Name: preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

LEDUCQ vakfı (rhythm projesi) ve Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (19POST343370122) tarafından NIH (r21 EB023106, R44 HL139248 ve R01 HL126802 hibe) tarafından finanse edilmektedir.

Açıklanan tüm yöntemler, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Araştırma, George Washington Üniversitesi'ndeki Kurum İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.
NOT: Donör insan kalpleri George Washington Üniversitesi IRB onayı ile deidentified atılmış doku olarak Washington Bölgesel Transplant Topluluk elde edilmiştir. Ekrende kalpler kalp buz gibi kardiyopleji çözeltisi ile kalp kızartılarak kardiyetik...

<ol>
	<li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+animal+modeling.">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li><li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+today's+translational+medicine+world.">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+human+disease:+An+evolutionary+perspective.">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic?+An+industry+perspective.">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li><li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias.">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).</li><li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip.">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li><li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening:+Special+focus+on+IK1.">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes.">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559 (2010).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168 (2019).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117 (2019).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies.">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li><li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium.">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening.">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li><li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Slices:+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research.">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li><li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues.">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).</li><li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-Source+Multiparametric+Optocardiography.">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721 (2019).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts.">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li><li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis.">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae.">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).</li><li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli,+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration,+and+different+steady-state+frequencies.">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li><li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure.">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li></ol>

Burada, kardiyoplegically tutuklanmış insan kalplerinden canlı kardiyak dilimler elde etmek ve transmembran potansiyeli ve hücre içi kalsiyumun çift optik haritalamasını kullanarak dilimleri işlevsel olarak karakterize etmek için adım adım yöntemler salıyoruz. Korunmuş hücre dışı ortam ve yerli hücre-hücre kaplini ile, insan kardiyak dilimleri temel bilimsel keşif ve farmakolojik ajanlar ve gen tedavileri etkinliği ve kardiyotoksisite testi için insan kalbinin doğru bir model olarak kullanılabil...

