Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Støtte fra NIH (tilskud R21 EB023106, R44 HL139248 og R01 HL126802), af Leducq foundation (projekt RHYTHM) og en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) er taknemmeligt anerkendt.

Alle beskrevne metoder er blevet udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskers velfærd. Forskning blev godkendt af Institution Review Board (IRB) på The George Washington University.
BEMÆRK: Donor menneskelige hjerter blev erhvervet fra Washington Regional Transplant Fællesskabet som afidentificeret kasseret væv med godkendelse fra George Washington University IRB. Explanted hjerter er kardioplegisk anholdt ved at skylle hje...

<ol>
	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic?+An+industry+perspective.">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li><li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias.">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).</li><li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip.">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening:+Special+focus+on+IK1.">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes.">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559 (2010).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168 (2019).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117 (2019).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies.">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Her præsenterer vi trin-for-trin metoder til at opnå levedygtige hjerte skiver fra kardioplegically anholdt menneskelige hjerter og funktionelt karakterisere skiver ved hjælp af dobbelt optisk kortlægning af transmembrane potentiale og intracellulære calcium. Med bevaret ekstracellulært miljø og native celle-celle kobling, kan menneskelige hjerteskiver bruges som en nøjagtig model af det menneskelige hjerte for grundlæggende videnskabelig opdagelse og for effektivitet og kardiotoksicitet test af farmakologiske a...

Dyremodeller har været et værdifuldt redskab, der anvendes til at forstå de underliggende mekanismer i menneskers fysiologi og patofysiologi, samt en platform for indledende test af behandlinger til behandling af forskellige sygdomme1. Der er gjort store fremskridt inden for biomedicinsk forskning baseret på disse dyreforsøg2. Der er dog betydelige forskelle mellem forskelligearter mellem humane og animalske fysiologier, herunder mus, rotter, marsvin, kaniner, får, svin og hunde3,4. Som et resultat, der har været mange lægemidler, gen, og celle behandlinger, der viste lovende under dyreforsøg fase, men undlod at leve op til resultaterne i kliniske forsøg5. At bygge bro over denne kløft, isolerede hjerte myocytter og human induceret pluripotente stamceller (iPSCs) blev udviklet som modeller til at teste reaktionen af human fysiologi til forskellige lægemidler og sygdomme6. Stamcelleafledte kardiomyocytter har været meget udbredt i organ-on-a-chip systemer som et surrogat for hjertet6,7,8. Nytten af iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) hæmmes imidlertid af deres relativt umodne fænotype og den manglende repræsentation af kardiomyocyt-delpopulationen. det modne myokardi er en kompleks struktur bestående af flere samektiske celletyper såsom fibroblaster, neuroner, makrofager og endotelceller. På den anden side, isolerede menneskelige kardiomyocytter er elektrisk modne, og forskellige cardiomyocyt subpopulationer kan opnås ved at ændre dyrkning parametre9. Stadig, disse myocytter generelt udviser ændret handling potentielle morfologier på grund af manglen på celle-celle kobling, hurtig afdædisisering, og forekomsten af proarytmisk adfærd in vitro10,11. Nogle af begrænsningerne blev behandlet af 3D cellekultur modeller af iPSC-CMs og hjerte myocytter. Disse modeller, som omfatter sfæroider, hydrogel stillads indkapslet 3D-kulturer, manipuleret hjertevæv (EHTs), og hjerte-på-en-chip-systemer, bruge flere hjertecellepopulationer såsom kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selvsamle eller samle langs et stillads til at danne 3D-strukturer, og nogle endda reproducere den komplekse anisotropiske karakter af myokardiet. Disse modeller er blevet rapporteret at have celler af modne fænotyper, kontraktile egenskaber, og molekylære profiler svarende til hjertevæv. Hjerte-på-en-chip-systemet giver også mulighed for at studere systemiske virkninger i test af lægemidler og sygdomsmodeller. In vitro-cellebaserede modeller mangler imidlertid den oprindelige ekstracellulære matrix og kan derfor ikke nøjagtigt efterligne elektrofysiologi på organniveau. Menneskelige hjerte skiver, derimod, har en intakt ekstracellulær matrix og indfødte celle-til-celle kontakter, hvilket gør dem nyttige for mere præcist at undersøge arytmogene egenskaber af det menneskelige myokardi.
Forskere har udviklet humane karditoypiske skiver som en fysiologisk præklinisk platform for akut og kronisk lægemiddeltest og til at studere hjerteelektrofysiologi og hjertesygdomsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Sammenlignet med iPSC-afledte kardiomyocytter replikerer humane hjerteskiver mere trofast voksne humane hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocytfænotype. Sammenlignet med isolerede humane kardiomyocytter udviser hjerteskiver fysiologiske virkningsgrader på grund af den velbevarede cellecellekobling og den iboende eksistens af deres oprindelige intra- og ekstracellulære miljøer.
Denne protokol beskriver processen med at generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, udføre akut (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dage lange) undersøgelser for at teste hjerteelektrofysiologi parametre via optisk kortlægning. Mens denne protokol beskriver kun brugen af venstre ventrikelvæv (LV), er det blevet anvendt med succes på andre områder af hjertet samt andre arter såsom mus, rotter, marsvin og svin14,,20,,21,22. Vores laboratorium bruger hele menneskelige donor hjerter, der er blevet afvist til transplantation i de sidste 5 år, men det er muligt for de samme procedurer, der skal udføres på enhver donor hjerte prøve væv opnået ved hjælp af alternative midler (f.eks venstre venttrikulær hjælpeenhed [LVAD] implantationer, biopsier, myectomies), så længe væv har evnen til at blive opdelt i terninger. Optisk kortlægning anvendes til analyse i denne undersøgelse på grund af sin evne til samtidig at kortlægge optiske actionpotentialer og calciumtransienter med høj rumlig (100 x 100 pixels) og tidsmæssig (>1.000 frames/s) opløsning. Alternative metoder kan også anvendes, såsom multielektrode arrays (MEAs) eller mikroelektroder, men disse teknikker er begrænset af deres relativt lave rumlige opløsninger. Derudover blev MEA'er designet til brug sammen med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere til brug med hele hjerter eller store vævskiler.
Målet med artiklen er at gøre det muligt for flere forskere at bruge humane hjertevæv til hjerteelektrofysiologiundersøgelser. Det skal bemærkes, at den teknologi, der er beskrevet i denne artikel er relativt enkel og gavnlig for kortsigtede undersøgelser (i størrelsesordenen flere timer til dage). Mere fysiologisk biomimetisk kultur for længerevarende undersøgelser (i ugerækkefølgen) er blevet drøftet og beskrevet i en række andre undersøgelser12,18,23. Elektrisk stimulation, mekanisk belastning, og væv stretching er fordelagtige konditionering mekanismer, der kan hjælpe med at begrænse starten af in vitro væv remodellering12,,18,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

