Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Financiamento pelo NIH (subsídios R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), pela Fundação Leducq (projeto RHYTHM) e uma Bolsa de Pós-Doutorado da American Heart Association (19POST34370122) são reconhecidos com gratidão.

Todos os métodos descritos foram realizados em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. A pesquisa foi aprovada pelo Institution Review Board (IRB) da Universidade George Washington.
NOTA: Corações humanos doadores foram adquiridos da Comunidade Regional de Transplantes de Washington como tecido descartado identificado com aprovação do IRB da Universidade George Washington. Corações explantados são presos cardioplegicament...

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	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. 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An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li><li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias.">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).</li><li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip.">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Goversen, B., van der Heyden, M. 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Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. 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(55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Aqui, apresentamos métodos passo a passo para obter fatias cardíacas viáveis de corações humanos presos cardioplegicamente e caracterizar funcionalmente as fatias usando mapeamento óptico duplo do potencial transmembrano e do cálcio intracelular. Com ambiente extracelular preservado e acoplamento de células nativas, as fatias cardíacas humanas podem ser usadas como um modelo preciso do coração humano para descoberta científica fundamental e para testes de eficácia e cardiotoxicidade de agentes farmacológico...

Os modelos animais têm sido uma ferramenta valiosa usada para compreender os mecanismos subjacentes da fisiologia humana e da fisiopatologia, bem como uma plataforma para testes preliminares de terapias para tratar várias doenças1. Grandes avanços foram dados no campo da pesquisa biomédica com base nesses estudos em animais2. No entanto, existem diferenças significativas entre fisiologias humanas e animais, incluindo camundongos, ratos, cobaias, coelhos, ovelhas, porcos e cães3,4. Como resultado, houve inúmeras terapias medicamentosas, genéticas e celulares que se mostraram promissoras durante a fase de testes em animais, mas não conseguiram fazer jus aos resultados nos ensaios clínicos5. Para preencher essa lacuna, miócitos cardíacos isolados e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram desenvolvidos como modelos para testar a resposta da fisiologia humana a várias drogas e doenças6. Cardiomiócitos derivados de células-tronco têm sido amplamente utilizados em sistemas de órgãos em um chip como um substituto do coração6,,7,,8. No entanto, a utilidade dos cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs) é impedida por seu fenótipo relativamente imaturo e pela falta de representação da subpopulação do cardiomiócito; o miocárdio maduro é uma estrutura complexa composta por vários tipos de células coexistitivas, como fibroblastos, neurônios, macrófagos e células endoteliais. Por outro lado, os cardiomiócitos humanos isolados são eletricamente maduros, e diferentes subpopulações de cardiomiócitos podem ser obtidas alterando os parâmetros de cultivo9. Ainda assim, esses miócitos geralmente apresentam morfologias potenciais de ação alteradas devido à falta de acoplamento de células celulares, rápida deseferição e ocorrência de comportamento proarrítmico in vitro10,11. Algumas das limitações foram abordadas por modelos de cultura celular 3D de iPSC-CMs e miócitos cardíacos. Esses modelos, que incluem esferoides, andaimes de hidrogel encapsulados culturas 3D, tecidos cardíacos projetados (EHTs) e sistemas de coração-em-um-chip, usam múltiplas populações de células cardíacas, como cardiomiócitos, fibroblastos e células endoteliais. Eles se auto-montam ou se reúnem ao longo de um andaime para formar estruturas 3D, e alguns até reproduzem a natureza anisotropica complexa do miocárdio. Esses modelos têm sido relatados como ter células de fenótipos maduros, propriedades conjunturais e perfis moleculares semelhantes ao tecido cardíaco. O sistema coração-em-um-chip também permite o estudo de efeitos sistêmicos em testes de drogas e modelos de doenças. No entanto, os modelos in vitro baseados em células não possuem a matriz extracelular nativa e, portanto, não podem imitar com precisão a eletrofisiologia do nível dos órgãos. As fatias cardíacas humanas, em contraste, têm uma matriz extracelular intacta e contatos nativos célula-célula, tornando-as úteis para examinar com mais precisão as propriedades arritmogênicas do miocárdio humano.
Pesquisadores desenvolveram fatias organotípicas cardíacas humanas como plataforma pré-clínica fisiológica para testes de drogas agudas e crônicas e para estudar eletrofisiologia cardíaca e progressão de doença cardíaca12,,13,14,,15,,16,,17,18,,19. Quando comparadas com cardiomiócitos derivados do iPSC, as fatias cardíacas humanas replicam mais fielmente a eletrofisiologia cardíaca humana adulta com um fenótipo de cardiomiócito maduro. Quando comparadas com cardiomiócitos humanos isolados, as fatias cardíacas apresentam durações potenciais de ação fisiológica devido ao acoplamento bem preservado celular-célula e à existência intrínseca de seus ambientes intra e extracelulares nativos.
Este protocolo descreve o processo de geração de fatias cardíacas humanas de corações doadores inteiros, realizando estudos agudos (ou seja, horas de duração) e crônicos (ou seja, dias de duração) para testar parâmetros de eletrofisiologia cardíaca através de mapeamento óptico. Embora este protocolo descreva apenas o uso do tecido ventricular esquerdo (LV), ele foi aplicado com sucesso a outras regiões do coração, bem como outras espécies como ratos, ratos, cobaias e suínos14,,20,,21,22. Nosso laboratório utiliza corações inteiros de doadores humanos que foram rejeitados para transplante nos últimos 5 anos, mas é viável que esses mesmos procedimentos sejam realizados em qualquer tecido de amostra de coração doador obtido por meios alternativos (por exemplo, implantes de dispositivo de assistência ventricular esquerda [LVAD], biópsias, miectomias) desde que os tecidos tenham a capacidade de serem seccionados em cubos. O mapeamento óptico é utilizado para análise neste estudo devido à sua capacidade de mapear simultaneamente potenciais de ação óptica e transitórios de cálcio com alta resolução espacial (100 x 100 pixels) e temporal (>1.000 quadros/s). Métodos alternativos também podem ser usados, como matrizes multieletrísmos (MEAs) ou microeletrodos, mas essas técnicas são limitadas por suas resoluções espaciais relativamente baixas. Além disso, os MEAs foram projetados para uso com culturas celulares, e microeletrodos afiados são mais facilmente gerenciados para uso com corações inteiros ou grandes cunhas de tecido.
O objetivo do artigo é permitir que mais pesquisadores usem tecidos cardíacos humanos para estudos de eletrofisiologia cardíaca. Deve-se notar que a tecnologia descrita neste artigo é relativamente simples e benéfica para estudos de curto prazo (na ordem de várias horas a dias). Cultura biomimética mais fisiológica para estudos de longo prazo (na ordem das semanas) tem sido discutida e descrita por uma série de outros estudos12,,18,23. Estimulação elétrica, carga mecânica e alongamento tecidual são mecanismos de condicionamento vantajosos que podem ajudar a limitar o aparecimento de remodelagem de tecido in vitro12,,18,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

