Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

מימון על ידי NIH (מענקים R21 EB023106, R44 HL139248, ו R01 HL126802), על ידי הקרן Leducq (הפרויקט קצב) ו מלגת האיגוד האמריקני פוסט דוקטורט (19POST34370122) הם הכירו בהכרת תודה.

כל השיטות המתוארות בוצעו בהתאם לכל ההנחיות המוסדיים, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם. המחקר אושר על ידי המועצה לסקירת מוסד (IRB) באוניברסיטת ג'ורג ' וושינגטון.
הערה: ליבם האנושי של התורם נרכש מקהילת ההשתלות האזורית של וושינגטון כשזיהה רקמה שהושלכו באישור מאוניברסיטת ג'ורג '...

<ol>
	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic?+An+industry+perspective.">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li><li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias.">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).</li><li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip.">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening:+Special+focus+on+IK1.">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes.">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559 (2010).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168 (2019).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117 (2019).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies.">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

כאן, אנו מציגים שיטות צעד אחר צעד כדי לקבל פרוסות לב קיימא מן הלבבות עצר האדם לבבות ולאפיין פונקציונלית את הפרוסות באמצעות מיפוי אופטי כפול של פוטנציאל טרנסקרום וסידן תאיים. עם סביבה משומרת מועלת ומשולבת תאים תא התא, פרוסות לב האדם יכול לשמש כמודל מדויק של הלב האנושי לגילוי מדעי בסיסי וליע...

