Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Die Finanzierung durch die NIH (Grants R21 EB023106, R44 HL139248 und R01 HL126802), durch die Leducq Foundation (Projekt RHYTHM) und ein American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) werden dankbar gewürdigt.

Alle beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Leitlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Die Forschung wurde vom Institution Review Board (IRB) an der George Washington University genehmigt.
HINWEIS: Spender menschliche Herzen wurden von Washington Regional Transplant Community als deidentifiziertes entsorgtes Gewebe mit Genehmigung der George Washington University IRB erworben. Explantierte Herzen werden kard...

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Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Methoden vor, um lebensfähige Herzscheiben aus kardioplegisch verhafteten menschlichen Herzen zu erhalten und die Scheiben funktionell mit Hilfe der doppelten optischen Kartierung von Transmembranpotenzial und intrazellulärem Kalzium zu charakterisieren. Mit einer erhaltenen extrazellulären Umgebung und nativer Zell-Zell-Kopplung können menschliche Herzscheiben als genaues Modell des menschlichen Herzens für grundlegende wissenschaftliche Entdeckungen und für Wirksamkeits- und ...

Tiermodelle sind ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der menschlichen Physiologie und Pathophysiologie, sowie eine Plattform für Vortests von Therapien zur Behandlung verschiedener Krankheiten1. Auf der Grundlage dieser Tierstudien wurden große Fortschritte auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung erzielt2. Es bestehen jedoch erhebliche Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Physiologien, einschließlich Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Schafen, Schweinen und Hunden3,4. Infolgedessen gab es zahlreiche Arzneimittel-, Gen- und Zelltherapien, die während der Tierversuche vielversprechend waren, aber den Ergebnissen in klinischen Studien nicht gerecht wurden5. Um diese Lücke zu überbrücken, wurden isolierte Herzmyozyten und vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) als Modelle entwickelt, um die Reaktion der menschlichen Physiologie auf verschiedene Medikamente und Krankheiten zu testen6. Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten sind weit verbreitet in Organ-on-a-Chip-Systemen als Ersatz des Herzens6,7,8verwendet worden. Die Nützlichkeit von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) wird jedoch durch ihren relativ unreifen Phänotyp und die mangelnde Repräsentation der Kardiomyozyten-Subpopulation behindert; Das reife Myokard ist eine komplexe Struktur, die aus mehreren koexistierenden Zelltypen wie Fibroblasten, Neuronen, Makrophagen und Endothelzellen besteht. Auf der anderen Seite sind isolierte menschliche Kardiomyozyten elektrisch ausgereift, und verschiedene Kardiomyozytensubpopulationen können durch Änderung der Kultivierungsparameter erhalten werden9. Dennoch weisen diese Myozyten in der Regel veränderte Wirkungspotentialmorphologien auf, da es an Zell-Zell-Kopplung, schneller Entdifferenzierung und dem Auftreten proarrhythmischen Verhaltens in vitro10,11fehlt. Einige der Einschränkungen wurden durch 3D-Zellkulturmodelle von iPSC-CMs und Herzmyozyten behoben. Diese Modelle, zu denen Sphäroide, Hydrogelgerüste, gekapselte 3D-Kulturen, technische Herzgewebe (EHTs) und Herz-auf-ein-Chip-Systeme gehören, verwenden mehrere Herzzellpopulationen wie Kardiomyozyten, Fibroblasten und Endothelzellen. Sie bauen sich entweder selbst zusammen oder montieren sich entlang eines Gerüstes zu 3D-Strukturen, und einige reproduzieren sogar die komplexe anisotrope Natur