Human hjerte skive præparater er for nylig blevet udviklet som en platform for human fysiologi undersøgelser og terapi test for at bygge bro mellem dyr og kliniske forsøg. Talrige dyre- og cellemodeller er blevet brugt til at undersøge virkningerne af narkotika, men disse reaktioner er ofte forskellige hos mennesker. Menneskelige hjerte skiver giver en fordel for test af lægemidler i, at de er direkte afledt af levedygtige menneskelige hjerter. Ud over at have bevaret flercellede strukturer, celle-celle kobling, og ekstracellulære matrix miljøer, kan humant hjertevæv skiver bruges til direkte at teste effekten af utallige lægemidler på voksne menneskelige hjertefysiologi. Hvad adskiller denne model fra andre hjerte præparater, såsom hele hjerter eller kiler, er, at skiver kan blive udsat for mere langsigtet kultur. Som sådan, hjerte skiver mulighed for at studere de akutte såvel som kroniske virkninger af narkotika. Endvidere, evnen til at indsamle flere hundrede til tusind skiver fra et enkelt hjerte gør dette til en high-throughput model til at teste flere lægemidler i varierende koncentrationer og kombinationer med andre lægemidler på samme tid. Skiver kan fremstilles fra en given region af hjertet. I denne protokol beskriver vi forberedelsen af venstre ventrikelskiver ved at isolere vævsterninger fra venstre ventrikelfri væg og skære dem i skiver ved hjælp af en højpræcisions vibrerende mikrotom. Disse skiver kan derefter enten blive udsat for akutte eksperimenter til at måle baseline hjerte elektrofysiologiske funktion eller dyrkes for kroniske lægemiddelundersøgelser. Denne protokol beskriver også dobbelt optisk kortlægning af hjerteskiver til samtidige registreringer af transmembrane potentialer og intracellulære calciumdynamik for at bestemme virkningerne af de lægemidler, der undersøges.