Hayvan modelleri insan fizyolojisi ve patofizyolojisi altta yatan mekanizmaları anlamak için kullanılan değerli bir araç olmuştur, hem de çeşitli hastalıkların tedavisinde tedavilerin ön test için bir platform1. Büyük adımlar bu hayvan çalışmaları 2 dayalı biyomedikal araştırma2alanında alınmıştır. Ancak, fareler, sıçanlar, kobaylar, tavşanlar, koyun, domuzlar ve köpekler3,4dahil olmak üzere insan ve hayvan fizyolojisi arasında önemli türler arası farklılıklar vardır. Sonuç olarak, çok sayıda ilaç olmuştur, gen, ve hayvan test aşamasında umut gösterdi hücre tedavileri ama klinik çalışmalarda sonuçlara kadar yaşamak için başarısızoldu 5. Bu boşluğu kapatmak için, izole kardiyak miyositler ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) çeşitli ilaçlar ve hastalıklara insan fizyolojisi yanıtını test etmek için model olarak geliştirilmiştir6. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler yaygın kalp bir vekil olarak organ-on-a-chip sistemlerinde kullanılmaktadır6,7,8. Ancak, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin (iPSC-CMs) yararlılığı göreceli olarak olgunlaşmamış fenotipve kardiyomiyosit alt popülasyonunun temsil eksikliği ile engellenir; olgun miyokardiyum fibroblastlar, nöronlar, makrofajlar ve endotel hücreleri gibi birkaç birlikte hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir yapıdır. Diğer taraftan, izole insan kardiyomiyositleri elektriksel olarak olgundur ve farklı kardiyomiyosit alt popülasyonları99. Yine de, bu miyositler genellikle hücre-hücre kaplin eksikliği nedeniyle değişmiş eylem potansiyeli morfolojileri sergilemek, hızlı de-farklılaşma, ve in vitro proaritmik davranış oluşumu10,11. Bazı sınırlamalar iPSC-CM'ler ve kardiyak miyositlerin 3D hücre kültürü modelleri ile ele alınmıştır. Küresel balıklar, hidrojel iskelesi kapsüllü 3D kültürler, mühendislik kalp dokuları (EHTs) ve kalp-on-a-chip sistemleri içeren bu modeller, kardiyomiyositler gibi birden fazla kardiyak hücre popülasyonları kullanın, fibroblastlar, ve endotel hücreleri. Ya kendi kendine monte ya da 3D yapılar oluşturmak için bir iskele boyunca monte, ve hatta bazı miyokardin karmaşık anizotropik doğasını çoğaltmak. Bu modellerin olgun fenotip, kontraktil özellikleri ve kardiyak dokuya benzer moleküler profillere sahip olduğu bildirilmiştir. Kalp-on-a-chip sistemi de ilaç testi ve hastalık modellerinde sistemik etkileri çalışma sağlar. Ancak, in vitro hücre tabanlı modeller yerli ekstrasellüler matris eksikliği ve bu nedenle doğru organ düzeyinde elektrofizyoloji taklit edemez. Buna karşılık, insan kardiyak dilimleri, bozulmamış bir hücre dışı matris ve yerli hücre-hücre temasları var, daha doğru insan miyokardiyum aritmiojenik özelliklerini incelemek için yararlı hale.
Araştırmacılar akut ve kronik ilaç testi için fizyolojik bir preklinik platform olarak insan kardiyak organotipik dilimler geliştirdik ve kardiyak elektrofizyoloji ve kalp hastalığı ilerlemesi12çalışma,13,14,15,16,17,18,19. iPSC türetilmiş kardiyomiyositler ile karşılaştırıldığında, insan kardiyak dilimleri daha sadakatle olgun bir kardiyomiyosit fenotip ile yetişkin insan kardiyak elektrofizyoloji çoğaltmak. İzole insan kardiyomiyositleri ile karşılaştırıldığında, kardiyak dilimler iyi korunmuş hücre-hücre kaplini ve doğal hücre içi ve hücre dışı ortamların içsel varlığı nedeniyle fizyolojik etki potansiyel süreleri sergilerler.
Bu protokol, tüm donör kalplerden insan kardiyak dilimleri üretme, optik haritalama yoluyla kardiyak elektrofizyoloji parametrelerini test etmek için akut (yani, saatler süren) ve kronik (yani günler boyu) çalışmalar yapma sürecini tanımlar. Bu protokol sadece sol ventrikül (LV) dokusunun kullanımını açıklarken, başarıyla kalbin diğer bölgelerinyanı sıra fareler, sıçanlar, kobay gibi diğer türler için uygulanmıştır ve domuz14,20,21,22. Laboratuvarımız son 5 yıldır transplantasyon için reddedilen tüm insan donör kalplerini kullanmektedir, ancak dokular küpler halinde kesitlenme yeteneğine sahip olduğu sürece, alternatif yollarla elde edilen herhangi bir donör kalp örnek dokuları (örneğin, sol ventriküler yardımcı cihaz [LVAD] implantasyonları, biyopsiler, miektomies) üzerinde aynı işlemlerin yapılması mümkündür. Optik haritalama, yüksek uzamsal (100 x 100 piksel) ve zamansal (>1.000 kare/s) çözünürlüğe sahip optik eylem potansiyellerini ve kalsiyum geçicilerini eş zamanlı olarak haritalama kapasitesi nedeniyle bu çalışmada analiz için kullanılmaktadır. Çoklu elektrot dizileri (MEA) veya mikroelektrotlar gibi alternatif yöntemler de kullanılabilir, ancak bu teknikler nispeten düşük uzamsal çözünürlükleri ile sınırlıdır. Ayrıca, MEAs hücre kültürleri ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ve keskin mikroelektrotlar daha kolay tüm kalpleri veya büyük doku takozları ile kullanılmak üzere yönetilir.
Makalenin amacı, daha fazla araştırmacının kardiyak elektrofizyoloji çalışmaları için insan kalp dokularını kullanmasını sağlamaktır. Bu makalede açıklanan teknoloji nispeten basit ve kısa vadeli çalışmalar için yararlı olduğu unutulmamalıdır (gün birkaç saat sırayla). Uzun vadeli çalışmalar için daha fizyolojik biyomimetik kültür (hafta sırasına göre) tartışıldı ve diğer çalışmaların bir dizi tarafından açıklanan12,18,23. Elektriksel stimülasyon, mekanik yükleme ve doku germe in vitro doku remodelling başlangıcını sınırlamak yardımcı olabilir avantajlı klima mekanizmalarıvardır 12,18,23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL BD Syringe</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-4-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td></td>
			<td>stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3c Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T630LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (RH237)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET690/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Rhod2AM)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET590/33m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation dichroic mirror</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T550LPXR-UF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/40x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat exchanger</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50145502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED excitation light source</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>UHP-Mic-LED-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micam Ultima L type CMOS camera</td>
			<td>Scimedia</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07522-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum pacing wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P6867</td>
			<td>nonionic, surfactant polyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition and stimulator</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Powerlab 4/26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, dry bead</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z378550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stone Oxygen Diffuser</td>
			<td>Waterwood</td>
			<td>B00O0NUVM0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td>
			<td>gobiomed</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound sonicator</td>
			<td></td>
			<td>Branson 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 smz</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices

