protokollet. Dessutom minskar risken för att ta prover under den första timmen av blodprovet ex vivovariation, vilket kan ha stor inverkan på avläsningar av farmakokinetik och på biomarkörer som påverkas av blodbevarande eller aktiva signalvägar, såsom det fall som visas i figur 4. Förseningar i provbehandlingen kan också ha en skadlig effekt på cellens livskraft om cellerna ska kryopreserveras34. En annan faktor som kan påverka både utbytet och föroreningen av röda blodkroppar är lagrings- och centrifugationstemperaturen, som bör hållas vid rumstemperatur (18-25 °C). Lägre temperaturer ökar densiteten hos densitetsgradientmediet, vilket resulterar i en högre grad av röd blodcells- och granulocytförorening eftersom dessa celler inte aggregerar också. Å andra sidan leder högre temperaturer till PBMCs fångade mellan aggregerade erytrocyter, vilket minskar utbytet avpreparatet 15,27,28. Och slutligen är det viktigt att högst 50-100 μL vätska finns med cellpelleten i kryovialen, eftersom detta negativt påverkar koncentrationen av eventuella proteinlysater som erhålls vid nedströms bearbetning av dessa PBMC-preparat. Ett överskott av vätska kommer att överdilera prover, vilket leder till lysater med mycket låg proteinkoncentration som inte är lämplig för biomarköranalys. Dessutom kommer bevarandet av eventuella ändringar efter översättningen att försämras, och lysens effektivitet kommer också att minskas avsevärt.
Mononukleära cellberedningsrör valdes eftersom de erbjuder det enklaste sättet att isolera både PBMCs och plasma i en enda bloddragning för kliniska prövningar med, enligt vår erfarenhet, utmärkt reproducerbarhet. Blodbehandlingen kräver inte högutbildade operatörer, och användningen av ett enda rör avlägsnar behovet av att späda ut blodet och dess överföring till ett annat rör, vilket minskar farorisken. förkortar protokollet på grund av att centrifugeringsstegen med bromsarna på. och alla reagenser finns i röret, vilket minskar variationen. Enligt vår erfarenhet uppväger dessa fördelar den högre kostnaden för dessa rör jämfört med andra klassiska metoder som endast omfattar användning av en densitetsgradientseparation medium27,28 (£ 410 per 60 enheter medan lymfoprep medium för 66 50-ml preparat är £ 215). De finns i två typer av antikoagulantia, heparin och citrat, som båda är jämförbara med att upprätthålla funktionaliteten hos de isolerade PBMCs35, därför kommer valet av ett antikoagulantia över det andra att baseras på eventuell påverkan av heparin eller citrat i nedströmsmarkörstudierna. Även om det har visats att EDTA-rör ger det högsta PBMC-isoleringsutbytet jämfört med heparin eller citrat13, är fördelen med enkel användning av manipuleringen av endast ett rör denna hänsyn. Om cytokiner ska analyseras kan antikoagulantia ha en effekt av de nivåer som detekteras i plasma, därför bör båda antikoagulantia testas innan de väljs ut för den kliniskaprövningen 36. Om plasman ska användas för metabolomikstudier, skulle heparin som antikoagulantia föredras37. Därför är den enda punkt som lämnas till slutanvändaren eller översättningsforskaren för kliniska prövningar huruvida citrat eller heparin kommer att vara lämpligare för deras ändamål när kostnaderna har bedömts.
Medan fördelarna med att använda cellberedningsrör är många jämfört med de begränsningar de utgör (högre kostnad och tillgänglighet för ett begränsat utbud av antikoagulantia), kan den huvudsakliga begränsningen av användningen av PBMCs eller plasma för att erhålla PD-biomarkörer i kliniska prövningar, särskilt i onkologi, vara orelaterad till isoleringsmetoden. Med undantag för hematologiska cancerformer, där tumör tas direkt från perifert blod, för andra cancerindikationer är plasma och PBMCs surrogatvävnader som inte nödvändigtvis efterliknar den primära tumören. Perifer vävnad får inte dela genomet och epigenomet med den primära tumören, därför är perifer analys av biomarkörer beroende av en specifik tumörmutation huvudsakligen begränsad till ctDNA-analys (från plasma) eller CTC (genom efterföljande sortering av PBMC-skiktet). Dessutom kan signalering kaskader köra eller bidra till tumör spridning kanske inte vara lika aktiv i perifert blod. Denna utmaning kan övervinnas genom att tillämpa biomarkörupptäcktsmetoder riktade motblod 8 för att identifiera alternativa biomarkörer eller koppling ex vivo behandlingar på isolering av plasma38 och PBMCpreparat 26.
I det nuvarande protokollet kan frysta PBMC-pellets enkelt bearbetas utanför den kliniska platsen för att ge proteinlysat som kan utvärderas med västerländsk blotting eller ELISA-tekniker. Alternativa metoder för att använda PBMCs för att möjliggöra IHC-metoder har också presenterats(kompletterande fil). Dessutom har vi också specificerat möjligheten att cryopreserving PBMCs (se Kompletterande fil)för immuncellsövervakning, en relevant applikation inom onkologi, med immun checkpoint-hämmare och ADCs som alltmer testas i kliniska prövningar. Bedömningen av immunfunktioner som ADCC16 och immunophenotyping är applikationer som är kompatibla med kryopreserverade PBMCs isolerade från mononukleära cellberedningsrör15. Det finns en varning om kryopreservation, eftersom det kan främja nedreglering av vissa yt- och interna markörer och kan försämra vissa cellfunktioner, men PBMC kryopreservation är det enda möjliga sättet att utföra dessa analyser på grund av tidsbegränsningar vid hantering av prover från flera kliniska platser till bearbetningen i externalaboratorier 14,15, och dessa skadliga effekter kan övervinnas kraftigt genom bra upptiningsmetoder och viloperioder39.
Sammanfattningsvis kommer protokollet som tillhandahålls här att möjliggöra tillförlitlig beredning av PBMCs och plasmaprover i alla kliniska institutioner med gemensam utrustning och material så att translationella effektmått från perifert blod kan aktiveras på ett robust sätt i globala kliniska prövningar.
Slutligen visar vi hur analysen av PBMC-lysater mekanistiskt kan informera svaret på DNA-skadliga medel genom att visa en dosberoende postöversättningsmodifiering av viktiga DDR-faktorer, som kan användas för att forma klinisk utveckling. Framåtblickande, implementering av metoder som är mer kvantitativa än western blotting (t.ex. masspektrometri40) och kräver mindre insatsmaterial (t.ex. kapillär western blotting och ELISA) skulle bidra till att föra dessa prekliniska resultat mot en mer robust och systematisk utvärdering av PBMC-patientprover.