des Myokards. Diese Modelle haben Berichten zufolge Zellen von reifen Phänotypen, kontraktilen Eigenschaften und molekularen Profilen ähnlich wie Herzgewebe. Das Heart-on-a-Chip-System ermöglicht auch die Untersuchung systemischer Wirkungen in Medikamententests und Krankheitsmodellen. In vitro zellbasierten Modellen fehlt jedoch die native extrazelluläre Matrix und kann daher die Elektrophysiologie auf Organebene nicht genau imitieren. Menschliche Herzscheiben hingegen haben eine intakte extrazelluläre Matrix und native Zell-zu-Zell-Kontakte, was sie für eine genauere Untersuchung arrhythmogener Eigenschaften des menschlichen Myokards nützlich macht.
Forscher haben menschliche kardiale organotypische Scheiben als physiologische präklinische Plattform für akute und chronische Arzneimitteltests entwickelt und zur Untersuchung der Herzelektrophysiologie und der Herzkrankheitsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Im Vergleich zu iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten replizieren menschliche Herzscheiben die erwachsene menschliche Herzelektrophysiologie mit einem reifen Kardiomyozyten-Phänotyp getreuer. Im Vergleich zu isolierten menschlichen Kardiomyozyten weisen Herzscheiben aufgrund der gut erhaltenen Zell-Zell-Kopplung und der intrinsischen Existenz ihrer nativen intra- und extrazellulären Umgebungen physiologische Wirkungspotenziale auf.
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung menschlicher Herzscheiben aus ganzen Spenderherzen, die Durchführung akuter (d. h. stundenlanger) und chronischer (d. h. tagelanger) Studien zur Erprobung der Kardialelektrophysiologie-Parameter mittels optischer Kartierung. Während dieses Protokoll nur die Verwendung des linksventrikulären Gewebes (LV) beschreibt, wurde es erfolgreich auf andere Regionen des Herzens sowie andere Arten wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Schweine14,20,21,22angewendet. Unser Labor verwendet ganze menschliche Spenderherzen, die in den letzten 5 Jahren für eine Transplantation abgelehnt wurden, aber es ist möglich, dass dieselben Verfahren an allen Spenderherzprobengeweben durchgeführt werden, die auf alternative Weise gewonnen werden (z. B. linksventrikuläre Hilfsmittel [LVAD]-Implantationen, Biopsien, Myektomien), solange das Gewebe in Würfel geschnitten werden kann. Optisches Mapping wird in dieser Studie aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, optische Aktionspotentiale und Kalziumtransienten mit hoher räumlicher (100 x 100 Pixel) und zeitlicher Auflösung (>1.000 Frames/s) gleichzeitig abzubilden. Alternative Methoden können auch verwendet werden, wie Multielektroden-Arrays (MEAs) oder Mikroelektroden, aber diese Techniken sind durch ihre relativ geringen räumlichen Auflösungen begrenzt. Darüber hinaus wurden MEAs für die Verwendung mit Zellkulturen entwickelt, und scharfe Mikroelektroden sind einfacher für die Verwendung mit ganzen Herzen oder großen Gewebekeilen zu verwalten.
Ziel des Artikels ist es, mehr Forschern die Verwendung menschlicher Herzgewebe für die Kardialelektrophysiologie zu ermöglichen. Es sollte beachtet werden, dass die in diesem Artikel beschriebene Technologie relativ einfach und vorteilhaft für Kurzzeitstudien ist (in der Größenordnung von mehreren Stunden bis Tagen). Mehr physiologische biomimetische Kultur für längerfristige Studien (in der Größenordnung von Wochen) wurde diskutiert und beschrieben durch eine Reihe von anderen Studien12,18,23. Elektrische Stimulation, mechanische Belastung und Gewebedehnung sind vorteilhafte Konditionierungsmechanismen, die helfen können, den Beginn der In-vitro-Gewebe-Remodellierung12,18,23zu begrenzen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

