Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
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Se agradece con gratitud la financiación de NIH (becas R21 EB023106, R44 HL139248 y R01 HL126802), por la fundación Leducq (proyecto RHYTHM) y una beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (19POST34370122).

Todos los métodos descritos se han realizado de conformidad con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. La investigación fue aprobada por la Junta de Revisión de Instituciones (IRB) en la Universidad George Washington.
NOTA: Los corazones humanos de los donantes fueron adquiridos de la Comunidad Regional de Trasplantes de Washington como tejido desechado desidentificado con la aprobación del IRB de la Universidad George Washington. Los ...

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	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic?+An+industry+perspective.">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? 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Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Aquí, presentamos métodos paso a paso para obtener rebanadas cardíacas viables de corazones humanos cardioplególo y para caracterizar funcionalmente las rebanadas utilizando el mapeo óptico dual del potencial transmembrano y el calcio intracelular. Con un ambiente extracelular preservado y acoplamiento de células celulares nativas, las rebanadas cardíacas humanas se pueden utilizar como un modelo preciso del corazón humano para el descubrimiento científico fundamental y para pruebas de eficacia y cardiotoxicidad...

Los modelos animales han sido una herramienta valiosa utilizada para comprender los mecanismos subyacentes de la fisiología humana y la fisiopatología, así como una plataforma para las pruebas preliminares de terapias para tratar diversas enfermedades1. Se han realizado grandes avances en el campo de la investigación biomédica basada en estos estudios en animales2. Sin embargo, existen diferencias interespecíficos significativas entre las fisiologías humanas y animales, incluidos ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, ovejas, cerdos y perros3,4. Como resultado, ha habido numerosas terapias farmacológicas, genéticas y celulares que mostraron promesa durante la etapa de pruebas con animales, pero no pudieron estar a la altura de los resultados en los ensayos clínicos5. Para colmar esta brecha, se desarrollaron miocitos cardíacos aislados y células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) como modelos para probar la respuesta de la fisiología humana a diversos fármacos y enfermedades6. Los cardiomiocitos derivados de células madre han sido ampliamente utilizados en sistemas de órgano en un chip como sustituto del corazón6,,7,,8. Sin embargo, la utilidad de los cardiomiocitos derivados del iPSC (iPSC-CM) se ve obstaculizada por su fenotipo relativamente inmaduro y la falta de representación de la subpoblación de cardiomiocitos; el miocardio maduro es una estructura compleja compuesta por varios tipos celulares coexistibles como fibroblastos, neuronas, macrófagos y células endoteliales. Por otro lado, los cardiomiocitos humanos aislados son eléctricamente maduros, y diferentes subpoblaciones de cardiomiocitos se pueden obtener mediante la alteración de los parámetros de cultivo9. Aún así, estos miocitos generalmente exhiben morfologías potenciales de acción alteradas debido a la falta de acoplamiento de células celulares, des-diferenciación rápida, y la ocurrencia de comportamiento proarrítmico in vitro10,11. Algunas de las limitaciones fueron abordadas por modelos de cultivo celular 3D de iPSC-CM y miocitos cardíacos. Estos modelos, que incluyen esferoides, scaffolds de hidrogel encapsulados cultivos 3D, tejidos cardíacos diseñados (EHT) y sistemas de corazón en una ardilla, utilizan múltiples poblaciones de células cardíacas como cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales. Se automontan o ensamblan a lo largo de un andamio para formar estructuras 3D, y algunos incluso reproducen la compleja naturaleza anisotrópica del miocardio. Se ha notificado que estos modelos tienen células de fenotipos maduros, propiedades contráctiles y perfiles moleculares similares al tejido cardíaco. El sistema de corazón en un chip también permite el estudio de los efectos sistémicos en las pruebas de drogas y los modelos de enfermedades. Sin embargo, los modelos basados en células in vitro carecen de la matriz extracelular nativa y, por lo tanto, no pueden imitar con precisión la electrofisiología a nivel de órgano. Las rebanadas cardíacas humanas, en cambio, tienen una matriz extracelular intacta y contactos nativos de célula a célula, lo que los hace útiles para examinar con mayor precisión las propiedades arritmogénicas del miocardio humano.
Los investigadores han desarrollado rebanadas organotípicas cardíacas humanas como plataforma fisiológica preclínica para pruebas de fármacos agudos y crónicos y para estudiar la electrofisiología cardíaca y la progresión de enfermedades cardíacas12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19. En comparación con los cardiomiocitos derivados de iPSC, las rebanadas cardíacas humanas replican más fielmente la electrofisiología cardíaca humana adulta con un fenotipo maduro de cardiomiocitos. En comparación con los cardiomiocitos humanos aislados, las rebanadas cardíacas exhiben duraciones potenciales de acción fisiológica debido al acoplamiento de células celulares bien conservado y la existencia intrínseca de sus ambientes intra y extracelulares nativos.
Este protocolo describe el proceso de generación de rebanadas cardíacas humanas a partir de corazones de donantes enteros, realizando estudios agudos (es decir, de horas de duración) y crónicos (es decir, de días de duración) para probar parámetros de electrofisiología cardíaca a través de mapeo óptico. Si bien este protocolo describe sólo el uso del tejido ventricular izquierdo (LV), se ha aplicado con éxito a otras regiones del corazón, así como a otras especies como ratones, ratas, conejillos de indias y cerdos14,,20,,21,,22. Nuestro laboratorio utiliza corazones de donantes humanos enteros que han sido rechazados para el trasplante durante los últimos 5 años, pero es factible que estos mismos procedimientos se lleven a cabo en cualquier tejido de muestra de corazón del donante obtenido por medios alternativos (por ejemplo, implantes de dispositivo de asistencia ventricular izquierda [LVAD], biopsias, mitomigenes) siempre y cuando los tejidos tengan la capacidad de ser seccionados en cubos. El mapeo óptico se emplea para el análisis en este estudio debido a su capacidad para mapear simultáneamente potenciales de acción óptica y transitorios de calcio con alta resolución espacial (100 x 100 píxeles) y temporal (>1.000 fotogramas/s). También se pueden utilizar métodos alternativos, como matrices multielectrodas (AMA) o microelectrodos, pero estas técnicas están limitadas por sus resoluciones espaciales relativamente bajas. Además, los MEA se diseñaron para su uso con cultivos celulares, y los microelectrodos afilados se gestionan más fácilmente para su uso con corazones enteros o cuñas de tejido grandes.
El objetivo del artículo es permitir que más investigadores utilicen tejidos cardíacos humanos para estudios de electrofisiología cardíaca. Cabe señalar que la tecnología descrita en este artículo es relativamente simple y beneficioso para estudios a corto plazo (en el orden de varias horas a días). Más cultivo biomimético fisiológico para estudios a largo plazo (sobre el orden de las semanas) ha sido discutido y descrito por un número de otros estudios12,18,23. La estimulación eléctrica, la carga mecánica y el estiramiento de tejidos son mecanismos de acondicionamiento ventajosos que pueden ayudar a limitar la aparición de la remodelación in vitro del tejido12,,18,,23.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

