Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Financiering door NIH (subsidies R21 EB023106, R44 HL139248 en R01 HL126802), door Stichting Leducq (project RHYTHM) en een American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) worden dankbaar erkend.

Alle beschreven methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor menselijk welzijn. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Institution Review Board (IRB) van de George Washington University.
OPMERKING: Donor menselijke harten werden verworven van Washington Regional Transplant Community als gedeidentificeerd weggegooid weefsel met goedkeuring van de George Washington University IRB. Explanted harten worden cardioplegisch gearrest...

<ol>
	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic?+An+industry+perspective.">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li><li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias.">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).</li><li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip.">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening:+Special+focus+on+IK1.">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes.">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559 (2010).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168 (2019).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117 (2019).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies.">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Hier presenteren we stapsgewijze methoden om levensvatbare cardiale plakjes te verkrijgen van cardioplegisch gearresteerde menselijke harten en om functioneel te karakteriseren de plakjes met behulp van dubbele optische mapping van transmembrane potentieel en intracellulaire calcium. Met een bewaard gebleven extracellulaire omgeving en inheemse celcelkoppeling kunnen menselijke hartsplakjes worden gebruikt als een nauwkeurig model van het menselijk hart voor fundamentele wetenschappelijke ontdekking en voor het testen va...

Diermodellen zijn een waardevol instrument dat wordt gebruikt voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van de menselijke fysiologie en pathofysiologie, evenals een platform voor het inleidende testen van therapieën voor de behandeling van verschillende ziekten1. Er zijn grote stappen gezet op het gebied van biomedisch onderzoek op basis van deze dierstudies2. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen soorten tussen menselijke en dierlijke fysiologie, waaronder muizen, ratten, cavia's, konijnen, schapen, varkens en honden3,4. Als gevolg hiervan zijn er tal van geneesmiddelen, gen en celtherapieën die belofte tijdens de dierproeven fase toonde, maar niet aan de resultaten in klinische studies5. Om deze kloof te overbruggen, werden geïsoleerde cardiale myocyten en door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC's) ontwikkeld als modellen om de respons van de menselijke fysiologie op verschillende geneesmiddelen en ziekten te testen6. Stamcel-afgeleide cardiomyocyten zijn op grote schaal gebruikt in organ-on-a-chip systemen als een surrogaat van het hart6,7,8. Het nut van iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) wordt echter belemmerd door hun relatief onrijpe fenotype en het gebrek aan representatie van de cardiomyocyte subpopulatie; het volwassen myocardium is een complexe structuur die bestaat uit verschillende naast elkaar bestaande celtypen zoals fibroblasten, neuronen, macrofagen en endotheelcellen. Aan de andere kant, geïsoleerde menselijke cardiomyocyten zijn elektrisch volwassen, en verschillende cardiomyocyte subpopulaties kunnen worden verkregen door het veranderen van culturing parameters9. Toch vertonen deze myocyten over het algemeen veranderde actie potentiële morfologieën als gevolg van het gebrek aan celcelkoppeling, snelle de-differentiatie en het optreden van proarritmisch gedrag in vitro10,11. Sommige van de beperkingen werden aangepakt door 3D-cel cultuur modellen van iPSC-CMs en cardiale myocyten. Deze modellen, waaronder sferoïden, hydrogel steiger ingekapseld 3D culturen, ontworpen hartweefsels (EHTs), en hart-op-een-chip systemen, gebruik maken van meerdere cardiale cel populaties zoals cardiomyocyten, fibroblasten, en endotheelcellen. Ze ofwel zelf monteren of monteren langs een steiger om 3D-structuren te vormen, en sommige zelfs reproduceren de complexe anisotropische aard van het myocardium. Deze modellen zijn gemeld te hebben cellen van volwassen fenotypes, contractiele eigenschappen, en moleculaire profielen vergelijkbaar met hartweefsel. Het heart-on-a-chip systeem maakt het ook mogelijk om systemische effecten te bestuderen in medicijntesten en ziektemodellen. In vitro celgebaseerde modellen missen echter de native extracellulaire matrix en kunnen daarom de elektrofysiologie op orgaanniveau niet nauwkeurig nabootsen. Menselijke cardiale plakjes, daarentegen, hebben een intacte extracellulaire matrix en inheemse cel-naar-cel contacten, waardoor ze nuttig voor een nauwkeuriger onderzoek van aritmogene eigenschappen van het menselijke myocardium.