Humane Herzscheibenpräparate wurden vor kurzem als Plattform für Studien zur menschlichen Physiologie und Therapietests entwickelt, um die Lücke zwischen tier- und klinischen Studien zu überbrücken. Zahlreiche Tier- und Zellmodelle wurden verwendet, um die Wirkung von Medikamenten zu untersuchen, aber diese Reaktionen unterscheiden sich oft beim Menschen. Menschliche Herzscheiben bieten einen Vorteil für Arzneimitteltests, da sie direkt von lebensfähigen menschlichen Herzen abgeleitet sind. Neben der Erhaltung multizellulärer Strukturen, Zell-Zell-Kopplung und extrazellulärer Matrixumgebungen können menschliche Herzgewebescheiben verwendet werden, um die Wirkung unzähliger Medikamente auf die menschliche Herzphysiologie bei Erwachsenen direkt zu testen. Was dieses Modell von anderen Herzpräparaten wie ganzen Herzen oder Keilen unterscheidet, ist, dass Scheiben längerfristig kulturgemäß kultiviert werden können. Als solche, Herzscheiben ermöglichen die Untersuchung der akuten sowie chronischen Auswirkungen von Medikamenten. Darüber hinaus macht die Fähigkeit, mehrere hundert bis tausend Scheiben von einem einzigen Herzen zu sammeln, dies zu einem Hochdurchsatzmodell, um mehrere Medikamente in unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen mit anderen Medikamenten gleichzeitig zu testen. Scheiben können aus jeder Region des Herzens zubereitet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von linksventrikulären Scheiben, indem wir Gewebewürfel von der linksventrikulären freien Wand isolieren und sie mit einem hochpräzisen vibrierenden Mikrotom in Scheiben schneiden. Diese Scheiben können dann entweder akuten Experimenten unterzogen werden, um die elektrische Ausgangsfunktion zu messen, oder für chronische Arzneimittelstudien kultiviert werden. Dieses Protokoll beschreibt auch die doppelte optische Kartierung von Herzscheiben für gleichzeitige Aufnahmen von Transmembranpotentialen und intrazellulärer Kalziumdynamik, um die Auswirkungen der untersuchten Medikamente zu bestimmen.

Menschliche organotypische Scheiben wurden aus der linken Herzkammer eines Spenders menschliches Herz gemäß dem oben beschriebenen Protokoll gesammelt und inAbbildung 1. Ein optisches Kartensystem mit zwei Kameras wie inAbbildung 2wurde in der aufrechten Bildgebungskonfiguration verwendet, um nach Abschluss des Schneidprotokolls eine simultane optische Kartierung von Spannung und Kalzium etwa 1 h durchzuführen. Die Daten wurden mit RHYTHM1.2 (<strong class="x...

