Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

NIH(助成金R21 EB023106、R44 HL139248、R01 HL126802)、Leducq財団(プロジェクトRHYTHM)、米国心臓協会博士研究員(19POST34370122)による資金提供は感謝しています。

記述されたすべての方法は、人間の福祉のためのすべての制度的、国家的、国際的なガイドラインに従って行われてきました。研究は、ジョージワシントン大学の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。
注:ドナーの人間の心臓は、ジョージワシントン大学IRBの承認を得て廃棄された組織を識別解除したため、ワシントン地域移植コミュニティから取得されました?...

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	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. 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Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

ここでは、心突っ込んで逮捕されたヒト心臓から実行可能な心臓スライスを得るためのステップバイステップの方法を提示し、膜貫通電位と細胞内カルシウムの二重光学マッピングを用いてスライスを機能的に特徴付ける。保存された細胞外環境とネイティブの細胞と細胞の結合により、ヒト心臓スライスは、基本的な科学的発見と薬理学的薬剤および遺伝子治療の有効性および心臓毒性試?...

動物モデルは、ヒト生理学および病態生理学の基礎的なメカニズムを理解するために使用される貴重なツールであり、また様々な疾患を治療するための治療法の予備試験のためのプラットフォームである1。これらの動物研究2に基づく生物医学研究の分野で大きな進歩がとられています。しかし、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、およびイヌ,3、4を含む、ヒトと動物の生理学の3間に有意な種間の違いが存在する。その結果、動物実験の段階で約束を示したが、臨床試験5で結果に応えられなかった多くの薬物、遺伝子、および細胞療法があった。このギャップを埋めるために、孤立した心筋細胞およびヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、様々な薬物および疾患に対するヒト生理学の応答を試験するモデルとして開発された6。幹細胞由来心筋細胞は、心臓,6,7,87の代理として臓器オンチップ系で広く使用されている。68しかし、iPSC由来の心筋細胞(iPSC-CM)の有用性は、比較的未熟な表現型と心筋細胞亜集団の表現の欠如によって妨げられる。成熟した心筋は、線維芽細胞、ニューロン、マクロファージ、内皮細胞などのいくつかの共存する細胞タイプから構成される複雑な構造である。一方、孤立したヒト心筋細胞は電気的に成熟しており、培養パラメータ9を改変することにより異なる心筋細胞亜集団を得ることができる。それでも、これらの筋細胞は一般的に、細胞間結合の欠如、急速な分化、およびvitro10,11,11における不整脈行動の発生による変化作用電位形態を示す。いくつかの制限は、iPSC-CMおよび心臓筋細胞の3D細胞培養モデルによって対処された。これらのモデルは、スフェロイド、3D培養物をカプセル化したヒドロゲル足場、設計された心臓組織(EHT)、および心臓オンチップシステムを含み、心筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞などの複数の心臓細胞集団を使用する。彼らは自己集合するか、足場に沿って組み立てて3D構造を形成し、心筋の複雑な異方性の性質を再現するものもあります。これらのモデルは、成熟した型の細胞、収縮特性、および心臓組織に類似した分子プロファイルを有することが報告されている。心臓オンチップシステムはまた、薬物検査および疾患モデルにおける全身効果の研究を可能にする。しかし、インビトロ細胞ベースモデルは、天然の細胞外マトリックスを欠いているため、臓器レベルの電気生理学を正確に模倣することはできません。対照的に、ヒト心臓スライスは、無傷の細胞外マトリックスおよびネイティブ細胞間接触を有し、ヒト心筋の不整脈特性をより正確に調べるのに有用である。
研究者は、急性および慢性薬物検査のための生理学的前臨床プラットフォームとしてヒト心臓組織学的スライスを開発し、心臓電気生理学および心臓病進行を研究するために12、13、14、15、16、17、18、19。12,13,14,15,16,17,18,19iPSC由来の心筋細胞と比較すると、ヒト心臓スライスは成熟した心筋細胞表現型を有する成人ヒト心臓電気生理学をより忠実に複製する。単離されたヒト心筋細胞と比較すると、心臓スライスは、良好に保存された細胞と細胞の結合と、その本来の細胞内および細胞外環境の本質的な存在のために、生理作用の可能性のある持続時間を示す。
このプロトコルは、ドナー心臓全体からヒト心臓スライスを生成するプロセスを記述し、急性(すなわち、時間の長さ)および慢性(すなわち、日-長い)研究を行い、光学マッピングを介して心臓電気生理学パラメータをテストする。このプロトコルは左心室(LV)組織の使用のみを説明するが、それは正常にマウス、ラット、モルモット、および豚14、20、21、22,20,21などの他の種だけでなく、心臓の他の領域に適用されています。,22私たちの研究室では、過去5年間移植を拒否されたヒトドナー心臓全体を使用していますが、組織がキューブに切り離される能力を持っている限り、代替手段(例えば、左心室補助装置[LVAD]移植、生検、子宮摘出)によって得られたドナー心臓サンプル組織に対してこれらの同じ手順を行うことは可能です。光学マッピングは、高空間(100 x 100ピクセル)と時間(>1,000フレーム/s)解像度で光学的作用電位とカルシウム過渡を同時にマッピングする能力があるため、この研究では分析に使用されています。多電極アレイ(MEA)や微小電極などの代替方法も使用できますが、これらの手法は比較的低い空間解像度によって制限されます。さらに、MEAは細胞培養用に設計されており、鋭利な微小電極は、心臓全体または大きな組織ウェッジで使用するためにより簡単に管理できます。
この記事の目的は、より多くの研究者が心臓電気生理学研究のためにヒト心臓組織を使用できるようにすることです。この記事に記載されている技術は、比較的単純で、短期間の研究(数時間から数日の順序で)に有益であることを留意すべきです。より多くの生理学的な生物模倣文化は、より長期にわたる研究(週の順)に関して議論され、他の多くの研究によって説明されてきた1212、18、23。,18,23電気刺激,、機械的負荷、および組織ストレッチは、12、18、23,18のインビトロ組織再モデリングの発症を制限するのに役立つ有利な調整機構である。23