As preparações de fatias cardíacas humanas foram recentemente desenvolvidas como uma plataforma para estudos de fisiologia humana e testes de terapia para diminuir a distância entre os ensaios animais e clínicos. Numerosos modelos animais e células têm sido usados para examinar os efeitos das drogas, mas essas respostas muitas vezes diferem em humanos. As fatias cardíacas humanas oferecem uma vantagem para o teste de drogas, pois são diretamente derivadas de corações humanos viáveis. Além de ter preservado estruturas multicelulares, acoplamento celular-célula e ambientes de matriz extracelular, fatias de tecido cardíaco humano podem ser usadas para testar diretamente o efeito de inúmeras drogas na fisiologia cardíaca humana adulta. O que distingue esse modelo de outras preparações cardíacas, como corações inteiros ou cunhas, é que as fatias podem ser submetidas à cultura de longo prazo. Como tal, as fatias cardíacas permitem estudar os efeitos agudos e crônicos das drogas. Além disso, a capacidade de coletar várias centenas a mil fatias de um único coração faz deste um modelo de alta produtividade para testar várias drogas em diferentes concentrações e combinações com outras drogas ao mesmo tempo. As fatias podem ser preparadas de qualquer região do coração. Neste protocolo, descrevemos a preparação de fatias ventriculares esquerdas isolando cubos de tecido da parede livre ventricular esquerda e seccionando-as em fatias usando um microtoma vibratório de alta precisão. Essas fatias podem então ser submetidas a experimentos agudos para medir a função eletrofisiológica cardíaca da linha de base ou cultivadas para estudos crônicos de drogas. Este protocolo também descreve o mapeamento óptico duplo de fatias cardíacas para gravações simultâneas de potenciais transmembranos e dinâmicas intracelulares de cálcio para determinar os efeitos das drogas que estão sendo investigadas.

