Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة المؤسسة الوطنية للعلوم DMS-1463234، والمنح الوطنية للصحة HL082808 وAI133634، والتمويل الداخلي لجامعة ليهاي.

1. إعداد VWF
<ol><li>إعادة تشكيل البلازما البشرية VWF لإعداده لردود الفعل وضع العلامات. أضف 100 ميكرولتر من الماء المغليون (DI) إلى 100 ميكروغرام من VWF المنفّه لإنشاء محلول مخزون VWF 1 ملغم/مل.</li>
	<li>Dialyze VWF حل الأسهم من أجل إزالة الجليسين الزائد، وبالتالي زيادة كفاءة وضع العلامات البيوتين والفلوروفور.<ol>...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

للحصول على بيانات عالية الجودة من التغيرات التشكيلية جزيء واحد باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح في هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان لاحتضان جزيء لمقدار الوقت المناسب، والحد من تفاعلاتها غير محددة مع السطح وإنشاء إعدادات المجهر التي تقلل من التبييض الضوئي. ترتبط قدرة الجزيء على تغيير ال...

وقد درست على نطاق واسع آليات كيفية استجابة الجزيئات الحيوية للمحفزات البيئية. في بيئة التدفق على وجه الخصوص ، تنظم قوى القص والطول المدى التغيرات التشكيلية وربما وظيفة الجزيئات الحيوية. ومن الأمثلة النموذجية على ذلك كشف الحمض النووي لامدا وفون ويلبراند (VWF) الناجم عن القص. وقد استخدمت الحمض النووي لامبدا كأداة لفهم ديناميات تشكيلية من سلاسل البوليمر الفردية ومرنة وrheology من حلول البوليمر1،2،3،4. VWF هو مستشعر التدفق الطبيعي الذي يجمع الصفائح الدموية في مواقع الجروح في الأوعية الدموية مع معدلات القص غير الطبيعية وأنماط التدفق. كشف VWF أمر ضروري في تفعيل ربط الصفائح الدموية إلى المجال A1 والكولاجين ملزمة للمجال A3. وبالإضافة إلى ذلك، عالية القص الناجمة عن المجال A2 تتكشف يسمح انشقاق VWF، الذي ينظم توزيع الوزن الجزيئي في الدورة الدموية5،6. وبالتالي ، فإن التصور المباشر لكيفية عمل هذه الجزيئات تحت التدفق يمكن أن يعزز إلى حد كبير فهمنا الأساسي للميكانيكا الحيوية ووظيفتها ، والتي بدورها يمكن أن تمكن التطبيقات التشخيصية والعلاجية الجديدة.
وتشمل المنهجيات النموذجية لتوصيف التشكيلات أحادية الجزيء ملاقط بصرية/مغناطيسية، والمجهر المجهري للقوة الذرية (AFM) ونقل الطاقة بالرنين الرنين أحادي الجزيء Förster (FRET)7. التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد هو أداة قوية للتحقيق في القوة والحركة المرتبطة بالتغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية. ومع ذلك ، فإنه يفتقر إلى القدرة على رسم خريطة التشكيلات الجزيئية الشاملة8. AFM قادرة على التصوير بدقة مكانية عالية ولكنها محدودة في القرار الزمني9،10. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الاتصال بين الطرف والعينة إلى إرباك الاستجابة الناجمة عن التدفق. طرق أخرى مثل FRET وتحليلات nanopore تحديد البروتين جزيء واحد للطي وتتكشف الدول على أساس الكشف عن المسافة داخل الجزيئية والأحجام المستثناة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لا تزال في مهدها ومحدودة في ملاحظتها المباشرة لتكوينات جزيء واحد11،12،13،14.
من ناحية أخرى ، فإن المراقبة المباشرة للجزيئات ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية تحت المجهر الفلوري قد حسنت فهمنا لديناميكيات الجزيء الواحد في العديد من العمليات البيولوجية15،16. على سبيل المثال، حققت فو وآخرون مؤخرا تصور المدة المتزامنة لـ VWF والربط مستقبلات الصفائح الدموية للمرة الأولى. في عملهم ، تم شل جزيئات VWF على سطح قناة ميكروفلويديك من خلال تفاعلات البيوتين - ستريبتفيفيفيالدين وتصويرها تحت الانعكاس الداخلي الكلي للفلورسينس (TIRF) المجهري في بيئات تدفق القص المختلفة17. تطبيق طريقة مماثلة كما فو، ونحن هنا تثبت أن التشكيلات من VWF والحمض النووي لامدا يمكن ملاحظتها مباشرة تحت كل من TIRF والمجهر الفلوري المعتري. كما هو موضح في الشكل 1، يتم استخدام الأجهزة الدقيقة لإنشاء والتحكم في تدفق القص ، ويتم شل الجزيئات الحيوية على سطح القناة. عند تطبيق معدلات القص المختلفة ، يتم تسجيل التشكيلات من نفس الجزيء لقياس الطول الإرشادي ، كما هو موضح في الشكل 1. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لاستكشاف سلوكيات البوليمر الأخرى في ظل بيئات التدفق المعقدة لكل من الدراسات الريولوجية والبيولوجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

