Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

I finanziamenti di NIH (sovvenzioni R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), della fondazione Leducq (progetto RHYTHM) e di una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (19POST34370122) sono riconosciuti.

Tutti i metodi descritti sono stati eseguiti nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. La ricerca è stata approvata dall'Institution Review Board (IRB) della George Washington University.
NOTA: I cuori umani dei donatori sono stati acquisiti dalla Washington Regional Transplant Community come tessuto scartato deidentificato con l'approvazione della George Washington University IRB. I cuori espulsi vengono arrestati cardioplericament...

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. 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Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. 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(55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. 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Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Qui, presentiamo metodi passo-passo per ottenere fette cardiache vitali da cuori umani arrestati cardioplegically e per caratterizzare funzionalmente le fette utilizzando la doppia mappatura ottica del potenziale transmembrana e del calcio intracellulare. Con l'ambiente extracellulare preservato e l'accoppiamento nativo delle cellule cellulari, le fette cardiache umane possono essere utilizzate come modello accurato del cuore umano per la scoperta scientifica fondamentale e per i test di efficacia e cardiotossicità di a...

I modelli animali sono stati un valido strumento utilizzato per comprendere i meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia umana, nonché una piattaforma per la sperimentazione preliminare delle terapie per il trattamento di varie malattie1. Sono stati compiuti grandi passi avanti nel campo della ricerca biomedica basata su questi studi sugli animali2. Tuttavia, esistono differenze significative tra le specie tra le fisiologie umane e animali, tra cui topi, ratti, porcellini d'India, conigli, pecore, maiali e cani3,4. Di conseguenza, ci sono state numerose terapie farmacologiche, geniche e cellulari che hanno mostrato promessa durante la fase di sperimentazione animale, ma non sono riuscite a vivere fino ai risultati negli studi clinici5. Per colmare questa lacuna, sono stati sviluppati come modelli per colmare la risposta della fisiologia umana a vari farmaci e malattie a vari farmaci e malattieindottedall'uomo. I cardiomiociti derivati dalle cellule staminali sono stati ampiamente utilizzati nei sistemi organo-su-chip come surrogato del cuore6,7,8. Tuttavia, l'utilità dei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CMs) è ostacolata dal loro fenotipo relativamente immaturo e dalla mancanza di rappresentazione della sottopopolazione cardiomiocita; il miocardio maturo è una struttura complessa composta da diversi tipi di cellule coesistenti come fibroblasti, neuroni, macrofagi e cellule endoteliche. D'altra parte, i cardiomiociti umani isolati sono elettricamente maturi, e diverse sottopopolazioni cardiomiociti possono essere ottenute alterando i parametri di coltura9. Tuttavia, questi miociti mostrano generalmente un'azione alterata potenziali morfologie a causa della mancanza di accoppiamento cellulare, rapida de-differenziazione, e la comparsa di comportamento proaritmico in vitro10,11. Alcune delle limitazioni sono state affrontate da modelli di coltura cellulare 3D di iPSC-CMs e miociti cardiaci. Questi modelli, che includono sferoidi, scaffold idrogel incapsulati colture 3D, tessuti cardiaci ingegnerizzati (EIT) e sistemi cuore su un chip, utilizzano più popolazioni di cellule cardiache come cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali. Si auto-assemblano o assemblano lungo un ponteggio per formare strutture 3D, e alcuni riproducono anche la complessa natura anisotropica del miocardio. Questi modelli sono stati segnalati per avere cellule di fenotipi maturi, proprietà contrattuali, e profili molecolari simili al tessuto cardiaco. Il sistema heart-on-a-chip consente anche lo studio degli effetti sistemici nei modelli di droga e malattia. Tuttavia, i modelli a base di cellule in vitro non hanno la matrice extracellulare nativa e quindi non sono in grado di imitare con precisione l'elettrofisiologia a livello di organo. Le fette cardiache umane, al contrario, hanno una matrice extracellulare intatta e contatti autocellulari a cellule, il che li rende utili per esaminare con maggiore precisione le proprietà aritmogene del miocardio umano.
I ricercatori hanno sviluppato fette di organotipiche cardiache umane come piattaforma preclinica fisiologica per test sui farmaci acuti e cronici e per studiare l'elettrofisiologia cardiaca e la progressione delle malattie cardiache12,13,14,15,16,17,18,19. Rispetto ai cardiomiociti derivati da iPSC, le fette cardiache umane replicano più fedelmente l'elettrofisiologia cardiaca umana adulta con un fenotipo cardiomiocito maturo. Rispetto ai cardiomiociti umani isolati, le fette cardiache presentano durate potenziali di azione fisiologica a causa dell'accoppiamento cellula-cellula ben conservato e dell'esistenza intrinseca dei loro ambienti nativi intra ed extracellulari.
Questo protocollo descrive il processo di generazione di fette cardiache umane da cuori interi donatori, eseguendo studi acuti (cioè di ore) e cronici (cioè giorni lunghi) per testare i parametri di elettrofisiologia cardiaca tramite mappatura ottica. Mentre questo protocollo descrive solo l'uso del tessuto ventricolare sinistro (LV), è stato applicato con successo ad altre regioni del cuore così come altre specie come topi, ratti, porcellini d'India e maiali14,20,2121,22. Il nostro laboratorio utilizza interi cuori donatrici che sono stati respinti per il trapianto negli ultimi 5 anni, ma è possibile che queste stesse procedure vengano eseguite su qualsiasi tessuti campione di cuore donatore ottenuti con mezzi alternativi (ad esempio, impianti di assistenza ventricolare sinistra [LVAD], biopsie, miectomie) purché i tessuti abbiano la capacità di essere sezionati in cubi. La mappatura ottica viene utilizzata per l'analisi in questo studio a causa della sua capacità di mappare simultaneamente potenziali di azione ottica e transitori di calcio con alta risoluzione spaziale (100 x 100 pixel) e temporale (>1,000 fotogrammi/s). È anche possibile utilizzare metodi alternativi, come gli array multielettrodi (MEA) o i microelettrodi, ma queste tecniche sono limitate dalle loro risoluzioni spaziali relativamente basse. Inoltre, i MEA sono stati progettati per l'uso con le colture cellulari e i microelettrodi taglienti sono più facilmente gestiti per l'uso con cuori interi o grandi cunei di tessuto.
L'obiettivo dell'articolo è quello di consentire a più ricercatori di utilizzare tessuti cardiaci umani per studi di elettrofisiologia cardiaca. Va notato che la tecnologia descritta in questo articolo è relativamente semplice e vantaggiosa per gli studi a breve termine (nell'ordine di diverse ore a giorni). Più fisiologica cultura biomimetica per studi a lungo termine (nell'ordine di settimane) è stato discusso e descritto da una serie di altri studi12,18,23. Stimolazione elettrica, carico meccanico e stretching dei tessuti sono meccanismi di condizionamento vantaggiosi che possono aiutare a limitare l'insorgenza del rimodellamento del tessuto in vitro12,18,23.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