Onderzoekers hebben menselijke cardiale organotypische plakjes ontwikkeld als fysiologisch preklinisch platform voor acute en chronische geneesmiddelentesten en om cardiale elektrofysiologie en hartziekteprogressie12,13,,14,15,16,17,18,19te bestuderen . In vergelijking met iPSC-afgeleide cardiomyocyten, menselijke cardiale plakjes meer trouw repliceren volwassen menselijke cardiale elektrofysiologie met een volwassen cardiomyocyte fenotype. In vergelijking met geïsoleerde menselijke cardiomyocyten vertonen hartsplakjes fysiologische werkingsmogelijkheden vanwege de goed bewaarde celcelkoppeling en het intrinsieke bestaan van hun inheemse intra- en extracellulaire omgevingen.
Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van menselijke hartschijfjes uit hele donorharten, het uitvoeren van acute (d.w.z. uren-lange) en chronische (dat wil zeggen, dagen-lange) studies om cardiale elektrofysiologie parameters te testen via optische mapping. Hoewel dit protocol alleen het gebruik van het linker ventriculaire (LV) weefsel beschrijft, is het met succes toegepast op andere delen van het hart, evenals andere soorten zoals muizen, ratten, cavia's en varkens14,20,21,22. Ons laboratorium maakt gebruik van hele menselijke donorharten die de afgelopen 5 jaar zijn afgewezen voor transplantatie, maar het is haalbaar dat deze zelfde procedures worden uitgevoerd op weefsels van donorhartmonsters die met alternatieve middelen zijn verkregen (bijvoorbeeld linker-ventriculaire hulpverlening [LVAD]-implantaties, biopsieën, myectomieën) zolang de weefsels de mogelijkheid hebben om in kubussen te worden gesneusd. Optische mapping wordt gebruikt voor analyse in deze studie vanwege de capaciteit om tegelijkertijd optische actiemogelijkheden en calciumtransiënten in kaart te brengen met een hoge ruimtelijke (100 x 100 pixels) en tijdelijke (>1.000 frames/s) resolutie. Alternatieve methoden kunnen ook worden gebruikt, zoals multi-elektrodenarrays (MEA's) of micro-elektroden, maar deze technieken worden beperkt door hun relatief lage ruimtelijke resoluties. Daarnaast zijn MEA's ontworpen voor gebruik met celculturen, en scherpe micro-elektroden worden gemakkelijker beheerd voor gebruik met hele harten of grote weefselwiggen.
Het doel van het artikel is om meer onderzoekers in staat te stellen menselijke cardiale weefsels te gebruiken voor cardiale elektrofysiologie studies. Opgemerkt moet worden dat de technologie beschreven in dit artikel is relatief eenvoudig en gunstig voor korte termijn studies (in de orde van enkele uren tot dagen). Meer fysiologische biomimetische cultuur voor studies op langere termijn (in de orde van weken) is besproken en beschreven door een aantal andere studies12,18,23. Elektrische stimulatie, mechanische belasting en weefselrekken zijn voordelige conditioneringsmechanismen die het begin van in vitro weefsel remodelleren12,18,23kunnen helpen beperken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

Menselijke cardiale slice preparaten zijn onlangs ontwikkeld als een platform voor menselijke fysiologie studies en therapie testen om de kloof tussen dier en klinische proeven te overbruggen. Tal van dier- en celmodellen zijn gebruikt om de effecten van drugs te onderzoeken, maar deze reacties verschillen vaak bij de mens. Menselijke cardiale plakjes bieden een voordeel voor het testen van geneesmiddelen in dat ze rechtstreeks zijn afgeleid van levensvatbare menselijke harten. Naast het behoud van meercellige structuren, celcelkoppeling en extracellulaire matrixomgevingen, kunnen menselijke hartweefselplakjes worden gebruikt om het effect van ontelbare geneesmiddelen op de menselijke hartfysiologie direct te testen. Wat dit model onderscheidt van andere hartpreparaten, zoals hele harten of wiggen, is dat plakjes kunnen worden onderworpen aan cultuur op langere termijn. Als zodanig, cardiale plakjes zorgen voor het bestuderen van de acute en chronische effecten van drugs. Bovendien, de mogelijkheid om enkele honderden tot duizend plakjes te verzamelen van een enkel hart maakt dit een high-throughput model om verschillende geneesmiddelen te testen in verschillende concentraties en combinaties met andere geneesmiddelen op hetzelfde moment. Plakjes kunnen worden bereid uit een bepaalde regio van het hart. In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van linker ventriculaire plakjes door weefselblokjes van de linker ventriculaire vrije muur te isoleren en ze in plakjes te snijden met behulp van een hoge precisie vibrerende microtome. Deze plakjes kunnen vervolgens worden onderworpen aan acute experimenten om baseline cardiale elektrofysiologische functie te meten of gekweekt voor chronische medicijnstudies. Dit protocol beschrijft ook dubbele optische mapping van cardiale segmenten voor gelijktijdige opnames van transmembrane potentialen en intracellulaire calciumdynamica om de effecten van de onderzochte geneesmiddelen te bepalen.