Recientemente se han desarrollado preparaciones de rebanadas cardíacas humanas como una plataforma para estudios de fisiología humana y pruebas terapéuticas para cerrar la brecha entre los ensayos en animales y clínicos. Numerosos modelos animales y celulares se han utilizado para examinar los efectos de los fármacos, sin embargo, estas respuestas a menudo difieren en los seres humanos. Las rebanadas cardíacas humanas ofrecen una ventaja para las pruebas de drogas, ya que se derivan directamente de corazones humanos viables. Además de haber preservado estructuras multicelulares, acoplamiento de células celulares y entornos de matriz extracelular, las rebanadas de tejido cardíaco humano se pueden utilizar para probar directamente el efecto de innumerables fármacos en la fisiología cardíaca humana adulta. Lo que distingue a este modelo de otras preparaciones del corazón, como corazones enteros o cuñas, es que las rebanadas pueden ser sometidas a cultura a largo plazo. Como tal, las rebanadas cardíacas permiten estudiar los efectos agudos y crónicos de los medicamentos. Además, la capacidad de recoger varios cientos a mil rebanadas de un solo corazón hace de este un modelo de alto rendimiento para probar varios fármacos en diferentes concentraciones y combinaciones con otros medicamentos al mismo tiempo. Las rebanadas se pueden preparar desde cualquier región del corazón. En este protocolo, describimos la preparación de las rodajas ventriculares izquierdas aislando cubos de tejido de la pared libre ventricular izquierda y segándolas en rodajas usando un microtoma vibratorio de alta precisión. Estas rebanadas pueden ser sometidas a experimentos agudos para medir la función electrofisiológica cardíaca basal o cultivadas para estudios de drogas crónicas. Este protocolo también describe el mapeo óptico dual de las rebanadas cardíacas para grabaciones simultáneas de potenciales transmembranas y dinámicas de calcio intracelulares para determinar los efectos de los fármacos que se están investigando.