I preparati per fetta cardiaca umana sono stati recentemente sviluppati come piattaforma per gli studi di fisiologia umana e i test terapeutici per colmare il divario tra gli studi sugli animali e quelli clinici. Numerosi modelli animali e cellulari sono stati utilizzati per esaminare gli effetti dei farmaci, ma queste risposte spesso differiscono negli esseri umani. Le fette cardiache umane offrono un vantaggio per i test antidroga in quanto sono direttamente derivate da cuori umani vitali. Oltre ad aver conservato strutture multicellulari, accoppiamento cellulare e ambienti a matrice extracellulare, le fette di tessuto cardiaco umano possono essere utilizzate per testare direttamente l'effetto di innumerevoli farmaci sulla fisiologia cardiaca umana adulta. Ciò che distingue questo modello da altre preparazioni cardiache, come cuori interi o cunei, è che le fette possono essere sottoposte a una cultura a lungo termine. Come tale, fette cardiache consentono di studiare gli effetti acuti e cronici dei farmaci. Inoltre, la capacità di raccogliere diverse centinaia o mille fette da un solo cuore rende questo un modello ad alto throughput per testare diversi farmaci a concentrazioni diverse e combinazioni con altri farmaci allo stesso tempo. Le fette possono essere preparate da qualsiasi regione del cuore. In questo protocollo, descriviamo la preparazione di fette ventricolari a sinistra isolando i cubi di tessuto dalla parete libera ventricolare sinistra e sezionandoli a fette utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione. Queste fette possono quindi essere sottoposte a esperimenti acuti per misurare la funzione elettrofisiologica cardiaca di base o coltivate per studi sui farmaci cronici. Questo protocollo descrive anche la doppia mappatura ottica delle fette cardiache per registrazioni simultanee di potenziali transmembrani e dinamiche intracellulari del calcio per determinare gli effetti dei farmaci studiati.