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es Forschern die Fähigkeiten vermittelt, spendermenschliche Herzen für präklinische physiologische Arzneimitteltests einzusetzen. Dieses Gewebe nutzt sowohl Spannungs- als auch Kalziumfarbstoffe für die gleichzeitige Charakterisierung von kardialen Wirkungspotentialen und intrazellulären Kalziumtransienten in menschlichen Gewebescheiben. Um das optische Kartierungssystem einzurichten, befestigen Sie ein Gewebebad mit einer unteren Polydimethylsiloxan-Gelschicht an ein Perfusionssystem und zirkulieren Sie einen Liter Erholungslösung bei 37 Grad Celsius mit 100% Sauerstoff durch das Perfusionssystem bei einer Durchflussrate, die schnell genug ist, um die Temperatur zu halten und die Ansammlung von Badperfusate zu verhindern.Verwenden Sie dann ein Ziel, um den Fokus und die Ausrichtung der beiden CMOS-Kameras einzustellen und verwenden Sie eine grüne LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 520 plus oder minus fünf Nanometern, um die spannungsempfindlichen und Kalzium-Indikatorfarbstoffe gleichzeitig zu anregen. Vor der Gewinnung von Gewebeabschnitten, mischen Sie gefrorene und flüssige Kardioplegie-Lösung und legen Sie das Herzgewebe in das eiskalte Cardioplegiebad und identifizieren Sie die linksventrikuläre freie Wand. Kleben Sie das vorgefertigte Agarose-Gel an die Rückseite der Metallgewebehalter des Vibratom.Schneiden Sie einen Zentimeter gewürfelten Gewebeblöcke in kalter kardioplegischer Lösung und verwenden Sie topischen Hautkleber, um die Gewebeblöcke schnell auf die Metallgewebehalter mit den nach oben gerichteten Endokardenoberflächen zu montieren. Übertragen Sie die Metallhalter in das Vibratombad der eiskalten sauerstoffhaltigen Schneidlösung, so dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist und die Klinge an die Vorderkante des Gewebes bewegt. Schalten Sie das Vibratom ein, um mit dem Schneiden mit den voreingestellten Parametern zu beginnen, indem Sie die ersten mehrere Scheiben verwerfen, bis die Klinge über die Trabeculae hinaus in das glatte Endoskopgewebe reicht.Wenn das Versuchsgewebe erreicht ist, übertragen Sie jede Scheibe sorgfältig in einzelne 100 Mikrometer Nylon-Netzzellensiebe in einer Kulturschale, die Raumtemperatur enthält, die Wiederherstellungslösung von Tyrode mit Sauerstoff versorgt und die Scheiben mit Netzscheiben bedecken, um die Gewebescheiben vor dem Lockenziehen zu schützen. Wenn alle Scheiben gesammelt wurden, übertragen Sie sorgfältig jede Scheibe in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit drei Milliliter PBS pro Brunnen. Spülen Sie die Scheibe mit sanftem Schaukeln und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal mit frisch sterilem PBS, bevor Sie die Proben in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit drei Millilitern 37 Grad Celsius Kulturmedium pro Brunnen übertragen.Legen Sie die Platte dann mit 20 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad, 30 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid auf einen Orbital-Shaker. Nach 20 Minuten Inkubation in der Erholungslösung für frisch geschnittene Scheiben oder unmittelbar nach der Kultivierung, übertragen Sie vorsichtig die Scheibe von Interesse auf das Perfusionssystem Gewebebad und fixieren Sie die vier Ecken auf die Gelschicht, während minimale Dehnung auf das Gewebe. Lassen Sie die Scheiben in diesem Bad mit zirkulierender Rückgewinnungslösung für etwa 10 Minuten ruhen, bevor Sie 0,3 bis 0,5 Mikroliter Blebbistatin in das Reservoir der Rückgewinnungslösung hinzufügen.Während die Scheibe im Blebbistatin inkubiert wird, stellen Sie 30 Mikroliter des spannungsempfindlichen Farbstoffs in einem Milliliter Wiederherstellungslösung bei 37 Grad wieder her. Nach 10 Minuten Blebbistatin-Behandlung die Pumpen ausschalten und 0,2 bis 0,3 Milliliter Arbeitsfarbstofflösung über einen Zeitraum von 30 Sekunden langsam auf die Oberfläche der Scheibe laden. Schalten Sie nach 90 Sekunden die Pumpen ein, um überschüssigen Farbstoff auszuwaschen.Nach dem Absterben der Scheibe mit Stock-Calcium-Indikator, wie gerade gezeigt, fokussieren Sie die Kameras auf die Scheibe und tempoieren Sie die Scheibe bei einem Hertz mit einer Zwei-Millisekunden-Pulsbreite Dauer bei 1,5-facher Amplitude der vorgegebenen Temposchwelle. Legen Sie einen Deckelüberschlag über die Gewebescheibe und beleuchten Sie die Scheibe mit der LED-Anregungslichtquelle. Dann nehmen Sie die emittierten Spannungs- und Kalziumsignale mit den Kameras bei 1.000 Bildern pro Sekunde auf.Um die Spannungs- und Calcium-optischen Mapping-Daten zu