İnsan kardiyak dilim preparatları son zamanlarda hayvan ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu köprü için insan fizyolojisi çalışmaları ve tedavi testleri için bir platform olarak geliştirilmiştir. Çok sayıda hayvan ve hücre modelleri ilaçların etkilerini incelemek için kullanılmıştır, ancak bu tepkiler genellikle insanlarda farklıdır. İnsan kardiyak dilimleri doğrudan canlı insan kalplerinden türetilmiştir bu ilaç testi için bir avantaj sunuyoruz. Korunmuş çok hücreli yapılara sahip olmanın yanı sıra, hücre-hücre kaplini ve hücre dışı matriks ortamları, insan kardiyak doku dilimleri doğrudan yetişkin insan kardiyak fizyolojisi üzerinde sayısız ilaçların etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu modeli tüm kalpler veya takozlar gibi diğer kalp preparatlarından ayıran şey, dilimlerin uzun vadeli kültüre maruz kalınmasıdır. Bu nedenle, kardiyak dilimleri ilaçların akut yanı sıra kronik etkileri incelenmesi için izin verir. Ayrıca, tek bir kalpten birkaç yüz bin dilim toplamak için yeteneği bu aynı anda diğer ilaçlar ile değişen konsantrasyonlarda ve kombinasyonları çeşitli ilaçlar test etmek için yüksek iş yapma modeli yapar. Dilimler kalbin herhangi bir bölgesinden hazırlanabilir. Bu protokolde, sol ventrikül serbest duvardan doku küpleri izole ve yüksek hassasiyetli titreşimli mikrotom kullanarak dilimler halinde kesitler halinde keserek sol ventrikül dilimleri hazırlanması nı açıklıyoruz. Bu dilimler daha sonra ya temel kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonu ölçmek için akut deneylere tabi tutulabilir ya da kronik ilaç çalışmaları için kültürlü. Bu protokol aynı zamanda, araştırılan ilaçların etkilerini belirlemek için transmembran potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum dinamiğinin eşzamanlı kayıtları için kardiyak dilimlerin çift optik haritalamasını da açıklamaktadır.

İnsan organotipik dilimleri yukarıda ayrıntılı ve resimli protokole göre bir donör insan kalbinin sol ventrikül toplanmıştırŞekil 1. Böyle bir çift kamera optik haritalama sistemiŞekil 2dilimleme protokolünün tamamlanmasından sonra yaklaşık 1 saat voltaj ve kalsiyumeşzamanlı optik haritalama gerçekleştirmek için dik görüntüleme yapılandırmasında kullanılmıştır. Veriler RHYTHM1.2 kullanılarak analiz edildi (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices at JoVE.com

