Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Støtte fra NIH (tilskudd R21 EB023106, R44 HL139248 og R01 HL126802), av Leducq foundation (prosjekt RHYTHM) og en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) er takknemlig anerkjent.

Alle metodene som er beskrevet er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Forskning ble godkjent av Institution Review Board (IRB) ved George Washington University.
MERK: Donor menneskelige hjerter ble kjøpt fra Washington Regional Transplant Community som deidentifisert kassert vev med godkjenning fra George Washington University IRB. Eksplantede hjerter er kardioplegisk arrestert ved å skylle hjertet med en løsning av...

<ol>
	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic?+An+industry+perspective.">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li><li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias.">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).</li><li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip.">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening:+Special+focus+on+IK1.">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes.">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559 (2010).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168 (2019).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117 (2019).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies.">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Her presenterer vi trinnvise metoder for å oppnå levedyktige hjerteskiver fra kardioplegisk arresterte menneskelige hjerter og for å funksjonelt karakterisere skivene ved hjelp av dobbel optisk kartlegging av transmembranepotensial og intracellulært kalsium. Med bevart ekstracellulært miljø og innfødt cellecellekobling kan menneskelige hjerteskiver brukes som en nøyaktig modell av det menneskelige hjerte for grunnleggende vitenskapelig oppdagelse og for effekt- og kardiotoksisitetstesting av farmakologiske midler...

Dyremodeller har vært et verdifullt verktøy som brukes for å forstå de underliggende mekanismene for menneskelig fysiologi og patofysiologi, samt en plattform for foreløpig testing av terapier for å behandle ulike sykdommer1. Store fremskritt har blitt tatt innen biomedisinsk forskning basert på disse dyrestudier2. Det finnes imidlertid betydelige forskjeller mellom menneske- og dyrefysiologier, inkludert mus, rotter, marsvin, kaniner, sauer, griser og hunder3,,4. Som et resultat har det vært mange legemiddel-, gen- og cellebehandlinger som viste løfte under dyretestingsstadiet, men klarte ikke å leve opp til resultatene i kliniske studier5. For å bygge bro over dette gapet ble isolerte hjertemycytter og humane pluripotente stamceller (iPSCer) utviklet som modeller for å teste responsen av menneskelig fysiologi til ulike stoffer og sykdommer6. Stamcelleavledede kardiomyocytter har vært mye brukt i organ-on-a-chip-systemer som et surrogat i hjertet6,,7,,8. Nytten av iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) er imidlertid hindret av deres relativt umodne fenotype og mangel på representasjon av kardiomyocyte subpopulation; det modne myokardiet er en kompleks struktur som består av flere sameksisterende celletyper som fibroblaster, nevroner, makrofager og endotelceller. På den annen side er isolerte humane kardiomyocytter elektrisk modne, og forskjellige kardiomyocyte subpopulasjoner kan oppnås ved å endre kulturing parametere9. Likevel viser disse myocytter generelt endret handling potensielle morfologier på grunn av mangel på celle-celle kobling, rask de-differensiering, og forekomst av proarrhythmic atferd in vitro10,11. Noen av begrensningene ble adressert av 3D-cellekulturmodeller av iPSC-CMs og hjertemycytter. Disse modellene, som inkluderer sfæroider, hydrogel stillas innkapslet 3D-kulturer, konstruert hjertevev (EHTs), og hjerte-på-en-chip systemer, bruke flere hjertecellepopulasjoner som kardiomyocytter, fibroblaster, og endotelceller. De enten selv montere eller montere langs et stillas for å danne 3D strukturer, og noen selv reprodusere komplekse anisotropisk natur myokardiet. Disse modellene har blitt rapportert å ha celler av modne fenotyper, kontraktile egenskaper, og molekylære profiler som ligner på hjertevev. Hjerte-på-en-chip-systemet tillater også studiet av systemiske effekter i narkotikatesting og sykdomsmodeller. In vitro cellebaserte modeller mangler imidlertid den innfødte ekstracellulære matrisen og kan derfor ikke nøyaktig etterligne organnivåelektrofysiologi. Menneskelige hjerteskiver, derimot, har en intakt ekstracellulær matrise og innfødte celle-til-celle-kontakter, noe som gjør dem nyttige for mer nøyaktig å undersøke arytmogene egenskaper av det menneskelige myokardiet.
Forskere har utviklet humane hjerteorganotypiske skiver som en fysiologisk preklinisk plattform for akutt og kronisk narkotikatesting og for å studere hjerteelektrofysiologi og hjertesykdomprogresjon12,13,,14,15,16,17,18,19. Sammenlignet med iPSC-avledede kardiomyocytter, humane hjerteskiver mer trofast replikere voksen menneskelig hjerteelektrofysiologi med en moden kardiomyocyte fenotype. Sammenlignet med isolerte humane kardiomyocytter viser hjerteskiver fysiologiske virkningspotensialvarierigheter på grunn av den godt bevarte cellecellekoblingen og den iboende eksistensen av deres innfødte intra- og ekstracellulære miljøer.
Denne protokollen beskriver prosessen med å generere menneskelige hjerteskiver fra hele donorhjerter, utføre akutte (dvs. timer lange) og kroniske (dvs. dager lange) studier for å teste hjerteelektrofysiologiparametere via optisk kartlegging. Mens denne protokollen beskriver bare bruken av venstre ventrikkel (LV) vev, det har blitt brukt til andre regioner av hjertet samt andre arter som mus, rotter, marsvin, og griser14,20,21,22. Vårt laboratorium bruker hele menneskelige donorhjerter som har blitt avvist for transplantasjon de siste 5 årene, men det er mulig for disse samme prosedyrene å bli utført på noen donor hjerte prøve vev oppnådd ved alternative midler (f.eks venstre ventrikulær hjelpeenhet [LVAD] implantasjoner, biopsier, myectomies) så lenge vevet har evnen til å bli delt inn i terninger. Optisk kartlegging er brukt for analyse i denne studien på grunn av sin evne til å samtidig kartlegge optiske handlingspotensialer og kalsiumtransienter med høy romlig (100 x 100 piksler) og temporal (> 1000 rammer / s) oppløsning. Alternative metoder kan også brukes, for eksempel multielectrode arrays (MEAer) eller mikroelektroder, men disse teknikkene er begrenset av deres relativt lave romlige oppløsninger. I tillegg ble MEAer designet for bruk med cellekulturer, og skarpe mikroelektroder håndteres lettere for bruk med hele hjerter eller store vevkiler.
Målet med artikkelen er å gjøre det mulig for flere forskere å bruke humant hjertevev for hjerteelektrofysiologistudier. Det bør bemerkes at teknologien som er beskrevet i denne artikkelen er relativt enkel og gunstig for kortsiktige studier (i størrelsesorden flere timer til dager). Mer fysiologisk biomimetisk kultur for langsiktige studier (i rekkefølge av uker) har blitt diskutert og beskrevet av en rekke andre studier12,18,23. Elektrisk stimulering, mekanisk lasting og vevstrekking er fordelaktige kondisjoneringsmekanismer som kan bidra til å begrense utbruddet av in vitro vevsremodellering12,,18,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