Menselijke organotypische plakjes werden verzameld uit de linker ventrikel van een donor menselijk hart volgens het hierboven beschreven protocol en geïllustreerd inFiguur 1. Een dubbele camera optische mapping systeem als dat inFiguur 2werd gebruikt in de rechtopstaande beeldvorming configuratie om gelijktijdige optische mapping van spanning en calcium uit te voeren ongeveer 1 uur na de voltooiing van het snijprotocol. Gegevens werden geanalyseerd met behulp v...

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Dit protocol is belangrijk omdat het onderzoekers de vaardigheden biedt om donormensenharten in dienst te nemen voor preklinische fysiologische drugstesten. Dit weefsel maakt gebruik van zowel spanning en calcium kleurstoffen voor de gelijktijdige karakterisering van cardiale actie mogelijkheden en intracellulaire calcium transiënten in menselijk weefsel plakjes. Om het optische kaartsysteem op te zetten, bevestigt u een weefselbad met een bodem polydimethylsiloxaangellaag aan een perfusiesysteem en circuleert u één liter hersteloplossing bij 37 graden Celsius zuurstofrijk met 100% zuurstof door het perfusiesysteem met een stroomsnelheid die snel genoeg is om de temperatuur te handhaven en de accumulatie van badperfuseren te voorkomen.Gebruik vervolgens een doel om de focus en uitlijning van de twee CMOS-camera's aan te passen en gebruik een groene LED-lichtbron met een golflengte van 520 plus of min vijf nanometer om de spanningsgevoelige en calciumindicatorkleurstoffen tegelijkertijd op te wekken. Voordat u weefselsecties verkrijgt, meng bevroren en vloeibare cardioplegiaoplossing en plaats het hartweefsel in het ijskoude cardioplegiabad en identificeer de linker ventriculaire vrije wand. Lijm de voorgemaakte agarosegel aan de achterkant van de metalen weefselhouders van het vibratome.Snijd een centimeter in blokjes gesneden blokken weefsel in koude cardioplegic oplossing en gebruik actuele huidkleef om snel monteren van de weefselblokken op de metalen weefselhouders met de endocardial oppervlakken naar boven gericht. Breng de metalen houders in het vibratome bad van ijskoude zuurstofhoudende snijden oplossing, zodat de weefsels volledig onder water en verplaats het mes naar de voorkant van het weefsel. Zet het vibratome aan om te beginnen met snijden met de vooraf ingestelde parameters, gooi de eerste verschillende plakjes totdat het blad verder reikt dan de trabeculae in het gladde endocardiale weefsel.Wanneer het experimentele weefsel is bereikt, zorgvuldig overbrengen van elk plakje in individuele 100 micrometer nylon mesh cell strainers in een cultuur schotel met kamertemperatuur zuurstofrijk Tyrode's herstel oplossing en bedek de plakjes met mesh ringen om het weefsel plakjes te houden van krullen. Wanneer alle plakjes zijn verzameld, breng je elk plakje voorzichtig over in afzonderlijke putten van een zesputige plaat met drie milliliter PBS per put. Spoel het plakje met zachte schommelen en herhaal dit proces drie keer met verse steriele PBS alvorens de monsters in individuele putten van een zes-put plaat met drie milliliter van 37 graden Celsius cultuurmedium per goed.Plaats de plaat vervolgens op een orbitale shaker met 20 omwentelingen per minuut in een bevochtigde couveuse bij 37 graden, 30% zuurstof en 5% kooldioxide. Na 20 minuten incubatie in hersteloplossing voor vers gesneden plakjes of onmiddellijk na het kweken, breng het plakje rente voorzichtig over naar het weefselbad van het perfusiesysteem en zet de vier hoeken vast aan de gellaag terwijl u minimale rek op het weefsel toepast. Laat de plakjes in dit bad ongeveer 10 minuten rusten met circulerende hersteloplossing voordat u 0,3 tot 0,5 microliter stock Blebbistatin toevoegt aan het reservoir van hersteloplossing.Terwijl de slice is uitbroeden in de Blebbistatin, reconstrueren 30 microliters van de voorraad spanning gevoelige kleurstof in een milliliter van herstel oplossing op 37 graden. Na 10 minuten behandeling van Blebbistatin, zet de pompen uit en laad langzaam 0,2 tot 0,3 milliliter werkende kleurstofoplossing op het oppervlak van de plak gedurende een periode van 30 seconden. Zet na 90 seconden de pompen aan om overtollige kleurstof uit te wassen.Na het sterven van de slice met voorraad calcium indicator zoals net aangetoond, focus de camera's op het segment en tempo van de slice op een hertz met een twee milliseconde puls breedte duur op 1,5 keer de amplitude