Humane organotypiske skiver blev indsamlet fra venstre hjertekammer af en donor menneskelige hjerte i henhold til protokollen beskrevet ovenfor og illustreret iFigur 1. Et optisk kortsystem med to kameraer som det iFigur 2blev brugt i den opretstående billeddannelse konfiguration til at udføre samtidig optisk kortlægning af spænding og calcium omkring 1 time efter afslutningen af udskæringen protokol. Data blev analyseret ved hjælp af RHYTHM1.2 (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Denne protokol beskriver proceduren for dyrkning og dyrkning af menneskelige hjerteskiver til præklinisk lægemiddeltest og beskriver brugen af optisk kortlægning til registrering af transmembranespænding og intracellulære calciumsignaler samtidigt fra disse skiver.

Præklinisk hjerteelektrofysiologivurdering ved dobbelt spænding og calciumoptisk kortlægning af humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Denne protokol er betydelig, fordi det giver forskerne færdigheder til at ansætte donor menneskelige hjerter til prækliniske fysiologiske drug test. Dette væv udnytter både spænding og calcium farvestoffer til samtidig karakterisering af hjerte handling potentialer og intracellulære calcium transienter i humant væv skiver. For at oprette det optiske kortlægningssystem skal du fastgøre et vævsbad med et bundpopomethylsiloxangellag til et perfusionssystem og cirkulere en liter genvindingsopløsning ved 37 grader Celsius iltet med 100 % ilt gennem perfusionssystemet ved en strømningshastighed, der er hurtig nok til at opretholde temperaturen og forhindre ophobning af badperbrændstof.Brug derefter et mål til at justere fokus og justering af de to CMOS-kameraer og bruge en grøn LED-lyskilde med en 520 plus eller minus fem nanometerbølgelængde til at ophidse spændingsfølsomme og calcium indikator farvestoffer samtidigt. Før opnå væv sektioner, bland frosne og flydende cardioplegia opløsning og placere hjertevæv i den iskolde cardioplegia bad og identificere den venstre ventrikel fri væg. Lim den forlavede agarosegel på bagsiden af metalvævsholderne i vibratomen.Skær en centimeter kubik blokke af væv i kold cardioplegic løsning og bruge aktuel hud klæbemiddel til hurtigt at montere væv blokke på metalvæv indehavere med endocardial overflader vender opad. Overfør metalholderne ind i vibratomebadet af iskoldt iltet udskæringsopløsning, så vævene er helt nedsænket, og flyt klingen til vævets forkant. Tænd for vibratome at begynde udskæring med de forudindstillede parametre, kassere de første flere skiver, indtil bladet når ud over trabeculae i glat endocardial væv.Når forsøgsvævet er nået, overføres hver skive omhyggeligt til individuelle 100 mikrometeret nylonnetcellespier i en kulturskål, der indeholder rumtemperaturen, der iltes Tyroders genvindingsopløsning, og dæk skiverne med meshskiver for at holde vævsskiverne fra curling. Når alle skiverne er opsamlet, overføres hver skive omhyggeligt til individuelle brønde af en seks-brøndplade, der indeholder tre milliliter PBS pr. brønd. Skyl skiven med blid rokkende og gentag denne proces tre gange med frisk steril PBS, før prøverne overføres til individuelle brønde af en seks-brøndplade indeholdende tre milliliter 37 grader Celsius kulturmedium pr. brønd.Derefter placere pladen på en orbital shaker på 20 omdrejninger i minuttet i en befugtet inkubator ved 37 grader, 30% ilt, og 5% kuldioxid. Efter 20 minutters inkubation i recovery løsning til friskskårne skiver eller umiddelbart efter dyrkning, forsigtigt overføre skive af interesse til perfusion system væv bad og pin ned de fire hjørner til gel lag, mens anvende minimal strækning til vævet. Lad skiverne hvile i dette bad med cirkulerende genvindingsopløsning i ca. 10 minutter, før der tilsættes 0,3 til 0,5 mikroliter af bestanden Blebbistatin til reservoiret for genvindingsopløsning.Mens skiven inkuberer i Blebbistatin, rekonstitueres 30 mikroliter af bestanden spænding følsomme farvestof i en milliliter af nyttiggørelse løsning ved 37 grader. Efter 10 minutters behandling med Blebbistatin slukkes pumperne, og der indlæses langsomt 0,2 til 0,3 milliliter arbejdsfarveopløsning på skivens overflade over en periode på 30 sekunder. Efter 90 sekunder tændes pumperne for at vaske overskydende farvestof ud.Efter at have uddøt skiven med stock calcium indikator som netop vist, fokusere kameraerne på skiven og tempo skiven på en hertz med en to millisekund puls bredde varighed på 1,5 gange amplitude af den forudbestemte pacing tærskel. Placer en dækslæd over vævsskiven, og belys skiven med LED-excitationslyskilden. Derefter optage de udsendte spændings- og calciumsignaler med kameraerne på 1.000 billeder i sekundet.At