Läkemedelsutveckling syftar till att leverera nya terapier som tillgodoser icke tillgodosedda medicinska behov och mer riktad, personlig medicin. Flera läkemedelsmekanismer är under aktiv undersökning inklusive enzymatisk hämning såsom kinas1,proteas2, eller poly (ADP-ribose) polymeras (PARP) hämmare3,proteinnedbrytare4, terapeutiska antikroppar5, och antikroppskonjugerade läkemedel (ADC)6, bland många andra. Ett exempel på ansträngningarna att få bättre behandlingar inom onkologi är användningen av kinashämmare med målet att stoppa signalkaskaderna som håller cancercellerna prolifererande1,7. Att mäta de nivåer av substratfosforylering som är specifika för dessa kinaser är den bästa farmakodynamiska biomarkören för att kvantifiera verkningsmekanismen hos dessa hämmare8. Andra läkemedel kan modulera uttrycket av ett visst protein, och i så fall är det av största vikt att kunna kvantifiera förändringarna i koncentrationen av deras målprotein längsgående under behandlingens gång. Oberoende av egenskaperna hos ett läkemedel eller en patologi är därför utvärdering av biomarkörer för att fastställa farmakokinetik (PK)/ farmakodynamik (PD) förhållandet mellan läkemedelsexponering och målmodulering den bästa praxisen i tidig klinisk utveckling och möjliggör bestämning av en säker och tolererad farmakologiskt aktiv dos / schema9.
Medan i onkologi klinisk utveckling, biomarkör analys i tarmbiopsier kan vara den bästa inställningen för att fastställa bevis på mekanismen för ett läkemedel, antalet tillgängliga tarmbiopsier i en studie är vanligtvis ganskabegränsad 10,11. Alternativt är perifera blodprover mycket värdefulla för kliniska prövningar eftersom de involverar ett minimalt invasivt förfarande, är snabba och lätta att få underlätta longitudinell analys, är billigare än tarmbiopsier och ger omfattande information för realtidsövervakning av resultatet av en behandling. En ytterligare fördel med att bedöma PD-biomarkörer i perifert blod är förmågan att använda biosamplet för att även kvantifiera PK vilket möjliggör exakthet vid bestämning av PK/PD kvantitativa relationer och efterföljande PK/PD-modellering12,13. Perifera mononukleära celler i perifert blod (PBMCs) från helblod kan isoleras för att studera proteinmarkörer, som antingen upplever förändringar i uttrycksnivån eller i deras postöversättningsändringar. Dessutom kan PBMCs användas för immunophenotypingändamål 14,15, immun funktionalitet analyser såsom bedömning av antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC)16 och epigenetisk analys genom RNA isolering. På samma sätt kan plasma från helblod användas för att kvantifiera cytokiner för att karakterisera en patients immunologiska svar, för att utföra metaboliska studier och även för att isolera och sekvensera cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) för övervakning av klonurvalet av sjukdom under urval från det terapeutiska medlet, vilket ofta ger en mekanistisk grund för behandlingsresistens17,18,19 möjliggör utveckling av efterföljande generationer av terapeutiska20. Slutligen möjliggör isolering av cirkulerande tumörceller (CTC) från perifert blod utvärdering av sjukdomsprogression genom longitudinell uppräkning, DNA/RNA-sekvensering och protein-biomarköranalys21. Även om denna isolering är kompatibel med protokollet som beskrivshäri 22, gör det låga överflöd av CTC i många cancertyper och tidiga stadier av sjukdomen användningen av specialiserade rör mer lämpliga för att minimera CTC-nedbrytning23.