Fatias organotípicas humanas foram coletadas do ventrículo esquerdo de um coração humano doador de acordo com o protocolo detalhado acima e ilustrado emFigura 1. Um sistema de mapeamento óptico de câmera dupla como esse emFigura 2foi utilizado na configuração de imagem vertical para realizar mapeamento óptico simultâneo de tensão e cálcio cerca de 1 h após a conclusão do protocolo de corte. Os dados foram analisados utilizando-se o RHYTHM1.2 (<stro...

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Este protocolo descreve o procedimento de secção e cultivo de fatias cardíacas humanas para testes de drogas pré-clínicos e detalha o uso de mapeamento óptico para o registro de tensão transmembrana e sinais de cálcio intracelular simultaneamente a partir dessas fatias.

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Este protocolo é significativo porque fornece aos pesquisadores as habilidades para empregar corações humanos doadores para testes de drogas fisiológicas pré-clínicos. Este tecido utiliza corantes de tensão e cálcio para a caracterização simultânea de potenciais de ação cardíaca e transitórios de cálcio intracelulares em fatias de tecido humano. Para configurar o sistema de mapeamento óptico, conecte um banho de tecido com uma camada de gel de polidimtilsiloxano inferior a um sistema de perfusão e circule um litro de solução de recuperação a 37 graus Celsius oxigenado com 100% de oxigênio através do sistema de perfusão a uma taxa de fluxo rápido o suficiente para manter a temperatura e evitar o acúmulo de perfusato de banho.Em seguida, use um alvo para ajustar o foco e o alinhamento das duas câmeras CMOS e use uma fonte de luz LED verde com um comprimento de onda de 520 mais ou menos cinco nanômetros para excitar os corantes sensíveis à tensão e indicadores de cálcio simultaneamente. Antes de obter seções teciduais, misture a solução de cardioplegia congelada e líquida e coloque o tecido cardíaco no banho de cardioplegia gelada e identifique a parede livre ventricular esquerda. Cole o gel de agarose pré-feito na parte de trás dos suportes de tecido metálico do vibratome.Corte blocos de tecido em cubos de um centímetro em solução cardioplégica fria e use adesivo de pele tópico para montar rapidamente os blocos de tecido nos suportes de tecido metálico com as superfícies do endocárdio voltadas para cima. Transfira os suportes metálicos para o banho de vibratome da solução de corte oxigenado gelado para que os tecidos fiquem completamente submersos e mova a lâmina para a borda frontal do tecido. Ligue o vibratome para começar a cortar com os parâmetros predefinidos, descartando as primeiras várias fatias até que a lâmina atinja além da trabecula no tecido endocárdico liso.Quando o tecido experimental for atingido, transfira cuidadosamente cada fatia em filtros individuais de células de malha de nylon de 100 micrômetros em um prato de cultura contendo a solução de recuperação de Tyrode oxigenada à temperatura ambiente e cubra as fatias com arruelas de malha para evitar que as fatias de tecido se enrolem. Quando todas as fatias tiverem sido coletadas, transfira cuidadosamente cada fatia em poços individuais de uma placa de seis poços contendo três mililitros de PBS por poço. Enxágüe a fatia com balanço suave e repita este processo três vezes com PBS fresco estéril antes de transferir as amostras para poços individuais de uma placa de seis poços contendo três mililitros de 37 graus Celsius de cultura média por poço.Em seguida, coloque a placa em um agitador orbital a 20 revoluções por minuto em uma incubadora umidificada a 37 graus, 30% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Após 20 minutos de incubação em solução de recuperação para fatias recém-cortadas ou imediatamente após a colheita, transfira cuidadosamente a fatia de juros para o banho de tecido do sistema de perfusão e fixe os quatro cantos para a camada de gel enquanto aplica um estiramento mínimo ao tecido. Deixe as fatias descansarem neste banho com solução de recuperação circulante por aproximadamente 10 minutos antes de adicionar 0,3 a 0,5 microliters de estoque Blebbistatin ao reservatório de solução de recuperação.Enquanto a fatia está incubando no Blebbistatin, reconstitua 30 microliters do corante sensível à tensão do estoque em um mililitro de solução de recuperação a 37 graus. Após 10 minutos de tratamento blebbistatin, desligue as bombas e carregue lentamente 0,2 a 0,3 mililitros de solução de corante de trabalho na superfície da fatia durante um período de 30 segundos. Após 90 segundos, ligue as bombas para lavar qualquer corante em excesso.Depois de morrer a fatia com