وقد تميزت سلوك جزيء واحد تحت اضطراب الميكانيكية على نطاق واسع لفهم العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك ، فإن أساليب مثل المجهر للقوة الذرية لها دقة زمنية محدودة ، في حين أن نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) يسمح فقط بالاستدلال على التشوهات. من ناحية أخرى ، يسمح المجهر المجهري الفلوري في الوقت الحقيقي في التصور الموقعي لجزيئات واحدة في ظروف التدفق المختلفة. يصف بروتوكولنا خطوات التقاط التغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية المفردة تحت بيئات تدفق القص المختلفة باستخدام المجهر الفلوري. يتم إنشاء تدفق القص داخل قنوات microfluidic ويسيطر عليها مضخة حقنة. كعروض للطريقة ، يتم تسمية عامل فون ويلبراند (VWF) والحمض النووي لامدا مع البيوتين والفلوروفور ثم يتم شل حركتها على سطح القناة. يتم رصد التشكيلات باستمرار تحت تدفق القص المتغير باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) والمجهر المجهري الفلوري المعتري. ديناميات تفكك عكسها من VWF مفيدة لفهم كيفية تنظيم وظيفتها في الدم البشري، في حين أن تشكيل الحمض النووي لامدا يقدم رؤى في الفيزياء الحيوية للجزيئات الكبيرة. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدراسة سلوك البوليمرات، وخاصة البوليمرات الحيوية، في ظروف التدفق المختلفة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة.

مراقبة السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية مثل VWF والحمض النووي لامدا يعتمد بشكل كبير على تحسين ربطها بسطح الجهاز. احتضان العلاجات السطحية للأوقات الموصى بها في الجهاز microfluidic أمر بالغ الأهمية للحصول على ملزمة مع عدد قليل من نقاط الرسو، بحيث يمكن للجزيئات توسيع بحرية والاسترخاء عند تغيير ?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

نقدم بروتوكولًا لشل الجزيئات الكبيرة المفردة في الأجهزة الميكروفلويدية وتحديد التغيرات في التشكيلات تحت تدفق القص. هذا البروتوكول مفيد لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية والوظيفية للجزيئات الحيوية مثل البروتينات والحمض النووي في بيئة التدفق.