Under de senaste åren har användningen av flytande tarmbiopsier förbättrat informationen som erhållits i kliniska prövningar och PBMC-samlingar har inkluderats i många studier för att övervaka målengagemang och bevis på mekanism antingen direkt i tumörceller för vissa typer av hematologiska maligniteter, eller på PBMCs själva som PD-surrogater avtumörceller 24,25,26. Beredningen av högkvalitativa prover påverkar positivt avgörandet av den säkraste och mest effektiva behandlingen för en viss patologi, men enligt vår erfarenhet har kvaliteten på PBMC-preparat som erhållits från olika kliniska platser utsatts för stor variation i kvalitet vilket resulterar i prover som inte är lämpliga för analys nedströms. Detta har påverkat mängden PD-data som skulle kunna samlas in från dessa studier.
Här beskriver vi i detalj ett lätt att följa protokoll som visar hur man effektivt isolerar både PBMCs och plasmaprover från en enda bloddragning i en klinisk miljö. Protokollet är baserat på instruktionerna från tillverkaren av de mononukleära cellberedningsrören, som innehåller modifieringar där verklig erfarenhet har belyst svårigheter i protokollutförandet som rapporterats av kliniska platser, såsom centrifugationsproblem, bearbetningsfördröjningar och provöverföring till kryovials. Det finns alternativa kommersiellt tillgängliga metoder för användning av mononukleära cellberedningsrör baserade på densitetsgradientseparation med polysackaridlösningar med eller utan en barriär som skiljer lösningen från blodet27. Om den relevanta kliniska platsen redan är väl erfaren i dessa alternativa metoder, detta protokoll kan accepteras ersätta med dessa. I sådana fall kan två faktorer beaktas: vissa alternativa metoder kräver överföring av helblod från ett uppsamlingsrör till ett separat beredningsrör där en ytterligare överföring av humant primärbiologiskt material kan utgöra en något ökad säkerhetsrisk, och framgången för metoder utan hinder som skiljer blodet från polysackaridlösningen förlitar sig på kritiska steg som att skikta blodprovet på det densitetsgradientmedium som kräver utveckling av en förfinad teknisk expertis som inte alltid finns i en laboratoriemiljö på sjukhus. Trots ovanstående punkter är den totala lönsamheten och cellåtervinningen jämförbara mellan dessa tekniker15,28. Valet av metodik är därför något beroende av tidigare teknisk erfarenhet, men i våra händer kan mononukleära cellberedningsrör användas framgångsrikt i ett brett kliniskt sammanhang och är annars vår rekommendation.
Medan en slutpunkt i detta protokoll är att producera PBMC pellets för vidare bearbetning till lysater, kan andra slutliga tillämpningar av PBMC-samlingen genomföras, såsom isolering av nukleinsyror, eller produktion av PBMC-fläckar eller PBMC-block lämpliga för immunohistokemi (IHC) metoder. Viktigt, eftersom varje biosampel som tas från patienter representerar ett invasivt förfarande på åtminstone en viss nivå, maximerar detta protokoll det användbara materialet från varje prov genom att också isolera plasma som kan användas för cytokinanalyser, metabolomiska studier eller ctDNA-sekvensering.
Analysen av perifera biomarkörer i onkologiförsök är en av de många applikationerna av PBMC lysates. Ett exempel är utvärderingen av DNA-skaderesponsen (DDR) i behandlingar som kemoterapi, strålbehandling eller användning av hämmare av enzymer som är involverade iDDR,såsom fosfatidylinositol-3 kinasrelaterade kinaser (PIKKs)7 och PARPs3,13. Syftet med dessa behandlingar är att öka DNA-skadorna i prolifererande celler, vilket genererar hög toxicitet i celler med nedsatta DDR-mekanismer och cellcykelkontroller, såsom cancerceller. Här presenterar vi ett exempel med en studie av DDR-biomarkörer i perifert blod som utsätts för röntgenstrålar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