Le fette organotpice umane sono state raccolte dal ventricolo sinistro di un cuore umano del donatore secondo il protocollo descritto sopra e illustrato inFigura 1. Un sistema di mappatura ottica a doppia fotocamera come quello inFigura 2è stato utilizzato nella configurazione di imaging verticale per eseguire la mappatura ottica simultanea di tensione e calcio circa 1 h dopo il completamento del protocollo di taglio. I dati sono stati analizzati utilizzando RH...

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Questo protocollo è significativo perché fornisce ai ricercatori le capacità di impiegare cuori umani donatori per test fisiologici preclinici sui farmaci. Questo tessuto utilizza sia coloranti di tensione che di calcio per la caratterizzazione simultanea di potenziali di azione cardiaca e transitori di calcio intracellulare nelle fette di tessuto umano. Per impostare il sistema di mappatura ottica, attaccare un bagno di tessuto con uno strato di gel polidimetilsiloxano inferiore a un sistema di perfusione e far circolare un litro di soluzione di recupero a 37 gradi Celsius ossigenato con ossigeno al 100% attraverso il sistema di perfusione a una portata abbastanza veloce da mantenere la temperatura e prevenire l'accumulo di perfusato di bagno.Quindi utilizzare un bersaglio per regolare la messa a fuoco e l'allineamento delle due telecamere CMOS e utilizzare una sorgente di luce LED verde con una lunghezza d'onda di 520 più o meno cinque nanometri per eccitare simultaneamente i coloranti sensibili alla tensione e agli indicatori di calcio. Prima di ottenere sezioni tissutali, mescolare la soluzione di cardioplegia congelata e liquida e posizionare il tessuto cardiaco nel bagno cardioplegia ghiacciato e identificare la parete libera ventricolare sinistra. Incollare il gel di agarosio prefatti sul retro dei supporti in tessuto metallico del vibratoma.Tagliare blocchi di tessuto a cubetti di un centimetro in soluzione cardioplegica fredda e utilizzare adesivo cutaneo topico per montare rapidamente i blocchi di tessuto sui supporti dei tessuti metallici con le superfici endocardiche rivolte verso l'alto. Trasferire i supporti metallici nel bagno vibratomo della soluzione di affettamento ossigenato ghiacciato in modo che i tessuti siano completamente sommersi e spostare la lama sul bordo anteriore del tessuto. Accendere il vibratoma per iniziare a tagliare con i parametri preimpostati, scartando le prime fette fino a quando la lama non raggiunge oltre le trabecule nel tessuto endocardico liscio.Una volta raggiunto il tessuto sperimentale, trasferire accuratamente ogni fetta in singoli filtri cellulari in rete di nylon da 100 micrometri in un piatto di coltura contenente la soluzione di recupero del Tirolo ossigenato a temperatura ambiente e coprire le fette con rondelle a rete per evitare che le fette di tessuto si arriccino. Una volta raccolte tutte le fette, trasferire accuratamente ogni fetta in singoli pozzi di una piastra a sei po porsi contenente tre millilitri di PBS per pozzo. Risciacquare la fetta con una leggera dondolo e ripetere questo processo tre volte con PBS sterile fresco prima di trasferire i campioni in singoli pozzi di una piastra a sei poggiale contenente tre millilitri di 37 gradi Celsius terreno di coltura per pozzo.Quindi posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 20 giri al minuto in un incubatore umidificato a 37 gradi, 30% ossigeno e 5% di anidride carbonica. Dopo 20 minuti di incubazione in soluzione di recupero per fette appena tagliate o subito dopo la coltura, trasferire con cura la fetta di interesse al bagno di tessuto del sistema di perfusione e fissare i quattro angoli allo strato di gel applicando un tratto minimo al tessuto. Lasciare riposare le fette in questo bagno con soluzione di recupero circolante per circa 10 minuti prima di aggiungere da 0,3 a 0,5 microlitri di Blebbistatin di serie al serbatoio della soluzione di recupero.Mentre la fetta sta incubando nella Blebbistatin, ricostituire 30 microlitri del colorante sensibile alla tensione di magazzino in un millilitro di soluzione di recupero a 37 gradi. Dopo 10 minuti di trattamento con Blebbistatin, spegnere le pompe e caricare lentamente da 0,2 a 0,3 millilitri di soluzione di colorante funzionante sulla superficie della fetta per un periodo di 30 secondi. Dopo 90 secondi, accendere le pompe per lavare via qualsiasi colorante in eccesso.Dopo aver moreto la fetta con l'indicatore di calcio stock come appena dimostrato, focalizza le telecamere sulla fetta e cammina la fetta con un hertz con una durata dell'impulso di due millisecondi a 1,5 volte l'ampiezza della soglia di stimolazione predeterminata. Posizionare un copriletto sopra la fetta di tessuto e illuminare la fetta con la sorgente luminosa di eccitazione a LED. Quindi registrare i segnali di