דגמי בעלי חיים היו כלי רב ערך המשמש להבנת המנגנונים הבסיסיים של הפיזיולוגיה האנושית והפתופסולוגיה, כמו גם פלטפורמה לבדיקה ראשונית של טיפולים לטיפול במחלות שונות1. צעדים גדולים נלקחו בתחום המחקר הביו-רפואי המבוסס על לימודי בעלי חיים אלה2. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין המינים קיימים בין הפיזיווגיות אנושיות ובעלי חיים, כולל עכברים, חולדות, שרקנים, ארנבים, כבשים, חזירים וכלבים3,4. כתוצאה מכך, היו הרבה תרופות, גנים, וטיפולים סלולריים שהראה הבטחה במהלך השלב בדיקות בעלי חיים, אך נכשל לחיות עד התוצאות בניסויים קליניים5. כדי לגשר על פער זה, לב מבודד מאוציטים ותאי גזע המושרה האדם pluriפוטנטי (iPSCs) פותחו כמודלים כדי לבדוק את התגובה של הפיזיולוגיה האנושית לתרופות ומחלות שונות6. תאי גזע מבוססי לב נגזר בשימוש נרחב במערכות עוגב-על-שבב כפונדקאית של הלב6,7,8. עם זאת, השימושיות של הקרדיוציטים הנגזרות (iPSC-CMs) מופרעת על ידי הפנוטיפים הילדותיים שלהם וחוסר ייצוג של אוכלוסיית הקרדיוומיציט; שריר הלב בוגרת הוא מבנה מורכב מורכב מספר סוגים של תאים הקיימים כגון פיברותקיעות, נוירונים, מקרופאגים, ותאי אנדותל. מצד שני, הקרדיוציטים האנושיים הבודדים הם בוגרים בחשמל, ואוכלוסיות שונות של הקרדיוציט ניתן להשיג על ידי שינוי פרמטרים של culturing9. עדיין, אלה מיוציטים בדרך כלל התערוכה משתנה פוטנציאל פעולה מורפולוגיות בשל העדר צימוד תא תא, מהיר בידול, והתרחשות של התנהגות proפרעות בחוץ מתורבת10,11. חלק מההגבלות טופלו על ידי מודלים של תרבות התא 3D של iPSC-CMs ומיציטים הלב. מודלים אלה, הכוללים spheroids, פיגום הידרוג'ל שעברו תרבויות תלת-ממד, מהונדסים רקמות לב (EHTs), ומערכות לב-על-שבב, להשתמש באוכלוסיות מרובות תאי לב כגון קרדיוטיציטים, פיברוטיטים ותאי אנדותל. הם או להרכיב או להרכיב לאורך פיגום ליצירת מבנים תלת ממדיים, וחלקם אפילו לשכפל את הטבע אניסוטרופי המורכב של שריר הלב. מודלים אלה דווחו להיות בעלי תאים של פנוטיפים בוגרים, מאפיינים כוללים, ופרופילים מולקולריים דומה לרקמת לב. מערכת הלב-על-שבב גם מאפשרת את המחקר של השפעות מערכתיות בבדיקות סמים ומחלות מודלים. עם זאת, במודלים מחוץ לגוף מתורבת חסר מטריצה החילוץ הילידים ולכן לא ניתן לחקות במדויק את האיברים האלקטרופיזיולוגיה ברמה האיבר. פרוסות לב של האדם, לעומת זאת, יש מטריצה ללא פגע ומקורי הקשר תא אל התא, מה שהופך אותם שימושיים לבדיקה מדויקת יותר של התכונות הקצב של שריר הלב האנושי.
חוקרים פיתחו פרוסות לב אנושי אורגנוטיפקס כפלטפורמה פיסיוקלינית פיזיולוגית עבור בדיקות תרופות חריפה וכרוניות וללמוד אלקטרופיזיולוגיה לב ומחלות לב התקדמות12,13,14,15,16,17,18,19. בהשוואה לקרדיוציטים הנגזרות iPSC, פרוסות לב האדם בנאמנות לשכפל בצורה מבוגרת אלקטרופיזיולוגיה לב האדם עם מתקן קרדיולוגי בוגר. כאשר בהשוואה לקרדיוציטים אנושיים בודדים, פרוסות לב התערוכה משכי הפוטנציאל של פעולה פיזיולוגית בגלל צימוד התא התא השתמר היטב את הקיום הפנימי של סביבות הפנים והמוגלות שלהם.
פרוטוקול זה מתאר את תהליך הפקת פרוסות לב האדם מלבבות תורמים שלמים, ביצוע אקוטי (כלומר, שעות ארוכות) וכרונית (כלומר, ימים ארוכים) לבדיקת פרמטרים של האלקטרופיזיולוגיה באמצעות מיפוי אופטי. בעוד פרוטוקול זה מתאר רק את השימוש של הרקמה השמאלית החדרית (LV), זה הוחל בהצלחה על אזורים אחרים של הלב, כמו גם מינים אחרים כגון עכברים, חולדות, חזירים גינאה, וחזירים14,20,21,22. המעבדה שלנו משתמשת לבבות תורמים שלמים שנדחו עבור ההשתלה במשך 5 השנים האחרונות, אבל זה אפשרי עבור אותם הליכים להיות מבוצעת על כל התורמים הלב לדוגמה רקמות שהתקבלו על ידי אמצעים חלופיים (למשל, שמאל חדרית לסייע המכשיר [LVAD] implantations, ביופסיות, myectomies כריתת המוח) כל עוד מיפוי אופטי מועסק לניתוח במחקר זה בשל יכולתו למפות בו זמנית את פוטנציאל הפעולה האופטי ואת ארעיות הסידן עם מרחבית גבוהה (100 x 100 פיקסלים) ו הזמני (> 1000 מסגרות/s) החלטה. ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות, כגון מערכים רב-אלקטרודה (אני) או מיקרואלקטרודות, אך טכניקות אלה מוגבלות ברזולוציות מרחבית נמוכות יחסית. בנוסף, אני נועדו לשימוש עם תרביות תאים, ומיקרואלקטרודות חדות מנוהלים בקלות רבה יותר לשימוש עם לבבות שלמים או ממדי רקמה גדולה.
מטרת המאמר היא לאפשר לחוקרים נוספים להשתמש ברקמות לב האדם למחקרים אלקטרופיזיולוגיה של הלב. יצוין כי הטכנולוגיה המתוארת במאמר זה היא פשוטה יחסית ומועילה למחקרים לטווח קצר (בסדר של מספר שעות עד ימים). תרבות פיזיולוגית ביותית יותר למחקרים לטווח ארוך (לפי סדר השבועות) נדונה ותוארה על ידי מספר מחקרים אחרים12,18,23. גירוי חשמלי, העמסה מכנית, ורקמות מתיחה הם מנגנוני מיזוג יתרון שיכולים לעזור להגביל את התחלתה של רקמות מחוץ לגופית שיפוץ12,18,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