Analys av biomarkörer i perifert blod blir allt viktigare i kliniska prövningar för att fastställa bevis på mekanism för att utvärdera effekter av behandling, och hjälpa till att vägleda dos och schema inställning av terapier. Från en enda bloddragning kan perifera blodmonukleära celler isoleras och bearbetas för att analysera och kvantifiera proteinmarkörer, och plasmaprover kan användas för analys av cirkulerande tumör-DNA, cytokiner och plasmametabolomik. Longitudinella prover från en behandling ger information om utvecklingen av en given protein markör, mutationsstatus och immunologiska landskap av patienten. Detta kan endast uppnås om bearbetningen av perifert blod utförs effektivt på kliniska platser och proverna bevaras ordentligt från säng till bänk. Här presenterar vi ett optimerat allmänt protokoll som kan implementeras på kliniska platser för att erhålla PBMC-pellets och plasmaprover i kliniska multicenterförsök, som kommer att göra det möjligt för kliniska proffs i sjukhuslaboratorier att framgångsrikt tillhandahålla högkvalitativa prover, oavsett deras tekniska expertis. Alternativa protokollvariationer presenteras också som är optimerade för mer specifika analysmetoder nedströms. Vi tillämpar detta protokoll för att studera proteinbiomarkörer mot DNA-svar (DDR) på röntgenbestrålat blod för att visa lämpligheten av tillvägagångssättet i onkologiinställningar där DDR-läkemedel och/ eller strålbehandling har praktiserats samt i prekliniska stadier där mekanistisk hypotestestning krävs.