van de vooraf bepaalde pacing drempel. Plaats een coverslip over het weefsel segment en verlicht het segment met de LED-excitatie lichtbron. Noteert vervolgens de uitgezonden spannings- en calciumsignalen met de camera's op 1.000 frames per seconde.Om de spannings- en calciumoptische toewijzingsgegevens in de juiste analysesoftware te conditioneren, klikt u op conditieparameters en verwijdert u de achtergrond. Pas vervolgens de parameters voor signaalconditionering aan om optimaal actiepotentieel en calciumtransientsporen te verkrijgen. Als u de geleidingssnelheid wilt berekenen, selecteert u activeringskaart en voert u een begin- en eindtijd in om één actiepotentieel in het spoor te omvatten.Klik vervolgens op regionale kaart en selecteer het interessegebied om de activeringskaart van het geselecteerde gebied weer te geven. Selecteer vervolgens de geleidingssnelheidskaart en selecteer de begin- en eindtijden. Pas de waarden van de interpixelresolutie aan op basis van de installatie als dat nodig is.Klik op vectorkaart genereren om een interessegebied te selecteren en de geleidingssnelheidsvectoren binnen dat gebied weer te geven. Het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal vectoren dat in de analyse is opgenomen, evenals de gemiddelde voortplantingshoek van de geleidingssnelheidvectoren in het geselecteerde gebied, worden weergegeven. Als u de potentiële duur van de actie wilt berekenen, selecteert u de potentiële duur van de actie, de calciumsale duurkaart en selecteert u de begin- en eindtijden om één volledig actiepotentieel te omvatten.Klik vervolgens op de berekening van de potentiële duur van regionale actie om een interessegebied te selecteren en om de actiepotentieelskaart te genereren. Om de stijgingstijd te bepalen, selecteert u de stijgingstijd en selecteert u de begin- en eindtijden om de upstroke van één enkele actiepotentieel of calciumtransient te selecteren. Voer de begin- en eindpercentagewaarden in en klik op berekenen om het interessegebied te selecteren en het gemiddelde, de mediaan, de standaarddeviatie en het aantal pixels te bepalen dat is opgenomen in de analyse van de stijgingstijd.Om het calciumbederf te bepalen, selecteer je calciumverval en voer je de begin- en eindtijden in om het gehele vervalgedeelte van een enkel calciumtransient signaal te omvatten. Klik vervolgens op tau berekenen om het interessegebied te selecteren en om het gemiddelde, mediaan, standaarddeviatie en het aantal pixels in de analyse van calciumbederftijdconstante te bepalen. In dit representatieve experiment werden het werkingspotentieel en calcium voorbijgaande sporen geconditioneerd.De activeringstijden werden bepaald voor elke pixel en isochronale kaarten van de activeringstijden werden uitgezet van de geconditioneerde spanning en calciumsporen. Geleidingssnelheidsvectoren werden berekend aan de hand van de activeringstijden en de bekende interpixelresolutie. De calcium voorbijgaande vervalconstante werd gemeten door een polynoom aan het rottende gedeelte van de calciumsporen te plaatsen.De actie potentiële duur en calcium voorbijgaande duur werden gemeten als de tijdsduur tussen de activeringstijd en een bepaald percentage van de re-polarisatie of calcium verwijdering van het cytoplasma respectievelijk. De stijgingstijden van de spanning en calciumsporen werden ook gemeten en in kaart gebracht. In deze representatieve analyse werd het effect van doxorubicine op cardiale geleiding getest, wat resulteerde in een vermindering van de transversale geleidingssnelheid.Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de plakjes in volledige cardioplegische arrestatie zijn om schade aan het weefsel tijdens de snijprocedure te minimaliseren en om levensvatbare plakjes te verkrijgen. Aan het einde van het protocol kunnen de plakjes worden ingevroren of gerepareerd voor moleculaire beoordeling. De mechanistische trajecten die betrokken zijn bij het elektrofysiologische fenomeen van belang kunnen dan worden bepaald.De ontwikkeling van dit menselijke cardiale segmentmodel heeft de studie van de reacties op behandelingen en ziekte in menselijk hartweefsel toegestaan die de kloof tussen dierlijke en klinische studies overbruggen. Bij het werken met menselijke weefsels tijdens het uitvoeren van deze techniek, moet u de juiste PBM dragen en alle andere noodzakelijke veiligheidsmaatregelen nemen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...