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

إن قياس التغيرات التكتكية في الجزيئات الحيوية المفردة في إطار تدفق القص مفيد لفهم وظيفة الجزيئات الضمورية مثل البروتين والحمض النووي. يسمح المجهر الفلوري في الوقت الحقيقي في الموقع التصور من جزيئات واحدة في بيئات التدفق الفسيولوجية مع ارتفاع الدقة الزمانية والمكانية. هذا لا مثيل له من قبل تقنيات أخرى مثل AFM.من خلال توصيف قوة القص التي تحت البروتينات لدينا الحمض النووي لدينا تغييرات التشكل العالمي، يمكن للمرء أن تصميم أفضل الأدوية التي تحاكي هذه الخصائص الفيزيائية الحيوية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لدراسة السلوك أو البوليمرات الأخرى ، وخاصة البوليمرات الحيوية ، في ظروف تدفق متفاوتة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة. توقيت الخطوات أمر بالغ الأهمية للنجاح.نقترح ممارسة المعالجة السطحية للجهاز microfluidic والخطوات المجهرية الفلوريسين عدة مرات لتنفيذها بطريقة فعالة. التقاط التغيرات التشكلية في الجزيئات الحيوية هي ظاهرة بصرية وديناميكية أفضل مشاهدة على الفيلم. سيتفهم العلماء هذه الطريقة بشكل أفضل بعد رؤية البروتين في الوقت الحقيقي والمجهر الحمض النووي المعروض في هذا الفيديو.لإعداد الجهاز microfluidic، إضافة خمسة أجزاء من قاعدة مِلَمَر السيليكون إلى أحد عوامل علاج جزء في قارب وزن. ويحرك المحتويات بدقة لمدة دقيقة واحدة لإنشاء حل PDMS الشفاء المسبق. ضع رقاقة السيليكون الرئيسية في طبق بيتري بلاستيكي وصب محلول PDMS على الرقاقة لإنشاء طبقة من خمسة ملليمترات.تغطية الطبق وتركها في مجفف تحت فراغ لمدة ساعة واحدة لإزالة فقاعات الهواء. ثم احتضان طبق بيتري المغطى في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج PDMS في صلبة مرنة ، مما سيؤدي إلى قنوات microfluidic يتم مصبوب في PDMS في واجهة رقاقة PDMS. في اليوم التالي، استخدم شفرة حلاقة لقطع مستطيلات 20 في 10 ملليمترات حول كل قناة microfluidic في PDMS وإزالة الكتل المستطيلة مع ملاقط.استخدم إبرة نهاية حادة قياس 25 قياساً مع حواف حادة لكمة ثقب قطره 0.5 ملليمتر في أحد طرفي القناة، مع التأكد من أن الثقب يمر تمامًا عبر كتلة PDMS. استخدام إبرة رقيقة لكمة PDMS للخروج من الحفرة وتكرار العملية في الطرف الآخر من القناة. ضع كتلة PDMS مع جانب القناة إلى الأعلى وأغطية في غرفة آلة الربط البلازما وبدء العلاج.عند اكتمال العلاج، ضع بسرعة كتلة PDMS على غطاء بحيث تكون القناة على اتصال بالزلة. تطبيق الضغط على حواف الكتلة، ثم ضع الجمعية PDMS coverslip على لوحة ساخنة في 115 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعزيز السندات الدائمة. وأخيراً، أدخل 10 سنتيمتر.0.25 ملليمتر أنبوب القطر الداخلي في فتحة منفذ في الجزء العلوي من كتلة PDMS للسماح للسوائل بسهولة التدفق من القناة. بالنسبة لعامل فون ويليبراند أو تجارب VWF تحقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر BSA-Biotin مذابة في PBS 1X معقمة في مدخل الجهاز microfluidic. حجب بعض microliters من BSA-Biotin في طرف ماصة بعد الحقن والسماح للتلميح أن تبقى جزءا لا يتجزأ من مدخل.السماح لBSA-Biotin لاحتضان في الجهاز لمدة ساعتين مما سيؤدي إلى BSA غير ملزمة خصيصا لسطح غطاء. ثم إزالة طرف ماصة وحقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من محلول منع الكازين في القناة. السماح للحل الكيس لاحتضان لمدة 30 دقيقة حتى تتمكن من منع أي مواقع مجانية والحد من الربط غير محدد من الجزيئات الحيوية إلى السطح.