ההכנות לחיתוך לב האדם פותחו לאחרונה כפלטפורמה לחקר הפיזיולוגיה האנושית ובדיקות תרפיה לגשר על הפער בין בעלי חיים לניסויים קליניים. מודלים רבים של בעלי חיים ותאים שימשו כדי לבחון את ההשפעות של תרופות, אך תגובות אלה שונות לעתים קרובות אצל בני אדם. פרוסות לב אנושיות מציעות יתרון לבדיקת סמים בכך שהן נגזרות ישירות מלבבות אנושיים מעשי. בנוסף לשימור מבנים בעלי מבנה רב-תאי, צימוד תאים תאים וסביבות מטריצה ממסיביות, ניתן להשתמש בפרוסות של רקמת לב אנושית כדי לבדוק ישירות את ההשפעה של תרופות אין-ספור על פיזיולוגיה של לב האדם המבוגר. מה שמבדיל מודל זה מהכנות לב אחרות, כגון לבבות שלמים או פרוסות, היא שפרוסות יכולות להיות נתונים לתרבות ארוכת טווח. ככאלה, פרוסות לב מאפשרות ללמוד את ההשפעות החריפות והכרוניות של סמים. יתר על כן, היכולת לאסוף כמה מאות לאלף פרוסות מלב אחד הופך את זה מודל תפוקה גבוהה כדי לבדוק כמה תרופות בריכוזים שונים ושילובים עם סמים אחרים באותו זמן. פרוסות יכולות להיות מוכנות מכל אזור נתון בלב. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חדרית שמאלי על ידי בידוד קוביות רקמות מהקיר השמאלי של המוח החופשי ולהכניס אותם לפרוסות באמצעות מיקרו הרטט מדויק בדיוק גבוה. פרוסות אלה יכול להיות נתון לניסויים חריפים כדי למדוד פונקציה בסיסית אלקטרופיסיולוגית לב או תרבותי עבור לימודי סמים כרוניים. פרוטוקול זה מתאר גם מיפוי אופטי כפול של פרוסות לב עבור הקלטות בו זמנית של פוטנציאלים טרנסממברניים ודינמיקה סידן תאיים כדי לקבוע את ההשפעות של התרופות נחקר.

פרוסות אורגאואיות אנושיות נאספו מחדר שמאלי של לב אנושי התורם לפי הפרוטוקול המפורט לעיל ומומחש באיור 1. מערכת מיפוי אופטי מצלמה כפולה כמו זו באיור 2שימש בתצורת הדמיה זקופה לבצע מיפוי אופטי סימולטני של מתח וסידן על 1 h לאחר השלמת פרוטוקול הפרוסות. הנתונים נותח...