För att förbättra kvaliteten på PBMC-preparat i våra kliniska prövningar har vi genererat ett protokoll med koncisa, tydliga steg som kan följas av sjukhuslaboratoriets proffs, oberoende av deras molekylärbiologiska bakgrund och laboratoriefärdigheter. Vi har anpassat tillverkarens protokoll med ändringar på de steg där exekveringsproblem har identifierats eller rapporterats från kliniska platser som är involverade i olika kliniska prövningar med flera center. Protokollet kan dock optimeras ytterligare för att uppfylla specifika krav, till exempel tidsbegränsningar på den kliniska platsen eller typ av nedströmsanalyser (se Kompletterande fil). Vi visar att DDR kan analyseras i PBMCs genom att titta på specifika biomarkörer på DNA-skador som genereras av strålning.
De vanligaste frågorna vi har fått från kliniska platser gäller centrifugationsstegen, som direkt påverkar att framgångsrikt kunna isolera PBMCs och få den slutliga PBMC-pelleten. Att använda lämplig typ av utsvängd huvudrotorcentrifug(figur 1B,C)är nyckeln till protokollets framgång. Men när endast en rotorcentrifug med fast vinkel finns tillgänglig på den kliniska platsen föreslår vi att du utför steg 2.4 i en rotor med fast vinkel vid samma RCF som för en utsvängd huvudrotor men i endast 10 minuter. Detta säkerställer att ett PBMC-skikt separeras från plasman (se figur 2B,C). Medan skiktning av blod på ett densitetsgradientseparationsmedium kräver en broms-off centrifugering, kan blod i mononukleära cellberedningsrör centrifugeras med bromsar på grund av närvaron av en gelbarriär i röret som säkerställer bevarandet av PBMC-skiktet separerat från de tätareblodkomponenterna 27,28.
Minst 4 ml högkvalitativ, icke-utspädd plasma erhölls från centrifugation av blod i 8 ml rörformat, vilket kan förtydligas ytterligare för dess användning i specialiserade analyser såsom ctDNA-sekvensering eller metabolomikstudier29,30 (valfria steg 4. 1.1-4.1.4). Mängden isolerade PBMCs, storleken på pellets och hemolys eller röda blodkroppar kontaminering har varit andra problem som kommer från kliniska platser och erfarenhet analysera prover. Antalet celler som erhålls från 8 ml blod var varierande beroende på patient- och sjukdomsinställning, men i allmänhet är den erhållna pelleten liten i storlek och av en genomskinlig/vit färgning (figur 3A, B). På grund av dessa egenskaper är det viktigt att visualisera pelleten mot en mörk bakgrund för att undvika dess oavsiktliga aspiration under tvättstegen (2.5 och 3.3). Ibland kan pellets ha viss röd färgning på grund av förorening av röda blodkroppar (Figur 3C), och detta har en negativ effekt på preparatets kvalitet. För att undvika att förlora små pellets som de som visas i figur 3underlättas överföringen av PBMC-pelleten till en kryovial genom steg 3.7 där PBMC-pelleten återanvänds i 50 μL PBS.
Det typiska utbytet när du använder dessa rör och blod från friska individer varierar mellan 7 till 21 x 106 celler för 8 ml och en cellåterhämtning mellan 70 och 80% eftersom det är vår erfarenhet och som det tidigare harvisats 27,28. Detta beror på både de enskilda cellantalen och operatorn och det är jämförbart med de cellnummer och cellåterställningsvärden som erhålls med andra metoder med hjälp av densitetsgradient (inklusive system som använder rör med en separationsbarriär)15,27,28. Ett belysande exempel på variationen på antalet PBMCs isolerade med denna metod beroende på sjukdomsinställning är analysen av PBMC markörer i kronisk lymfatisk leukemi (CLL) patienter. Antalet celler som återfanns från ett 8 ml mononukleärt cellpreparatrör vid applicering av detta protokoll varierade från 1, 62 x 104 till 1, 99 x 109 i 45 prover från 7 patienter i studien NCT0332827331 (tabell 1). En relaterad parameter är proteinkoncentrationen av PBMC-lysaterna som erhålls med denna metod, och detta beror på antalet isolerade celler och proteinextraktionens effektivitet. Cellpelletsen i avsnitt 6 genererades med RIPA-buffert och ultraljudsbehandling (steg 6, 6). Återsuspension av cellpellets i samma volym lysbuffert resulterar vanligtvis i en rad koncentrationer från 3 till 10 mg/ml, och i detta speciella exempel var lysatkoncentrationerna 6, 8, 8, 3 respektive 8, 6 mg/ml för 0, 0, 2 respektive 7 Gy. Detta utsätts dock för en hög variabilitet när man tar prover från kliniska