konditionieren, klicken Sie in der entsprechenden Analysesoftware auf Zustandsparameter und entfernen Hintergrund. Passen Sie dann die Signalkonditionierungsparameter an, um ein optimales Aktionspotenzial und Kalziumtransientenspuren zu erhalten. Um die Leitungsgeschwindigkeit zu berechnen, wählen Sie die Aktivierungskarte aus, und geben Sie eine Start- und Endzeit ein, um ein einzelnes Aktionspotenzial in der Ablaufverfolgung zu umfassen.Klicken Sie dann auf regionales Land, und wählen Sie den gewünschten Bereich aus, um die Aktivierungskarte der ausgewählten Region anzuzeigen. Wählen Sie als Nächstes die Leitungsgeschwindigkeitskarte und die Start- und Endzeiten aus. Passen Sie die Werte für die Auflösung zwischen Pixeln je nach Einrichtung nach Bedarf an.Klicken Sie auf Vektorzuordnung generieren, um einen Interessenbereich auszuwählen und die Leitungsgeschwindigkeitsvektoren innerhalb dieses Bereichs anzuzeigen. Der Mittelwert, der Median, die Standardabweichung und die Anzahl der in die Analyse einbezogenen Vektoren sowie der durchschnittliche Ausbreitungswinkel der Leitungsgeschwindigkeitsvektoren in der ausgewählten Region werden angezeigt. Um die Aktionspotentialdauer zu berechnen, wählen Sie die Dauer des Aktionspotentials, die Karte der transienten Kalziumdauer aus, und wählen Sie die Start- und Endzeiten aus, um ein vollständiges Aktionspotenzial zu umfassen.Klicken Sie dann auf regionale Aktionspotenzialdauerberechnung, um eine Interessenregion auszuwählen und die Aktionspotenzialdauerzuordnung zu generieren. Um die Anstiegszeit zu bestimmen, wählen Sie die Anstiegszeit und die Start- und Endzeiten aus, um den Aufschlag eines einzelnen Aktionspotentials oder Kalziumtransienten auszuwählen. Geben Sie die Start- und Endprozentwerte ein, und klicken Sie auf Berechnen, um den Interessenbereich auszuwählen und den Mittelwert, den Median, die Standardabweichung und die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die in der Analyse der Anstiegszeit enthalten sind.Um den Calciumzerfall zu bestimmen, wählen Sie Kalziumzerfall und geben Sie die Start- und Endzeiten ein, um den gesamten Zerfallsanteil eines einzelnen Transientensignals zu umfassen. Klicken Sie dann auf Tau berechnen, um den Interessenbereich auszuwählen und den Mittelwert, den Median, die Standardabweichung und die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die in die Analyse der Kalziumzerfallszeitkonstante einbezogen sind. In diesem repräsentativen Experiment wurden das Wirkungspotential und die kalziumtransienten Spuren signalkonditioniert.Die Aktivierungszeiten wurden für jedes Pixel bestimmt und isochronale Karten der Aktivierungszeiten wurden aus den konditionierten Spannungs- und Kalziumspuren gezeichnet. Leitungsgeschwindigkeitsvektoren wurden anhand der Aktivierungszeiten und der bekannten Auflösung zwischen Pixeln berechnet. Die Calciumtransientenzerfallskonstante wurde gemessen, indem ein Polynom an den zerfallenden Teil der Kalziumspuren anpasste.Die Wirkungspotentialdauer und die transiente Calciumdauer wurden als Zeitdauer zwischen der Aktivierungszeit und einem bestimmten Prozentsatz der Repolarisation bzw. Kalziumentfernung aus dem Zytoplasma gemessen. Die Anstiegszeiten der Spannungs- und Kalziumspuren wurden ebenfalls gemessen und kartiert. In dieser repräsentativen Analyse wurde die Wirkung von Doxorubicin auf die Herzleitung getestet, was zu einer Verringerung der Transvergängigkeitsgeschwindigkeit führte.Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Scheiben in vollständiger kardioplegischer Verhaftung sind, um Schäden am Gewebe während des Schneidvorgangs zu minimieren und lebensfähige Scheiben zu erhalten. Am Ende des Protokolls können die Scheiben eingefroren oder zur molekularen Bewertung fixiert werden. Die mechanistischen Bahnen, die an dem elektrophysiologischen Phänomen von Interesse beteiligt sind, können dann bestimmt werden.Die Entwicklung dieses menschlichen Herzscheibenmodells hat es ermöglicht, die Reaktionen auf Behandlungen und Krankheiten im menschlichen Herzgewebe zu untersuchen, die die Kluft zwischen tierischen und klinischen Studien überbrücken. Achten Sie bei der Arbeit mit menschlichen Geweben während der Ausführung dieser Technik darauf, die entsprechende PSA zu tragen und alle anderen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Forschung

Biotechnik

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Verwendung von außergewöhnlichen optischen Übertragung kardiale Biomarker in humanem Serum quantifizieren

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...