Menneskelige hjerteskivepreparater har nylig blitt utviklet som en plattform for humane fysiologistudier og terapitesting for å bygge bro mellom dyre- og kliniske studier. Tallrike dyre- og cellemodeller har blitt brukt til å undersøke effekten av narkotika, men disse svarene varierer ofte hos mennesker. Menneskelige hjerteskiver gir en fordel for narkotikatesting ved at de er direkte avledet fra levedyktige menneskelige hjerter. I tillegg til å ha bevart flercellede strukturer, cellecellekobling og ekstracellulære matrisemiljøer, kan menneskelige hjertevevskiver brukes til å direkte teste effekten av utallige legemidler på voksen menneskelig hjertefysiologi. Det som skiller denne modellen fra andre hjertepreparater, for eksempel hele hjerter eller kiler, er at skiver kan bli utsatt for langsiktig kultur. Som sådan tillater hjerteskiver å studere de akutte så vel som kroniske effektene av narkotika. Videre gjør evnen til å samle flere hundre til tusen skiver fra et enkelt hjerte dette til en høygjennomstrømningsmodell for å teste flere stoffer ved varierende konsentrasjoner og kombinasjoner med andre stoffer samtidig. Skiver kan tilberedes fra en gitt region av hjertet. I denne protokollen beskriver vi utarbeidelsen av venstre ventrikulære skiver ved å isolere vevskuber fra venstre ventrikulær fri vegg og dele dem i skiver ved hjelp av en høy presisjon vibrerende mikrotom. Disse skivene kan da enten bli utsatt for akutte eksperimenter for å måle baseline hjerteelektrofysiologisk funksjon eller dyrket for kroniske legemiddelstudier. Denne protokollen beskriver også to optiske kartlegging av hjerteskiver for samtidige registreringer av transmembbrane potensialer og intracellulær kalsiumdynamikk for å bestemme effekten av narkotika som undersøkes.