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

ヒト心臓スライス製剤は、動物と臨床試験の間のギャップを埋めるために、ヒト生理学研究と治療試験のプラットフォームとして最近開発されました。薬物の効果を調べるために多くの動物および細胞モデルが使用されてきたが、これらの反応はヒトにおいてしばしば異なる。ヒトの心臓スライスは、実行可能な人間の心臓から直接派生するという点で、薬物検査の利点を提供します。保存された多細胞構造、細胞と細胞の結合、および細胞外マトリックス環境に加えて、ヒト心臓組織スライスは、成人ヒト心臓生理学に対する無数の薬物の効果を直接テストするために使用することができる。このモデルを心臓全体やくさびなどの他の心臓製剤と区別しているのは、スライスが長期的な培養を受けることができてしまうということです。したがって、心臓スライスは、薬物の急性および慢性の影響を研究することを可能にする。さらに、単一の心臓から数百から千のスライスを収集する能力は、同時に様々な濃度と他の薬物との組み合わせでいくつかの薬物をテストするハイスループットモデルになります。スライスは、心臓の任意の領域から調製することができます。このプロトコルでは、左心室自由壁から組織キューブを単離し、高精度振動ミクロトームを用いてスライスに切り離すことによって、左心室スライスの調製について説明する。これらのスライスは、その後、急性実験を行ってベースライン心臓電気生理学的機能を測定するか、慢性薬物研究のために培養することができる。このプロトコルはまた、膜貫通電位と細胞内カルシウムダイナミクスの同時記録のための心臓スライスの二重光学マッピングを記述し、調査中の薬物の効果を決定する。

ヒトのorganotypicスライスは、上記のプロトコルに従ってドナー人間の心臓の左心室から収集され、で示された図 1.デュアルカメラ光学マッピングシステム図 2スライスプロトコルの完成後約1時間で電圧とカルシウムの同時光学マッピングを行うために直立画像構成で使用された。データはリズム1.2を用いて分析された(図 3)、?...