tensione e calcio emessi con le telecamere a 1.000 fotogrammi al secondo.Per condizionare i dati di mappatura ottica di tensione e calcio, nell'apposito software di analisi, fare clic sui parametri delle condizioni e rimuovere lo sfondo. Quindi regolare i parametri di condizionamento del segnale per ottenere un potenziale di azione ottimale e tracce transitori di calcio. Per calcolare la velocità di conduzione, selezionare la mappa di attivazione e immettere un'ora di inizio e fine per includere un singolo potenziale di azione nella traccia.Quindi fare clic sulla mappa regionale e selezionare l'area di interesse per visualizzare la mappa di attivazione dell'area selezionata. Quindi, selezionare la mappa della velocità di conduzione e selezionare gli orari di inizio e fine. Regolare i valori di risoluzione tra pixel in base alla configurazione in base alle esigenze.Fate clic su genera mappa vettoriale (generate vector map) per selezionare una regione di interesse e visualizzare i vettori di velocità di conduzione all'interno di tale regione. Verranno visualizzati la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di vettori inclusi nell'analisi, nonché l'angolo medio di propagazione dei vettori di velocità di conduzione nella regione selezionata. Per calcolare la durata potenziale dell'azione, selezionare la durata potenziale dell'azione, la mappa della durata transitoria del calcio e selezionare gli orari di inizio e fine per includere un potenziale di azione completo.Quindi fare clic sul calcolo della durata potenziale dell'azione regionale per selezionare un'area di interesse e generare la mappa della durata potenziale dell'azione. Per determinare il tempo di salita, selezionare il tempo di salita e selezionare gli orari di inizio e fine per selezionare la salita di un singolo potenziale di azione o transitorio di calcio. Immettere i valori percentuali iniziale e finale e fare clic su calcola per selezionare l'area di interesse e determinare la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi del tempo di ascesa.Per determinare il decadimento del calcio, selezionare il decadimento del calcio ed entrare nei tempi di inizio e fine per includere l'intera porzione di decadimento di un singolo segnale transitorio di calcio. Quindi fare clic su calcola tau per selezionare la regione di interesse e determinare la media, mediana, deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi della costante del tempo di decadimento del calcio. In questo esperimento rappresentativo, il potenziale d'azione e le tracce transitori di calcio erano condizionate al segnale.I tempi di attivazione sono stati determinati per ogni pixel e le mappe isocronali dei tempi di attivazione sono state tracciate dalla tensione condizionata e dalle tracce di calcio. I vettori di velocità di conduzione sono stati calcolati utilizzando i tempi di attivazione e la risoluzione inter-pixel nota. La costante di decadimento transitorio del calcio è stata misurata adattando un polinomio alla porzione in decomposizione delle tracce di calcio.La durata potenziale d'azione e la durata transitoria del calcio sono state misurate come durata del tempo tra il tempo di attivazione e una percentuale specificata della ri-polarizzazione o rimozione del calcio dal citoplasma rispettivamente. Sono stati misurati e mappati anche i tempi di aumento delle tracce di tensione e calcio. In questa analisi rappresentativa, è stato testato l'effetto della doxorubicina sulla conduzione cardiaca, con conseguente riduzione della velocità di conduzione trasversale.È importante assicurarsi che le fette siano in completo arresto cardioplegico per ridurre al minimo i danni al tessuto durante la procedura di affettare e ottenere fette vitali. Alla fine del protocollo, le fette possono essere congelate o fissate per la valutazione molecolare. Si possono quindi determinare le vie meccaniche coinvolte nel fenomeno elettrofisiologico di interesse.Lo sviluppo di questo modello di fetta cardiaca umana ha permesso lo studio delle risposte ai trattamenti e alle malattie nel tessuto cardiaco umano colmando il divario tra studi animali e clinici. Quando si lavora con tessuti umani durante l'esecuzione di questa tecnica, assicurarsi di indossare i DPI appropriati e di prendere tutte le altre precauzioni di sicurezza necessarie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Ricerca

Bioingegneria

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Utilizzando la trasmissione ottica straordinaria per quantificare i biomarcatori cardiaci nel siero umano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Valutazione di collagene ed elastina microarchitetture dipendente dalla pressione nelle arterie della resistenza umana, diretta da microscopia di fluorescenza privo di etichetta

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...