Humane organotypiske skiver ble samlet inn fra venstre ventrikkel av et donormenneskelig hjerte i henhold til protokollen som er beskrevet ovenfor og illustrert iFigur 1. Et optisk kartsystem med to kameraer som det iFigur 2ble brukt i den oppreist bildekonfigurasjonen for å utføre samtidig optisk kartlegging av spenning og kalsium ca 1 timer etter ferdigstillelse av kutteprotokollen. Data ble analysert ved hjelp av RHYTHM1.2 (Figur 3</str...

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Denne protokollen beskriver prosedyren for snitting og kulturing av menneskelige hjerteskiver for preklinisk narkotikatesting og detaljer bruk av optisk kartlegging for registrering av transmembranespenning og intracellulære kalsiumsignaler samtidig fra disse skivene.

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Denne protokollen er viktig fordi det gir forskere ferdigheter til å ansette donor menneskelige hjerter for preklinisk fysiologisk narkotikatesting. Dette vevet benytter både spenning og kalsiumfargestoffer for samtidig karakterisering av hjertefunksjonspotensialer og intracellulære kalsiumtransienter i menneskelige vevskiver. For å sette opp det optiske kartsystemet, fest et vevbad med et bunnpolydimetylsiloxane gellag til et perfusjonssystem og sirkulerer en liter gjenopprettingsløsning ved 37 grader Celsius oksygenert med 100% oksygen gjennom perfusjonssystemet med en strømningshastighet raskt nok til å opprettholde temperaturen og for å forhindre akkumulering av badekarperfusat.Bruk deretter et mål for å justere fokus og justering av de to CMOS-kameraene og bruke en grønn LED-lyskilde med en 520 pluss eller minus fem nanometer bølgelengde for å opphisse spenningsfølsomme og kalsiumindikatorfargestoffer samtidig. Før du får vevsseksjoner, bland frossen og flytende kardioplegiløsning og legg hjertevevet i det iskalde kardioplegibadet og identifiser venstre ventrikulær fri vegg. Lim den ferdig lagde agarosegelen på baksiden av metallvevsholderne på vibratomen.Skjær en centimeter cubed blokker av vev i kald kardioplegisk løsning og bruk aktuell hud lim for å raskt montere vevsblokker på metallvev holdere med endocardial overflater vendt opp. Overfør metallholderne inn i vibratombadet av iskald oksygenert kuttløsning slik at vevet er helt nedsenket og flytt bladet til forkanten av vevet. Slå på vibratomen for å begynne å kutte med de forhåndsinnstilte parametrene, og kast de første flere skivene til bladet når utover trabeculae inn i det glatte endokardvevet.Når det eksperimentelle vevet er nådd, må du forsiktig overføre hver skive til individuelle 100 mikrometer nylonnettcellesiler i en kulturskål som inneholder romtemperatur oksygenert Tyrodes gjenopprettingsløsning og dekker skivene med nettingskiver for å holde vevskivene fra curling. Når alle skivene er samlet inn, må du forsiktig overføre hver skive til individuelle brønner på en seksbrønns plate som inneholder tre milliliter PBS per brønn. Skyll skiven med skånsom gynge og gjenta denne prosessen tre ganger med fersk steril PBS før du overfører prøvene til individuelle brønner av en seksbrønns plate som inneholder tre milliliter på 37 grader Celsius kulturmedium per brønn.Plasser deretter platen på en orbital shaker ved 20 omdreininger per minutt i en fuktet inkubator ved 37 grader, 30% oksygen og 5% karbondioksid. Etter 20 minutter med inkubasjon i gjenopprettingsløsning for nykuttede skiver eller umiddelbart etter kultering, overfør forsiktig stykke interesse til perfusjonssystemet vevbad og pin ned de fire hjørnene til gellaget mens du bruker minimal strekk til vevet. La skivene hvile i dette badet med sirkulerende gjenopprettingsløsning i ca. 10 minutter før du legger til 0,3 til 0,5 mikroliter lager Blebbistatin i reservoaret av utvinningsløsning.Mens skiven inkuberer i Blebbistatin, rekonstituerer 30 mikroliter av lagerspenningsfølsom fargestoff i en milliliter utvinningsløsning ved 37 grader. Etter 10 minutters blebbistatinbehandling, slå av pumpene og legg sakte 0,2 til 0,3 milliliter arbeidsfargeløsning på overflaten av skiven over en periode på 30 sekunder. Etter 90 sekunder slår du på pumpene for å vaske ut overflødig fargestoff.Etter å ha død skiven med lager kalsiumindikator som nettopp demonstrert, fokusere kameraene på skiven og tempo stykket på en hertz med en to millisekund puls bredde varighet på 1,5 ganger amplituden av forhåndsbestemt pacing terskelen. Plasser en dekkslip over vevsskiven og belyse skiven med LED-eksitasjonslyskilden. Deretter registrerer du de emitterte spennings- og kalsiumsignalene