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

このプロトコルは、前臨床生理学的薬物検査のためにドナー人間の心臓を採用するスキルを研究者に提供するため、重要です。この組織は、ヒト組織スライスにおける心行動電位と細胞内カルシウム過渡性の同時特性評価に電圧とカルシウム染料の両方を利用する。光学マッピングシステムを設定するには、下部ポリジメチルシロキサンゲル層を有する組織浴を灌流システムに取り付け、温度を維持し、浴透過物の蓄積を防ぐのに十分な速さで流量で灌流システムを通して100%酸素で酸素化した摂氏37度で1リットルの回収溶液を循環させる。次に、ターゲットを使用して2台のCMOSカメラの焦点と位置合わせを調整し、520プラスマイナス5ナノメートルの波長の緑色のLED光源を使用して、電圧感受性とカルシウムインジケータの色素を同時に励起します。組織切片を得る前に、凍結した液状心筋痛液を混合し、心臓組織を氷冷心筋プレギア浴に入れ、左心室自由壁を特定する。ビブラートメの金属組織ホルダーの背面に、あらかじめ作られたアガロースゲルを接着します。冷たい心肢麻痺溶液で組織の1センチメートルの立方体ブロックを切断し、局所皮膚接着剤を使用して、心内膜表面を上に向けて金属組織ホルダーに組織ブロックを素早く取り付けます。金属ホルダーを氷冷酸素スライス溶液のビブラードーム浴に移し、組織が完全に水没するようにし、ブレードを組織の前端に移動させます。ビブラートオムをオンにしてプリセットパラメータでスライスを開始し、ブレードがトラベキュラを越えて滑らかな心内膜組織に到達するまで最初のいくつかのスライスを破棄します。実験組織に到達したら、室温酸素化タイローデの回収液を含む培養皿の個々の100マイクロメートルナイロンメッシュ細胞ストレーナーに各スライスを慎重に移し、メッシュワッシャーでスライスを覆い、組織スライスをカールしないようにします。すべてのスライスが収集されたら、各スライスを慎重に1ウェルあたり3ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートの個々の井戸に移します。スライスを穏やかな揺れですすい、新鮮な滅菌PBSでこのプロセスを3回繰り返してから、サンプルを37°Cの培養培地を含む6ウェルプレートの個々の井戸に移します。その後、37度、30%酸素、および5%の二酸化炭素で加湿インキュベーターで毎分20回転で軌道シェーカーにプレートを置きます。切り取りたてのスライスまたは培養直後の回収液中のインキュベーションの20分後、目的のスライスを灌流系組織浴に慎重に移し、組織に最小限のストレッチを適用しながら4つの角をゲル層に固定します。0.3~0.5マイクロリットルのストックブレビスタチンを回収液の貯留槽に加える前に、約10分間、循環回収液でスライスをこの浴中で休ませます。スライスがブレビスタチンでインキュベートされている間、37度の回収溶液の1ミリリットルで30マイクロリットルのストック電圧感受性染料を再構成する。ブレビスタチン処理の10分後、ポンプをオフにし、30秒間にわたってスライスの表面に0.2〜0.3ミリリットルの作業色素溶液をゆっくりとロードします。90秒後、ポンプをオンにして余分な染料を洗い流します。ちょうど実証したようにストックカルシウムインジケータでスライスを死にかけた後、スライスにカメラを集中させ、所定のペーシングしきい値の1.5倍の振幅で2ミリ秒のパルス幅持続時間を持つ1ヘルツでスライスのペースを調整します。ティッシュスライスの上にカバースリップを置き、LED励起光源でスライスを照らします。次に、1,000 フレーム/秒のカメラで、放出された電圧とカルシウム信号を記録します。電圧およびカルシウム光学マッピングデータを条件として、適切な解析ソフトウェアで条件パラメータをクリックし、背景を削除します。次に、信号調節パラメータを調整して、最適な作用電位とカルシウム過渡トレースを得ます。伝導速度を計算するには、アクティブ化マップを選択し、開始時間と終了時間を入力して、トレース内の 1 つのアクションポテンシャルを包含します。次に、[地域] マップをクリックし、対象地域を選択して、選択した地域のアクティブ化マップを表示します。次に、伝導速度マップを選択し、開始時間と終了時間を選択します。必要に応じて、設定に基づいてピクセル間解像度の値を調整します。[ベクトル マップを生成]をクリックして対象領域を選択し、その領域内の伝導速度ベクトルを表示します。解析に含まれる平均値、中央値、標準偏差、およびベクトル数、および選択した領域における伝導速度ベクトルの伝播の平均角度が表示されます。アクションの可能性期間を計算するには、アクションの潜在的な持続時間、カルシウム過渡期間マップを選択し、開始時間と終了時間を選択して、1 つのアクションの可能性を完全に包含します。次に、[地域のアクションの可能性期間の計算] をクリックして、対象地域を選択し、アクション潜在的な期間マップを生成します。立ち上がり時間を決定するには、立ち上がり時間を選択し、開始時間と終了時間を選択して、1つのアクション電位またはカルシウム過渡のアップストロークを選択します。開始および終了のパーセンテージの値を入力し、[計算] をクリックして対象地域を選択し、上昇時間の解析に含まれる平均、中央値、標準偏差、ピクセル数を決定します。カルシウムの崩壊を決定するには、カルシウム崩壊を選択し、開始時間と終了時間を入力して、単一のカルシウム過渡信号の減衰部分全体を包含します。次に、[τの計算] をクリックして対象領域を選択し、カルシウム崩壊時定数の解析に含まれる平均値、中央値、標準偏差、およびピクセル数を決定します。本代表的実験では、作用電位及びカルシウム過渡痕をシグナル条件とした。活性化時間は、活性化時間の各画素およびアイソクロナルマップについて、条件電圧およびカルシウムトレースからプロットした。伝導速度ベクトルは、活性化時間および既知のピクセル間解像度を用いて計算した。カルシウム過渡減衰定数は、カルシウムトレースの減衰部分に多項式を合わせて測定した。作用電位持続時間及びカルシウム過渡持続時間は、それぞれ細胞質からの再分極またはカルシウム除去の活性化時間と指定されたパーセントの間の時間持続時間として測定した。電圧およびカルシウムトレースの立ち上がり時間も測定され、マッピングされました。この代表的な分析では、ドキソルビシンが心臓伝導に及ぼす影響を試験し、その結果、横断伝導速度が低下した。スライス手順中の組織への損傷を最小限に抑え、実行可能なスライスを得るために、スライスが完全な心肢麻痺状態であることを確認することが重要です。プロトコルの最後に、スライスを凍結または分子評価のために固定することができます。その後、目的の電気生理学的現象に関与する機構経路を決定することができる。このヒト心臓スライスモデルの開発により、動物と臨床試験の間のギャップを埋めるヒト心臓組織における治療および疾患に対する反応の研究が可能になった。この技術を実行しながら、人間の組織を操作するときは、適切なPPEを着用し、他の必要な安全対策を講じてください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...