platser som inte har förberetts optimalt, patientens sjukdom och närvaron av hemoglobin från röda blodkroppar. Till exempel måste mycket små pellets återanvändas i en volym lysbuffert som är större än cellpelletvolymen för att möjliggöra både proteinkoncentrationsmätning och nedströms biomarköranalys, vilket resulterar i mer utspädda prover. I sådana fall, om en provkoncentration är under 1 mg/ml kan detta utgöra en utmaning att utföra analyser som western blot på grund av denna höga utspädningsfaktor. I de CLL-prover som tidigare nämnts varierade däremot volymen lysbuffert som tillsattes för att återanvända cellpelletsen från 50 till 500 μL och proteinkoncentrationen varierade från 1, 62 till 19,77 mg/ml (tabell 1).
När prover uppvisar kontaminering av röda blodkroppar eller hemolys (figur 3C) överskattas proteinkoncentrationen av PBMC-lysatet på grund av att hemoglobin inkluderas från erytrocyterna. Detta är anledningen till att man bör göra en visuell inspektion och anteckning av sådana prover, enligt beskrivningen i steg 6.7 i protokollet. Lastprov i överskott kan kompensera för förekomsten av hemoglobin vid biomarköranalys i den mån en belastningskontroll ingår i analysen. Andra mer kvantitativa metoder för att mäta hemolys skulle kunna implementeras, såsom mätning av absorbans vid 414 nm32.
DDR analyserades i PBMCs erhölls efter detta kliniska protokoll. För att illustrera en situation som efterliknar DNA-skadliga kliniska behandlingar som strålbehandling eller kemoterapi utsattes helblod från friska frivilliga ex vivo för röntgenstrålning (figur 4A). Joniserande strålning (IR) såsom röntgenstrålar inducerar olika typer av DNA-skador, inklusive DNA-dubbelsträngsbrott (DSB). DNA-skadeavkänning av dessa skador aktiverar PIKK: er såsom ataxi-telangiectasia muterade (ATM), ATM och Rad3-relaterade (ATR) och DNA-beroende proteinkinas (DNA-PK), som engagerar DNA-reparationsmekanismer som homolog rekombination (HR) eller icke-homolog end joining (NHEJ). Aktivering av atm genom närvaro av DSB sker genom rekrytering till platser av skada av MRN (MRE11-RAD50-NBS1) komplexet, orsakar ATM autofosforylering vid flera rester inklusive Ser1981. Aktiverad ATM fosforylerar i sin tur komponenterna i MRN-komplexet och andra proteiner som histonvarianten H2AX på Ser139 (där pSer139-H2AX också kallas γH2AX) för att främja en strukturell förändring av kromatin som sträcker sig från DSB vilket underlättar rekryteringen av andraDDR-faktorer 33. PBMCs är lyhörda för joniserande strålning trots deras låga spridningshastighet och masspektrometrimetoder har tillåtit kvantifiering av uppregleringen av fosforylerad Ser635 på RAD50 med bankomat. Denna fosforylering reduceras i närvaro av ATM-hämmare och RAD50 pS635 har validerats ytterligare som farmakodynamisk biomarkör för kliniska ATM-hämmare behandlingar i tumörer av immunohistokemi8. För att utvärdera pbmcs reaktion på strålning utsattes blod från friska frivilliga för olika IR- doser och prover samlades in efter en inkubation på 1 timme vid 37 °C (figur 4A). För detta ändamål överfördes blod till plaströr för att undvika att minska utbytet av PBMC-isoleringen på grund av hög temperatur (steg 6.2). Vi analyserade hur bankomat aktiverades inte bara genom att titta på den tidigare rapporterade RAD50 pS635 utan även ATM pS1981 och γH2AX. I de tre fall som undersöktes observerades en ökning av dessa ändringar efter översättningen vid högre IR- doser(figur 4B). Intressant nog var fosforyleringen av ATM och RAD50 betydande vid den låga dosen av 0,2 Gy, vilket tyder på att dessa post-translationella modifieringar kan bli feasibly förhörda som PD biomarkörer för behandlingar som involverar generering av DNA DSB med ett bra dynamiskt intervall, inte bara i tumör prover utan i perifert blod. Detta möjliggör övervakning av PD-svaret på behandlingen genom att förvärva longitudinella prover genom behandling. Tidpunkten från blodprovet till bearbetningen av proverna är avgörande för att säkerställa att dessa signalkaskader fortfarande är aktiva eftersom förseningar i bearbetningen kommer att påverka kinetiken hos sådana kaskader och man kan missa de fosforyleringshändelser som används som fosfomarkörer.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> Figur 4: PBMCs som isolerats från ex vivo bestrålat blod enligt detta kliniska protokoll visar biomarkörer för att informera om omfattningen av de DNA-skador som orsakas av behandlingen. A)Schematisk översikt över protokollet för beredning av PBMCs och analys av DDR vid bestrålning i helblod. *2 extra centrifugeringssteg krävs för ctDNA-analys/metabolomik. (B) Western blot visar dosberoende uppreglering av DDR fospho-biomarkörer i PBMCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prov</td>