betingelse spænding og calcium optiske kortlægning data, i den relevante analyse software, skal du klikke betingelse parametre og fjerne baggrunden. Juster derefter signalkonditioneringsparametrene for at opnå optimalt virkningspotentiale og calciumtransientspor. Hvis du vil beregne ledningshastigheden, skal du vælge aktiveringskort og angive et start- og sluttidspunktet for at omfatte et enkelt handlingspotentiale i sporingen.Klik derefter på det regionale kort, og vælg det område, der er af interesse for at få vist aktiveringskortet for det valgte område. Vælg derefter oversigtshastighedskort og vælg start- og sluttidserne. Juster værdierne for mellempixelopløsning baseret på opsætningen efter behov.Klik på generér vektortilknytning for at vælge et område af interesse og vise ledningshastighedsvektorerne inden for det pågældende område. Middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af vektorer, der indgår i analysen, samt den gennemsnitlige overførselsvinkel af ledningshastighedsvektorerne i det valgte område vises. Hvis du vil beregne aktionspotentialevarigheden, skal du vælge aktionspotentiale, calciumtransient-varighedskort og vælge start- og sluttidserne for at omfatte ét fuldt handlingspotentiale.Klik derefter på beregning af den potentielle varighed for regional handling for at vælge et område af interesse og for at generere handlingspotentiale-varighedsoversigten. For at bestemme stigningstiden skal du vælge stigningstid og vælge start- og sluttidserne for at vælge opslaget på et enkelt handlingspotentiale eller calciumtransient. Angiv start- og slutprocentværdierne, og klik på beregn for at vælge det pågældende område og for at bestemme middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af pixel, der indgår i analysen af stigningstiden.For at bestemme calcium henfald, skal du vælge calcium henfald og indtaste start-og sluttidsstoffer til at omfatte hele henfald del af en enkelt calcium forbigående signal. Klik derefter på beregn tau for at vælge området af interesse og for at bestemme middelværdien, medianen, standardafvigelsen og antallet af pixel, der indgår i analysen af calcium henfaldstid konstant. I dette repræsentative eksperiment blev handlingspotentialet og calciumtransientspor signaleret.Aktiveringstiderne blev bestemt for hver pixel, og isokrone kort over aktiveringstiderne blev afbildet ud fra den konditionerede spænding og kalkspor. Ledningshastighedsvektorer blev beregnet ved hjælp af aktiveringstiderne og den kendte inter-pixel-opløsning. Calciumtransient henfaldskonstant blev målt ved at montere en polynomial på den rådnende del af calciumsporene.Den virkningspotnete varighed og calciumtransientens varighed blev målt som tidsvarigheden mellem aktiveringstiden og en bestemt procentdel af henholdsvis repolaliseringen eller calciumfjernelsen fra cytoplasmaet. Stigningstiderne for spændings- og calciumspor blev også målt og kortlagt. I denne repræsentative analyse blev doxorubicins virkning på hjerteledning testet, hvilket resulterede i en reduktion af den tværgående ledningshastighed.Det er vigtigt at sikre, at skiverne er i fuldstændig hjerte-karplegisk anholdelse for at minimere skader på vævet under udskæringen procedure og for at opnå levedygtige skiver. Ved protokollens afslutning kan skiverne fryses eller fastsættes til molekylær vurdering. De mekanistiske veje, der er involveret i det elektrofysiologiske fænomen af interesse, kan derefter bestemmes.Udvikling af denne menneskelige hjerte skive model har gjort det muligt at studere svarene på behandlinger og sygdom i humant hjertevæv bygge bro mellem dyr og kliniske undersøgelser. Når du arbejder med humant væv, mens du udfører denne teknik, skal du sørge for at bære den relevante PPE og tage andre nødvendige sikkerhedsforanstaltninger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Ved hjælp af ekstraordinære optisk Transmission at kvantificere hjerte biomarkører i humant Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Vurdering af kollagen og Elastin pres-afhængige Microarchitectures i Live, menneskelige modstand arterierne af Label-fri Fluorescens mikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto skimmel-baseret metode til stillads-gratis tre-dimensionelle hjerte væv skabelse

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Optisk billeddannelse af isolerede murine ventrikulære Myocytter

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fremstilling af 3D-hjertemikrovævarrays ved hjælp af humane iPSC-afledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Udvikling af 3D-organiseret humant hjertevæv inden for en mikrofluidisk platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...