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק לחוקרים את הכישורים להעסיק לבבות אנושיים תורמים לבדיקות סמים פיזיולוגיות פרה-קליניות. רקמה זו מנצלת הן צבעי מתח וסידן לאפיון בו זמנית של פוטנציאל הפעולה הלבבית ותנאי סידן תאיים בפרוסות רקמות אנושיות. כדי להקים את מערכת המיפוי האופטי, צרף אמבט רקמות עם שכבת ג'ל polydimethylsiloxane התחתונה למערכת חיסון ולהפיץ ליטר אחד של פתרון התאוששות ב 37 מעלות צלזיוס מחומצן עם 100%חמצן דרך מערכת חיסון בקצב זרימה מהיר מספיק כדי לשמור על הטמפרטורה ולמנוע הצטברות של חיסון אמבטיה.לאחר מכן השתמש במטרה כדי להתאים את המיקוד והיישור של שתי מצלמות CMOS ולהשתמש במקור אור LED ירוק עם אורך גל של 520 פלוס או מינוס חמישה ננומטר כדי לרגש את רגישות המתח וצבעי מחוון הסידן בו זמנית. לפני קבלת חלקי רקמות, מערבבים תסכול קרדיופלגיה קפוא ונוזלי ומ מניחים את רקמת הלב באמבט הקר כקרח ומזהים את הקיר השמאלי ללא חדריים. הדבק את ג'ל האגרוז מראש לגב מחזיקי רקמת המתכת של הרטט.חותכים קוביות קוביות סנטימטר אחד של רקמה בתסומה cardioplegic קר ולהשתמש דבק עור אקטואלי במהירות לעלות בלוקים רקמה על מחזיקי רקמת מתכת עם משטחים אנדוקרדיאליים פונה כלפי מעלה. מעבירים את מחזיקי המתכת לאמבטיה הרטטית של פתרון חיתוך מחומצן קר כקרח, כך שהרקמות שקועות לחלוטין ומעבירות את הלהב לקצה הקדמי של הרקמה. הפעל את הרטט כדי להתחיל לחתוך עם הפרמטרים המוגדרים מראש, השלכת הפרוסות הראשונות מספר עד הלהב מגיע מעבר trabeculae לתוך רקמת אנדוקרדית חלקה.כאשר הרקמה הניסיונית הושגה, בזהירות להעביר כל פרוסה לתוך מסנני תאים בודדים 100 מיקרומטר ניילון רשת בצלחת תרבות המכילה טמפרטורת החדר מחומצן פתרון ההתאוששות של Tyrode ולכסות את הפרוסות עם מדיחי רשת כדי לשמור על פרוסות הרקמה מן קרלינג. כאשר כל הפרוסות נאספו, בזהירות להעביר כל פרוסה לתוך בארות בודדות של צלחת שש באר המכיל שלושה מיליליטר של PBS ל הבאר. שוטפים את הפרוסה בנדנדה עדינה וחוזרים על תהליך זה שלוש פעמים עם PBS סטרילי טרי לפני העברת הדגימות לתוך בארות בודדות של צלחת שש באר המכילה שלושה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס תרבות בינונית לבירה.ואז למקם את הצלחת על שייקר מסלולית ב 20 מהפכות לדקה באינקובטור לח ב 37 מעלות, 30% חמצן, ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר 20 דקות של דגירה בתפיסת התאוששות לפרוסות חתוכות טריות או מיד לאחר culturing, בזהירות להעביר את פרוסת העניין לאמבט רקמת מערכת חיסון ולהצמיד את ארבע הפינות לשכבת הג'ל תוך החלת מתיחה מינימלית על הרקמה. אפשר לפרוסות לנוח באמבטיה זו עם פתרון התאוששות במחזור במשך כ 10 דקות לפני הוספת 0.3 כדי 0.5 microliters של מלאי Blebbistatin למאגר של פתרון התאוששות.בעוד הפרוסה היא דגירה Blebbistatin, reconstitute 30 microliters של צבע רגיש מתח מלאי במיליליטר אחד של פתרון התאוששות ב 37 מעלות. לאחר 10 דקות של טיפול Blebbistatin, לכבות את המשאבות לאט לטעון 0.2 כדי 0.3 מיליליטר של פתרון צבע עובד על פני השטח של הפרוסה על פני תקופה של 30 שניות. לאחר 90 שניות, הפעל את המשאבות כדי לשטוף את כל צבע עודף.לאחר שמת את הפרוסה עם מחוון סידן מלאי כפי שהודגם רק, למקד את המצלמות על הפרוסה קצב פרוסה אחת הרץ עם משך רוחב הדופק שתי אלפיות השניה ב 1.5 פעמים את משרעת של סף הצעידה מראש. מניחים כיסוי על פרוסת הרקמה ומאירים את הפרוסה בעזרת מקור אור העירור LED. לאחר מכן להקליט את אותות מתח וסידן הנפלטים עם המצלמות ב 1, 000 מסגרות לשנייה.