med kameraene på 1000 bilder per sekund.For å bese tilstand av spennings- og kalsiumoptiske kartdata, klikker du på betingelsesparametere og fjerner bakgrunn i riktig analyseprogramvare. Juster deretter signalkondisjoneringsparametrene for å oppnå optimalt handlingspotensial og kalsiumtransientspor. Hvis du vil beregne ledningshastigheten, velger du aktiveringskart og angir et start- og slutttidspunkt for å omfatte ett enkelt handlingspotensial i sporingen.Klikk deretter regionalt kart og velg interesseområdet for å vise aktiveringskartet for det valgte området. Deretter velger du ledningshastighetskart og velger start- og slutttiden. Juster oppløsningsverdiene for interpiksel basert på oppsettet etter behov.Klikk på Generer vektorkart for å velge et interesseområde og vise ledningshastighetsvektorene i dette området. Gjennomsnittlig, median, standardavvik og antall vektorer som inngår i analysen, samt den gjennomsnittlige forplantningsvinkelen for ledningshastighetsvektorer i det valgte området, vises. Hvis du vil beregne den potensielle varigheten av handlingen, velger du handlingspotensialets varighet, kalsiumtransient varighetskart og velger start- og slutttiden for å omfatte ett fullt handlingspotensial.Klikk deretter regional handling potensiell varighet beregning for å velge et område av interesse og for å generere handlingen potensiell varighet kartet. Hvis du vil bestemme oppstigningstiden, velger du oppstigningstid og velger start- og slutttiden for å velge oppslag av ett enkelt handlingspotensial eller kalsiumtransient. Angi start- og sluttprosentverdiene, og klikk beregn for å velge interesseområdet og for å bestemme gjennomsnittet, medianen, standardavviket og antall piksler som er inkludert i analysen av oppstigningstiden.For å bestemme kalsiumforfallet, velg kalsiumforfall og skriv inn start- og slutttiden for å omfatte hele forfallsdelen av et enkelt kalsiumtransient signal. Klikk deretter beregn tau for å velge interesseområdet og for å bestemme gjennomsnittlig, median, standardavvik og antall piksler som inngår i analysen av kalsiumforfallstid konstant. I dette representative eksperimentet ble handlingspotensialet og kalsiumtransientspor signalisert.Aktiveringstidene ble bestemt for hver piksel og isokronale kart over aktiveringstidene ble plottet fra den bedede spenningen og kalsiumsporene. Konduksjonshastighetsvektorer ble beregnet ved hjelp av aktiveringstidene og den kjente oppløsningen mellom pikselene. Kalsiumtransient forfall konstant ble målt ved å montere en polynom til den råtnende delen av kalsiumsporene.Virkningen potensiell varighet og kalsium forbigående varighet ble målt som varigheten mellom aktiveringstiden og en spesifisert prosentandel av re-polarisering eller kalsium fjerning fra cytoplasma henholdsvis. Oppgangstidene for spennings- og kalsiumspor ble også målt og kartlagt. I denne representative analysen ble effekten av doksorubicin på hjerteledning testet, noe som resulterte i en reduksjon av den tverrgående ledningshastigheten.Det er viktig å sørge for at skivene er i fullstendig kardioplegisk arrest for å minimere skade på vevet under kuttprosedyren og for å oppnå levedyktige skiver. På slutten av protokollen kan skivene fryses eller fikses for molekylær vurdering. De mekanistiske veiene som er involvert i det elektrofysiologiske fenomenet av interesse, kan da bestemmes.Utviklingen av denne menneskelige hjerteskiven modellen har tillatt studiet av svar på behandlinger og sykdom i menneskelig hjertevev bygge bro mellom dyr og kliniske studier. Når du arbeider med menneskelig vev mens du utfører denne teknikken, sørg for å bruke riktig PPE og å ta andre nødvendige sikkerhetsforanstaltninger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Med ekstraordinære optisk girkasse å kvantifisere Cardiac Biomarkers i humant Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Vurdere kollagen og Elastin press-avhengige Microarchitectures i Live, menneskelig motstand arterier av etiketten-fri fluorescens mikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto Mold-basert metode skaperverket stillaset-fri tredimensjonale hjerte vev

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Optisk avbildning av isolert murine ventrikkel myocytter

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabrikasjon av 3D cardiac microtissue arrays ved hjelp av humane iPSC-avledede kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Utvikle 3D-organisert humant hjertevev i en mikrofluidisk plattform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...