			<td>Antal PBMCs/ 8 ml blod</td>
			<td>Kompletterad RIPA-buffertvolym (μL)</td>
			<td>Slutlig koncentration (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.1 (på 1)</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.2 (på 2)</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.3 (på 1990)0</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.4 (på 1999)</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.5 (på 1990)0</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.6 (på 1990)0</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.7 (på 1997)</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.8 (på 1990)0</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.9 (på 9)</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1 (född 1)</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2 (född 1992)</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3 (född 1933)</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4 (född 1944)</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5 (född 1955)</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6 (född 1966)</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7 (född 1977)</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8 (född 1988)</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.1 (på 1)</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2 (på 2)</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3 (på 3)</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.4 (på 1990-0</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.5 (på 1990)2</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.6 (på 1990-0</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.1 (på 1)</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.2 (på 2)</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.3 (på 1999)</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.4 (på 1999)</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.5 (på 1999)</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.6 (på 1999)</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.1 (E.1)</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.2 (E.2)</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.3 (E.3)</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1 (F.1)</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.2 (F.2)</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3 (F.3)</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4 (F.4)</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5 (F.5)</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6 (F.6)</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.1 (på 1)</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.2 (på 2)</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.3 (på 1990)2</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.4 (på 1990)2</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.5 (på 1990)2</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.6 (på 1990)2</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.7 (på 1997)</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Longitudinella PBMC-prover motsvarande 7 patienter</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Cellnummer och proteinkoncentration av PBMC pellets från kronisk lymfatisk leukemi patienter (CLL). De data som presenteras i denna tabell motsvarar 45 PBMC-prover från 7 KLL-patienter som deltar i studien NCT03328273 som samlats in i mononukleära cellberedningsrör. Dessa är originaldata som genereras med hjälp av prover från den citerade studien31.
Kompletterande fil: Alternativa protokollalternativ. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Detta protokoll beskriver kliniskt genomförbar beredning av högkvalitativa PBMC och plasma biosamples vid den kliniska prövning webbplats som kan användas för translationell biomarkör analys.