כדי למצב את נתוני המיפוי האופטי של המתח והסידן, בתוכנת הניתוח המתאימה, לחץ על פרמטרי מצב והסר רקע. לאחר מכן התאימו את הפרמטרים של מיזוג האותות כדי להשיג פוטנציאל פעולה אופטימלי ועקבות סידן ארעיות. כדי לחשב את מהירות ההתהוכה, בחר מפת הפעלה והזן זמן התחלה וסיום כדי לכלול פוטנציאל פעולה יחיד במעקב.לאחר מכן לחץ על מפה אזורית ובחר את האזור המעניין כדי להציג את מפת ההפעלה של האזור הנבחר. לאחר מכן, בחר מפת מהירות של מוליך ובחר את שעות ההתחלה והסיום. התאימו את ערכי הרזולוציה בין פיקסלים בהתאם להגדרה לפי הצורך.לחצו על 'צור מפה וקטורית' לבחירת אזור מעניין והצגת הווקטורים של מהירות ההיתוך באזור זה. הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הווקטורים הכלולים בניתוח וכן זווית ההפצה הממוצעת של וקטורים של מהירות ההיוך באזור שנבחר יוצגו. כדי לחשב את משך הפעולה הפוטנציאלי, בחר משך פעולה פוטנציאלי, מפת משך זמן ארעי סידן ובחר את שעות ההתחלה והסיום כדי להקיף פוטנציאל פעולה אחד מלא.לאחר מכן לחץ על חישוב משך זמן פוטנציאלי של פעולה אזורית כדי לבחור אזור מעניין וליצור את מפת משך הזמן הפוטנציאלי של הפעולה. כדי לקבוע את זמן העלייה, בחר את זמן העלייה ובחר את זמני ההתחלה והסיום כדי לבחור את ההתרוממות של פוטנציאל פעולה אחד בודד או סידן ארעי. הזן את ערכי אחוז ההתחלה והסיום ולחץ על חשב כדי לבחור את אזור העניין ולקבוע את הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח זמן העלייה.כדי לקבוע את ריקבון הסידן, בחר ריקבון סידן והזן את זמני ההתחלה והסיום כדי להקיף את כל חלק הריקבון של אות סידן חולף יחיד. לאחר מכן לחץ על חשב טאו כדי לבחור את אזור העניין ולקבוע את הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח קבוע הזמן של ריקבון הסידן. בניסוי מייצג זה, פוטנציאל הפעולה ועקבות סידן ארעיות הותנו.זמני ההפעלה נקבעו עבור כל פיקסל ומפות isochronal של זמני ההפעלה היו התווה מן המתח המותנה עקבות סידן. וקטורים של מהירות הולכה חושבו לפי זמני ההפעלה והרזולוציה הידועה בין פיקסלים. קבוע ריקבון חולף סידן נמדד על ידי התאמת פולינום לחלק המתפורר של עקבות הסידן.משך הפעולה הפוטנציאלי ומשך הסידן ארעי נמדדו כמשך הזמן שבין זמן ההפעלה לאחוז מסוים של הקיטוב מחדש או הסרת הסידן מהציטופלסמה בהתאמה. גם זמני העלייה של עקבות המתח והסידן נמדדו ומופו. בניתוח מייצג זה, ההשפעה של טוקסורוביצין על הולך לב נבדקה וכתוצאה מכך הפחתה של מהירות ההוליכות הרוחביות.חשוב לוודא כי הפרוסות נמצאות במעצר cardioplegic מלא כדי למזער את הנזק לרקמה במהלך הליך חיתוך כדי להשיג פרוסות קיימא. בסוף הפרוטוקול, ניתן להקפיא או לתקן את הפרוסות להערכה מולקולרית. לאחר מכן ניתן לקבוע את המסלולים המקניסטיים המעורבים בתופעה האלקטרופיזיולוגית של העניין.התפתחות מודל פרוסת לב אנושי זה אפשרה את חקר התגובות לטיפולים ומחלות ברקמת הלב האנושית הממדת את הפער בין מחקרים בבעלי חיים למחקרים קליניים. בעת עבודה עם רקמות אנושיות בעת ביצוע טכניקה זו, הקפד ללבוש את PPE המתאים ולנקוט בכל אמצעי זהירות אחרים הדרושים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

באמצעות תמסורת אופטית יוצאת דופן לכמת סמנים לב בנסיוב אדם

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...