indicador de cálcio de estoque como apenas demonstrado, concentre as câmeras na fatia e acelere a fatia em um hertz com uma duração de largura de pulso de dois milissegundos a 1,5 vezes a amplitude do limiar de ritmo predeterminado. Coloque uma mancha sobre a fatia de tecido e ilumine a fatia com a fonte de luz de excitação led. Em seguida, registos emitidos de tensão e cálcio com as câmeras a 1.000 quadros por segundo.Para condicionar os dados de mapeamento óptico de tensão e cálcio, no software de análise adequado, clique nos parâmetros de condição e remova o fundo. Em seguida, ajuste os parâmetros de condicionamento de sinal para obter o potencial de ação ideal e traços transitórios de cálcio. Para calcular a velocidade de condução, selecione o mapa de ativação e insira um tempo de início e fim para abranger um único potencial de ação no rastreamento.Em seguida, clique no mapa regional e selecione a região de interesse para exibir o mapa de ativação da região selecionada. Em seguida, selecione o mapa de velocidade de condução e selecione os tempos de início e fim. Ajuste os valores de resolução entre pixels com base na configuração conforme necessário.Clique em gerar mapa vetorial para selecionar uma região de interesse e exibir os vetores de velocidade de condução dentro dessa região. O desvio médio, mediano, padrão e o número de vetores incluídos na análise, bem como o ângulo médio de propagação dos vetores de velocidade de condução na região selecionada serão exibidos. Para calcular a duração potencial da ação, selecione a duração potencial da ação, o mapa de duração transitória do cálcio e selecione os tempos de início e fim para abranger um potencial de ação completo.Em seguida, clique no cálculo de duração potencial da ação regional para selecionar uma região de interesse e gerar o mapa de duração potencial de ação. Para determinar o tempo de elevação, selecione o tempo de ascensão e selecione os tempos de início e fim para selecionar o upstroke de um único potencial de ação ou transitório de cálcio. Digite os valores percentuais de início e fim e clique em calcular para selecionar a região de interesse e determinar a média, mediana, desvio padrão e número de pixels incluídos na análise do tempo de elevação.Para determinar a decomposição do cálcio, selecione a decomposição do cálcio e entre nos tempos de início e fim para abranger toda a porção de decomposição de um único sinal transitório de cálcio. Em seguida, clique em calcular tau para selecionar a região de interesse e determinar a média, mediana, desvio padrão e número de pixels incluídos na análise do tempo de decomposição de cálcio constante. Neste experimento representativo, o potencial de ação e os traços transitórios de cálcio foram condicionados ao sinal.Os tempos de ativação foram determinados para cada pixel e mapas isocronais dos tempos de ativação foram traçados a partir da tensão condicional e traços de cálcio. Os vetores de velocidade de condução foram calculados usando os tempos de ativação e a conhecida resolução entre pixels. A constante de decomposição transitória de cálcio foi medida por encaixar um polinômio na porção em decomposição dos traços de cálcio.A duração potencial da ação e a duração transitória do cálcio foram medida como a duração do tempo entre o tempo de ativação e um percentual especificado da re polarização ou remoção de cálcio do citoplasma, respectivamente. Os tempos de elevação dos traços de tensão e cálcio também foram medidos e mapeados. Nesta análise representativa, o efeito da doxorubicina na condução cardíaca foi testado resultando em uma redução da velocidade de condução transversal.É importante ter certeza de que as fatias estão em parada cardioplégica completa para minimizar os danos ao tecido durante o procedimento de corte e obter fatias viáveis. No final do protocolo, as fatias podem ser congeladas ou fixadas para avaliação molecular. As vias mecanicistas envolvidas no fenômeno eletrofisiológico de interesse podem então ser determinadas.O desenvolvimento desse modelo de fatia cardíaca humana permitiu o estudo das respostas aos tratamentos e doenças no tecido cardíaco humano, fazendo a ponte entre estudos animais e clínicos. Ao trabalhar com tecidos humanos durante a execução desta técnica, certifique-se de usar o EPI apropriado e tomar quaisquer outras precauções de segurança necessárias.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengenharia

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Usando transmissão óptica extraordinária para quantificar biomarcadores cardíacos no soro humano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...