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Bu protokol, araştırmacılara preklinik fizyolojik ilaç testleri için donör insan kalbini kullanma becerileri sağladığı için önemlidir. Bu doku, insan doku dilimlerinde kardiyak etki potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum geçicilerinin eşzamanlı karakterizasyonu için hem voltaj hem de kalsiyum boyaları kullanır. Optik haritalama sistemi kurmak için, bir perfüzyon sistemine bir alt polidimetilsiloksane jel tabakası ile bir doku banyosu eklemek ve 37 santigrat derece de kurtarma çözeltisi bir litre sirkülasyon santigrat sıcaklığı korumak ve banyo perfusat birikmesini önlemek için yeterince hızlı bir akış hızında perfüzyon sistemi ile% 100 oksijen ile oksijenli.Ardından, iki CMOS kameranın odak ve hizalanmasını ayarlamak için bir hedef kullanın ve voltaj duyarlı ve kalsiyum gösterge boyalarını aynı anda heyecanlandırmak için 520 artı veya eksi beş nanometre dalga boyuna sahip yeşil bir LED ışık kaynağı kullanın. Doku bölümleri elde etmeden önce, dondurulmuş ve sıvı kardiyopleji çözeltisi karıştırın ve buz soğuk kardiyopleji banyo içine kalp dokusu yerleştirin ve sol ventrikül serbest duvar tanımlamak. Vibratom metal doku tutucuları arkasına önceden yapılmış agarose jel tutkal.Soğuk kardiyoplejik çözelti doku bir santimetre küp blokları kesin ve hızlı bir şekilde endokardiyal yüzeyler yukarı bakan metal doku tutucuları üzerine doku blokları monte etmek için topikal deri yapıştırıcı kullanın. Metal tutucuları buz gibi oksijenli dilimleme çözeltisinin vibratom banyosuna aktarın, böylece dokular tamamen batırılır ve bıçağı dokunun ön kenarına taşıyın. Önceden ayarlanmış parametrelerle dilimleme başlamak için vibratome açın, bıçak pürüzsüz endokardiyal doku içine trabeculae ötesine ulaşana kadar ilk birkaç dilim atarak.Deneysel dokuya ulaşıldığında, her dilimi oda sıcaklığında tyrode'un iyileşme solüsyonu içeren bir kültür kabında 100 mikrometrelik naylon kafes hücre süzgecine dikkatlice aktarın ve doku dilimlerinin kıvrılmasını engellemek için dilimleri örgü yıkayıcılarla kapatın. Tüm dilimler toplandığında, her dilimi her kuyuda üç mililitre PBS içeren altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına dikkatlice aktarın. Dilimi nazik bir şekilde sallayarak durulayın ve numuneleri kuyu başına 37 derece santigrat kültür ortamına ait üç mililitre içeren altı kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına aktarmadan önce bu işlemi taze steril PBS ile üç kez tekrarlayın.Sonra 37 derece, % 30 oksijen ve% 5 karbondioksit bir nemlendirilmiş kuluçka dakikada 20 devrimleri bir yörünge shaker üzerine plaka yerleştirin. Taze kesilmiş dilimler için geri kazanım çözümünde 20 dakika sonra veya hemen ardından, dikkatle perfüzyon sistemi doku banyosu ilgi dilimi transfer ve dokuya minimal streç uygularken jel tabakasına dört köşe aşağı pin. Geri kazanım çözeltisinin rezervuarına 0,3 ila 0,5 mikrolitre stok Blebbistatin eklemeden önce yaklaşık 10 dakika boyunca sirkülasyon çözeltisi ile dilimlerin bu banyoda dinlenmesine izin verin.Dilim Blebbistatin'de kuluçkaya yatarken, 37 derecede bir mililitre geri kazanım çözeltisinde stok gerilimine duyarlı boyanın 30 mikrolitresini yeniden oluşturur. Blebbistatin tedavisi 10 dakika sonra, pompaları kapatın ve yavaş yavaş 30 saniye lik bir süre içinde dilimin yüzeyine çalışan boya çözeltisi 0,2 ila 0,3 mililitre yükleyin. 