Beredning av perifert blod mononukleära cellpellets och plasma från en enda bloddragning vid kliniska prövningsplatser för biomarköranalys

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

PBMC och plasma prover är enkla att förvärva och mycket informativa i tidig klinisk utveckling. Detta robusta protokoll minimerar den föranalysvariation som införs på kliniska platser. Detta protokoll är snabbt och enkelt, vilket kräver grundläggande labbutrustning och minimal operatörsexpertis för att bearbeta blodet till PBMCs och plasma.Det är kompatibelt med upptagna labbdagar på sjukhus. Nedströms analys av blodkomponenter som härrör från detta protokoll kan informera farmakokinetiska och farmakodynamiska relationer, läkemedelsdos schemaläggning och bevis på mål engagemang och ge insikter om läkemedelsmekanismer av åtgärder, stödja både realtid och introspektiv analys. Vi använder detta protokoll för onkologistudier, speciellt för att analysera DNA-skaderesponsmekanismer.Material som samlas in av detta protokoll kan dock vara relevanta inom många sjukdomsområden och flera terapeutiska metoder. Efter att ha fått åtta milliliter donatorblod per prov, registrera vid vilken tidpunkt blodet drogs och vänd försiktigt varje rör åtta till tio gånger innan du överför de antikoagulantiabehandlade blodproverna till vart och ett av de rör som är märkta för strålning. För kliniska prover, centrifugera rören direkt efter invertering av dem.Placera de 0,2 grå rören i ett förvärmt röntgenskåp, stäng dörren och applicera en 0,2 grå dos på rören. Ersätt de bestrålade rören med låg dos med de sju grå rören och justera dosen för att applicera en sju grå stråldos på högdosbestrålningsproverna. Efter att båda proverna har bestrålats, inkubera alla tre rören vid 37 grader Celsius i en timme.Överför proverna till cellberedningsrör innan du separerar cellerna med höghastighetscentrifugering och se till att enheterna ställs in som x g eller motsvarande RCF. Efter centrifugationen, se rören mot en mörk bakgrund för att identifiera plasma, röda blodkroppar och buffy coat lager. Använd en serologisk pipett, överför ungefär hälften av plasman till en märkt 15 milliliter konisk centrifuger utan att störa det buffy pälsskiktet och förvara plasmaröret på våt is.Använd sedan en betespipett för att överföra hela PBMC som innehåller buffy coat-skikt till ett nytt 15 milliliter rör och tillsätt rumstemperatur PBS till PBMC till en slutlig volym på 15 milliliter per prov. Blanda försiktigt cellerna genom inversion fem gånger och samla cellerna genom centrifugering vid lägre hastighet, se till att kontrollera centrifugeringsenheterna. Aspirera alla utom de sista 500 mikroliter supernatanten utan att störa pelletsen.Tillsätt färsk PBS till en slutlig volym på 10 milliliter till varje rör och återanvänd genom att försiktigt invertera rören. Använd 40 mikroliter alikvoter av cellerna för att räkna. Efter räkning, samla cellerna med en annan centrifugation och ta bort så mycket supernatant som möjligt utan att störa pelletsen.För att lagra PBMC för senare bearbetning, återanvänd pelletsen i 50 mikroliter färsk PBS per prov med mild pipetting och överför varje hel cellupphängning till en märkt 1,5 milliliter kryovial på våt is. Flasha sedan frysa cellerna med den föredragna metoden och placera dem i en frysbox på minus 80 grader. Registrera den tidpunkt då cellerna frystes.Alternativt kan pelletsen återanvändas i en milliliter eller frysa blandningen per prov och cellupphängningen överförs till enskilda märkta kryovialer. Placerade sedan rören och förkylda frysboxar för minus 80 grader Celsius lagring. För att frysa plasman, tillsätt upp till en milliliter alikvoter mycket plasma till upp till var och en av fem två milliliter mikrorör utan att störa restpelleten och registrera den totala volymen plasma i varje rör.Frys sedan omedelbart plasma alikvoterna i upprätt orientering i en minus 80 grader Celsius frys. För västerländsk fläckanalys av proverna, återanvänd pelleten i varje rör med en lämplig volym lysbuffert kompletterad med proteas- och fosfatashämmare som är lika med cellpelletvolymens med mild pipetting och inkubera cellproverna i 10 minuter på is. I slutet av inkubationen, överför proverna till 1,5 milliliter rör och sonikera dem med tre 30 sekunder på 30 sekunder av cykler vid fyra grader Celsius.Samla proverna genom centrifugering och överför supernatanterna till nya 1,5 milliliterrör. Blanda sedan 40 mikrogram per prov med laddningsbuffert och koka proverna i fem minuter. Ladda 20 mikrogram av varje prov per körfält i duplicerat i en 4-12%Bis-Tris proteingel och kör en SDS-PAGE.Antalet celler som erhålls från åtta milliliter blod varierar beroende på patient- och sjukdomsinställning. I allmänhet är cellpelleten liten i storlek och transparent vit i färg. Ibland kan pelletsen ha viss förorening av röda blodkroppar, vilket har en negativ effekt på preparatets kvalitet.Ett typiskt utbyte från en kronisk lymfatisk leukemi patient med detta protokoll varierar från 1,62 gånger 10 till fjärde till 1,99 gånger 10 till nionde celler per åtta milliliter mononukleära cell förberedelse med en slutlig protein koncentration som sträcker sig mellan 1,62 till 19,77 milligram per milliliter. I denna representativa analys av tre patienter prover observerades en ökning av post-translationella modifieringar vid högre joniserande strål doser. Intressant nog var fosforylering av ataxi-telangiectasia muterad och RAD50 betydande vid den låga dosen av 0,2 grå, vilket tyder på att dessa post-translationella modifieringar kan vara feasibly förhörda som farmakodynamiska biomarkörer för behandlingar som omfattar generering av DNA dubbelsträng bryter med ett bra dynamiskt intervall i tumör, liksom perifera blodprover.För en optimal provberedning, bearbeta blodet inom en timme efter uppsamling vid rumstemperatur, centrifuga proverna korrekt och visa röret mot den mörka bakgrunden för att kunna skilja den buffy kappan.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Snabb fraktionering och isolering av helblod Components i prover från en gemenskapsbaserad inställning

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Implantation och perifera immunceller Övervakning av II-45 syngena Rat mesoteliom Modell

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In vitro- analyser för att bedöma blod-hjärnbarriären Mesh-liknande fartygsformation och störning

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Upprepade blodinsamling från svans åder av icke-sövda råttor med ett System för insamling av vakuum blod

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Rutinmässig Screening metod för mikropartiklar i trombocyttransfusioner

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analys av cellulära sammansättningen i avancerade aterosklerotiska lesioner av glatt muskulatur Cell härstamning-Tracing möss

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidig flödescytometrisk karakterisering av flera cell typer Hämtad från mushjärna/ryggmärg genom olika Homogeniseringsmetoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Övervakning PD-1-Blockerande antikroppar bundna till T-celler som härrör från en droppe perifert blod

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

Utvärdering av en point-of-care testanalysator för mätning av perifera blodleukocyter

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Repetitiv blodprovtagning från den subklaviska venen hos medveten råtta

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...