إزالة طرف وحقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من streptavidin في برنامج تلفزيوني عقيمة في القناة، والتي سوف ربط لمجموعات البيوتين من BSA-البيوتين. المقبل، حقن ما يصل إلى 10 ميكرولترات من محلول المنظفات لغسل streptavidin الزائدة. إزالة طرف وحقن إما VWF في محلول النازيلين أو لحمض نووي لامدا.احتضان VWF لمدة ثلاث دقائق أو الحمض النووي لامدا لمدة 45 دقيقة. ثم حقن خمسة بيوتين ميليمولار الحرة لمنع مواقع الربط Streptavidin الزائدة. تحميل ملليلتر واحد من محلول حجب الـ الـ"كايسين" في حقنة و تأمينه في مضخة حقنة.ثم نعلق على نهاية واحدة من أنابيب لإبرة حقنة وتدفق في حل لإزالة فقاعات الهواء. ما يقرب من ثلاث دقائق بعد حقن البيوتين الحرة نعلق الطرف الآخر من الأنبوب إلى مدخل الجهاز microfluidic. حدد أعلى هدف للتكبير من TIRF أو المجهر الفلوري confocal.إذا لزم الأمر، إضافة قطرة من زيت الغمر على الهدف. ضع الجهاز microfluidic على مرحلة المجهر بحيث يكون غطاء مع الهدف. ابدأ المجهر في المجال الساطع وضبط التركيز بحيث تظهر ميزات مثل الحطام والفقاعات.ثم ضبط المرحلة في الاتجاهات س و ص حتى حافة قناة microfluidic مرئية وتجزئات الإطار. قم بالتبديل إلى قناة FITC وضبط مستوى Z وزاوية TIRF حسب الحاجة حتى يمكن تمييز الجزيئات الخضراء الفردية. ضبط كثافة الليزر ووقت التعرض لتصور جزيئات الفلورسنت دون photobleaching لهم بسرعة كبيرة جدا.ثم ضبط التباين لتصور أفضل للجزيئات. بالضبط بعد خمس دقائق من حقن البيوتين الحرة بدء ووقف التدفق من مضخة حقنة لمراقبة التغيرات في التشكل الجزيئي باستخدام معدلات تدفق بين 5000 و 30، 000 ميكرولتررس في الساعة. مع VWF من المهم تطبيق كمية صغيرة على الأقل من التدفق ، مثل 30 ثانية من 10 ، 000 ميكرولتر في الساعة تدفق خمس دقائق بالضبط بعد حقن البيوتين الحرة.كرر هذا في جميع أنحاء مناطق مختلفة من الجهاز microfluidic وتحديد الجزيئات التي يمكن أن تمتد والاسترخاء على دورات متعددة من بدء ووقف التدفق. لاحظ كم من الوقت يستغرق للجزيئات للوصول إلى أقصى امتداد والاسترخاء الكامل وتسجيل أشرطة الفيديو من السلوك المستمر للجزيئات تحت تدفق القص. وغالبا ما تظهر مرونة الجزيء لتغيير تأكيد من خلال قدرته على إطالة كما يتم تطبيق معدلات القص أعلى بسبب زيادة تدفق.التمديد مقابل منحنى معدل القص لجزيء عامل وليمبرراند فون مفيد لتميز الخصائص الميكانيكية الحيوية للبروتين. تظهر صور المجهر الفلوري للحمض النووي لامدا بالمثل زيادة التمديد عند ارتفاع معدلات القص في 30 ثانية والاسترخاء التدريجي على مدى دقيقتين بعد توقف التدفق. عند العمل مع VWF، تذكر أن تحتضنه لمدة ثلاث دقائق فقط و biotin مجانا لمدة خمس دقائق قبل بدء التدفق.وهذا أمر بالغ الأهمية لتشكيل العدد الأمثل أو الروابط البيولوجية - streptavidin اللازمة للتفكك يمكن عكسها. يمكن تكييف هذه الطريقة لتصور التفاعلات في الوقت الحقيقي بين الجزيئات الحيوية المتعددة وتوصيف وظائفها. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن يفهم بشكل أفضل تشكيل المكونات الصفائح الدموية عن طريق تصور كشف VWF تحت القص عالية وربطها مع جزيء الصفائح الدموية التصاق GPIb-ألفا مع هذه الطريقة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...