Las rebanadas organotípicas humanas se recogieron del ventrículo izquierdo de un corazón humano donante de acuerdo con el protocolo detallado anteriormente e ilustrado enFigura 1. Un sistema de mapeo óptico de cámara dual como ese enFigura 2se utilizó en la configuración de imágenes verticales para realizar el mapeo óptico simultáneo de voltaje y calcio aproximadamente 1 h después de la finalización del protocolo de corte. Los datos se analizaron uti...

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Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Este protocolo es significativo porque proporciona a los investigadores las habilidades para emplear corazones humanos donantes para pruebas de drogas fisiológicas preclínicas. Este tejido utiliza tanto el voltaje como los tintes de calcio para la caracterización simultánea de potenciales de acción cardíaca y transitorios de calcio intracelular en las rodajas de tejido humano. Para configurar el sistema de mapeo óptico, conecte un baño de tejido con una capa de gel polidimetilsiloxano inferior a un sistema de perfusión y circule un litro de solución de recuperación a 37 grados Celsius oxigenado con 100% de oxígeno a través del sistema de perfusión a un caudal lo suficientemente rápido como para mantener la temperatura y evitar la acumulación de baño perfundido.A continuación, utilice un objetivo para ajustar el enfoque y la alineación de las dos cámaras CMOS y utilice una fuente de luz LED verde con una longitud de onda de 520 más o menos cinco nanómetros para excitar los tintes sensibles al voltaje y del indicador de calcio simultáneamente. Antes de obtener secciones de tejido, mezcle la solución de cardioplegia congelada y líquida y coloque el tejido cardíaco en el baño de cardioplegia helada e identifique la pared libre de ventrículo izquierda. Pegue el gel de agarosa pre-hecho en la parte posterior de los soportes de tejido metálico del vibratomo.Corte bloques en cubos de un centímetro de tejido en solución cardiopléjica fría y utilice adhesivo tópico para la piel para montar rápidamente los bloques de tejido en los soportes de tejido metálico con las superficies endocardiales hacia arriba. Transfiera los soportes metálicos al baño vibratoma de la solución de corte oxigenado con hielo frío para que los tejidos estén completamente sumergidos y mueva la hoja al borde frontal del tejido. Encienda el vibratome para comenzar a cortar con los parámetros preestablecidos, descartando las primeras varias rebanadas hasta que la hoja llegue más allá del trabeculado en el tejido endocardio liso.Cuando se haya alcanzado el tejido experimental, transfiera cuidadosamente cada rebanada a coladores de células de malla de nylon individuales de 100 micrómetros en un plato de cultivo que contenga la solución de recuperación de Tyrode oxigenada a temperatura ambiente y cubra las rodajas con arandelas de malla para evitar que las rodajas de tejido se enrosquen. Cuando se hayan recogido todas las rodajas, transfiera cuidadosamente cada rebanada a pozos individuales de una placa de seis pozos que contenga tres mililitros de PBS por pozo. Enjuague la rodaja con un suave balanceo y repita este proceso tres veces con PBS estéril fresco antes de transferir las muestras a pozos individuales de una placa de seis pozos que contenga tres mililitros de medio de cultivo de 37 grados Celsius por pozo.A continuación, coloque la placa en un agitador orbital a 20 revoluciones por minuto en una incubadora humidificada a 37 grados, 30% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Después de 20 minutos de incubación en la solución de recuperación para rodajas recién cortadas o inmediatamente después del cultivo, transfiera cuidadosamente la rebanada de interés al baño de tejido del sistema de perfusión y pin por las cuatro esquinas a la capa de gel mientras aplica un estiramiento mínimo al tejido. Deje reposar las rodajas en este baño con solución de recuperación circulante durante aproximadamente 10 minutos antes de añadir 0,3 a 0,5 microlitros de stock de Blebbistatin al depósito de solución de recuperación.Mientras la rebanada está incubando en la Blebbistatin, reconstituir 30 microlitros del tinte sensible al voltaje de las existencias en un mililitro de solución de recuperación a 37 grados. Después de 10 minutos de tratamiento con Blebbistatin, apague las bombas y cargue lentamente de 0,2 a 0,3 mililitros de solución de tinte de trabajo sobre la superficie de la rebanada durante un período de 30 segundos. Después de 90 segundos, encienda las bombas para lavar cualquier exceso de tinte.Después de morir la rebanada con el indicador de calcio de stock como acaba de demostrar, enfoque las cámaras en la rebanada y el ritmo de la rebanada en un hercio con una duración