90 saniye sonra, herhangi bir fazla boya yıkayın için pompaları açın.Stok kalsiyum göstergesi ile dilim öldükten sonra, dilim üzerine kameralar odaklanmak ve önceden belirlenmiş pacing eşik genlik 1,5 kat iki milisaniye darbe genişliği süresi ile bir hertz de dilim hızı. Doku diliminin üzerine bir kapak kaydırın ve LED uyarma ışık kaynağı ile dilimi aydınlatın. Daha sonra yayılan voltaj ve kalsiyum sinyallerini kameralarla saniyede 1.000 kare olarak kaydedin.Gerilim ve kalsiyum optik haritalama verilerini koşullandırmak için, uygun analiz yazılımında, koşul parametrelerini tıklatın ve arka planı kaldırın. Daha sonra optimum etki potansiyeli ve kalsiyum geçici izleri elde etmek için sinyal klima parametrelerini ayarlayın. İletim hızını hesaplamak için etkinleştirme haritasını seçin ve izlemede tek bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde bir başlangıç ve bitiş saati girin.Ardından bölgesel haritayı tıklatın ve seçilen bölgenin etkinleştirme haritasını görüntülemek için ilgi çekici bölgeyi seçin. Ardından, iletim hızı haritasını seçin ve başlangıç ve bitiş saatlerini seçin. Gerektiğinde kuruluma göre pikseller arası çözünürlük değerlerini ayarlayın.İlgi çekici bir bölge seçmek ve o bölgedeki iletim hızı vektörlerini görüntülemek için vektör haritasını oluştur'u tıklatın. Analizde yer alan ortalama, ortanca, standart sapma ve vektör sayısı ile seçilen bölgedeki iletim hızı vektörlerinin ortalama yayılma açısı görüntülenir. Eylem potansiyelini hesaplamak için, eylem potansiyeli süresini, kalsiyum geçici süre haritasını seçin ve tam bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde başlangıç ve bitiş saatlerini seçin.Ardından, ilgi alanı seçmek ve eylem potansiyeli süresi eşlemi oluşturmak için bölgesel eylem potansiyel süresi hesaplamasını tıklatın. Yükselme süresini belirlemek için, yükseliş süresini seçin ve tek bir eylem potansiyelinin veya kalsiyum geçicisinin yukarı vuruşunu seçmek için başlangıç ve bitiş saatlerini seçin. Başlangıç ve bitiş yüzdesi değerlerini girin ve ilgi bölgesini seçmek ve artış zamanının analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için hesapla'yı tıklatın.Kalsiyum bozunmasını belirlemek için kalsiyum bozunumu seçin ve tek bir kalsiyum geçici sinyalin tüm çürüme kısmını kapsayacak şekilde başlangıç ve bitiş saatlerini girin. Daha sonra ilgi bölgesini seçmek ve kalsiyum bozunma süresi sabitinin analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için tau'yu hesapla'yı tıklatın. Bu temsili deneyde, eylem potansiyeli ve kalsiyum geçici izleri sinyal şartlı edildi.Aktivasyon süreleri her piksel için belirlendi ve aktivasyon sürelerinin isokronal haritaları koşullu voltaj ve kalsiyum izlerinden çizildi. İletim hızı vektörleri aktivasyon süreleri ve bilinen pikseller arası çözünürlük kullanılarak hesaplanmıştır. Kalsiyum geçici bozunma sabiti, kalsiyum izlerinin çürüyen kısmına bir polinom takılarak ölçüldü.Etki potansiyel süresi ve kalsiyum geçici süresi aktivasyon süresi ile sitoplazmadan yeniden polarizasyon veya kalsiyum uzaklaştırılmasının belirli bir yüzdesi arasındaki süre olarak ölçüldü. Voltaj ve kalsiyum izlerinin yükselme süreleri de ölçüldü ve haritalandı. Bu temsili analizde, doksorubisin kardiyak iletim üzerindeki etkisi enine iletim hızının azalması ile sonuçlanmıştır.Dilimleme işlemi sırasında dokuya verilen zararı en aza indirmek ve uygun dilimler elde etmek için dilimlerin tam kardiyoplejik arrest içinde olduğundan emin olmak önemlidir. Protokolün sonunda, dilimler dondurulabilir veya moleküler değerlendirme için sabitlenebilir. İlgi elektrofizyolojik fenomeninde yer alan mekanistik yollar daha sonra belirlenebilir.Bu insan kardiyak dilim modelinin geliştirilmesi hayvan ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu köprü insan kalp dokusunda tedavi ve hastalığa yanıtların çalışma izin verdi. Bu tekniği yaparken insan dokuları ile çalışırken, uygun PPE giymek ve diğer gerekli güvenlik önlemleri almak için emin olun.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

İnsan Serumda kardiyak biyolojik ölçmek için olağanüstü optik iletim kullanma

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Canlı, insan direnç arterler tarafından etiket içermeyen Floresans mikroskobu kolajen ve Elastin basınç bağımlı Microarchitectures değerlendirilmesi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...