de ancho de pulso de dos milisegundos a 1,5 veces la amplitud del umbral de ritmo predeterminado. Coloque un cubreobjetos sobre la rebanada de tejido e ilumine la rebanada con la fuente de luz de excitación LED. A continuación, grabe las señales de voltaje y calcio emitidas con las cámaras a 1.000 fotogramas por segundo.Para acondicionar los datos de mapeo óptico de voltaje y calcio, en el software de análisis adecuado, haga clic en los parámetros de condición y elimine el fondo. A continuación, ajuste los parámetros de acondicionamiento de la señal para obtener un potencial de acción óptimo y trazas transitorias de calcio. Para calcular la velocidad de conducción, seleccione el mapa de activación e introduzca una hora inicial y final para abarcar un único potencial de acción en el seguimiento.A continuación, haga clic en el mapa regional y seleccione la región de interés para mostrar el mapa de activación de la región seleccionada. A continuación, seleccione el mapa de velocidad de conducción y seleccione las horas de inicio y finalización. Ajuste los valores de resolución entre píxeles en función de la configuración según sea necesario.Haga clic en Generar mapa vectorial para seleccionar una región de interés y mostrar los vectores de velocidad de conducción dentro de esa región. Se mostrará la media, la mediana, la desviación estándar y el número de vectores incluidos en el análisis, así como el ángulo medio de propagación de los vectores de velocidad de conducción en la región seleccionada. Para calcular la duración potencial de la acción, seleccione la duración potencial de la acción, el mapa de duración transitoria de calcio y seleccione las horas de inicio y finalización para abarcar un potencial de acción completo.A continuación, haga clic en el cálculo de duración potencial de acción regional para seleccionar una región de interés y generar el mapa de duración potencial de acción. Para determinar el tiempo de subida, seleccione el tiempo de subida y seleccione las horas de inicio y finalización para seleccionar la salida hacia arriba de un solo potencial de acción o transitorio de calcio. Introduzca los valores de porcentaje inicial y final y haga clic en Calcular para seleccionar la región de interés y determinar la media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis del tiempo de subida.Para determinar la caries de calcio, seleccione la caries de calcio e introduzca las horas de inicio y finalización para abarcar toda la porción de caries de una sola señal transitoria de calcio. A continuación, haga clic en Calcular tau para seleccionar la región de interés y determinar la media, la mediana, la desviación estándar y el número de píxeles incluidos en el análisis de la constante de tiempo de descomposición del calcio. En este experimento representativo, el potencial de acción y las trazas transitorias de calcio fueron condicionadas por la señal.Los tiempos de activación se determinaron para cada píxel y los mapas isocronales de los tiempos de activación se trazaron a partir de los rastros de voltaje condicionado y calcio. Los vectores de velocidad de conducción se calcularon utilizando los tiempos de activación y la resolución entre píxeles conocida. La constante de caries transitoria de calcio se midió ajustando un polinomio a la porción en descomposición de los rastros de calcio.La duración potencial de la acción y la duración transitoria del calcio se midieron como la duración del tiempo entre el tiempo de activación y un porcentaje especificado de la repolspolarización o eliminación de calcio del citoplasma respectivamente. Los tiempos de subida de los rastros de tensión y calcio también se midieron y mapearon. En este análisis representativo, se probó el efecto de la doxorubicina en la conducción cardíaca, lo que resultó en una reducción de la velocidad de conducción transversal.Es importante asegurarse de que las rebanadas están en completa detención cardiopléjica para minimizar el daño al tejido durante el procedimiento de corte y para obtener rebanadas viables. Al final del protocolo, las rebanadas pueden congelarse o fijarse para su evaluación molecular. Las vías mecanicistas involucradas en el fenómeno electrofisiológico de interés pueden determinarse.El desarrollo de este modelo de rebanada cardiaca humana ha permitido el estudio de las respuestas a tratamientos y enfermedades en el tejido cardíaco humano que cierran la brecha entre los estudios animales y clínicos. Cuando trabaje con tejidos humanos mientras realiza esta técnica, asegúrese de usar el EPP adecuado y de tomar cualquier otra precaución de seguridad necesaria.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Investigación

Bioingeniería

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...