Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
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这项工作部分得到了国家科学基金会赠款DMS-1463234、国家卫生研究院赠款HL082808和AI133634以及利哈伊大学内部资助的支持。

1. 准备 VWF
<ol><li>重组人类血浆VWF，为标记反应做好准备。将 100 μ0 μL 的去离子 （DI） 水加入 100 μg 的冻干 VWF，以创建 1 mg/mL VWF 库存溶液。</li>
	<li>透析VWF库存溶液，以去除多余的甘氨酸，从而提高生物锡和荧光剂标签效率。<ol>
<li>将 50 μL 的 VWF 库存溶液转移到 0.1 mL 透析单元中，该透析单元具有 10，000 个分子量的截止和带盖的密封。将剩余库存溶液储存在-20°C。VWF 库存将在 -20 °C 下稳定长?...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

为了使用该方法中所述的荧光显微镜获得单分子构象变化的高质量数据，在适当的时间内孵育分子，尽量减少其与表面的非特异性相互作用至关重要并建立显微镜设置，以减少光漂白。分子自由改变构象的能力与分子与表面之间形成的生物链球菌相互作用的数量有关。如前所述，这必须通过在适当的时间内孵育无流量的分子来控制。此外，如果盖玻片没有有效堵塞，蛋白质或DNA可能非特有结合到?...

生物分子对环境刺激的反应机制得到了广泛的研究。特别是在流动环境中，剪切力和伸长力调节构象变化，并可能调节生物分子的功能。典型的例子包括剪切引起的羊羔DNA和冯·威勒布兰德因子（VWF）的分解。Lambda DNA已被用作一种工具，了解个体、柔性聚合物链的构象动力学和聚合物溶液1、2、3、4的流变学。VWF 是一种自然流动传感器，可聚合血管伤口部位的血小板，剪切速率和流动模式异常。VWF 的分解对于激活血小板与 A1 域的结合和胶原蛋白与 A3 域结合至关重要。此外，高剪切诱导A2域展开允许VWF的裂解，调节其分子量分布在循环5，6。因此，直接可视化这些分子在流动下如何运行，可以大大增强我们对它们的生物力学和功能的基本理解，进而支持新的诊断和治疗应用。
描述单分子一致性的典型方法包括光学/磁性钳子、原子力显微镜（AFM）和单分子Fürster共振能量转移（FRET）7。单分子力谱谱是研究与生物分子的构象变化相关的力和运动的有力工具。然而，它缺乏绘制整体分子一致性8的能力。AFM能够成像高空间分辨率，但时间分辨率9，10是有限的。此外，尖端和样品之间的接触可能会混淆由流量引起的响应。其他方法，如FRET和纳米孔分析，根据分子内距离和排除体积的检测，确定单分子蛋白折叠和展开状态。然而，这些方法还处于起步阶段，在直接观察单分子一致性11、12、13、14方面还很有限。
另一方面，在荧光显微镜下直接观察具有高时空分辨率的大分子，提高了我们对许多生物过程中单分子动力学的理解15，16。例如，Fu等人最近首次实现了VWF伸长和血小板受体结合的同步可视化。在其工作中，VWF分子通过生物素-链球素相互作用固定在微流体通道表面，并在不同剪切流环境中在总内部反射荧光（TIRF）显微镜下成像17。应用与Fu类似的方法，我们在这里证明，VWF和lambdaDNA的一致性可以在TIRF和共聚焦荧光显微镜下直接观察到。如图1所示，微流体装置用于创建和控制剪切流，生物分子固定在通道表面。应用不同的剪切速率后，记录同一分子的一致性以测量延伸长度，如图1所示。该方法可广泛应用于复杂流动环境下研究其他聚合物行为，用于流变学和生物学研究。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

机械扰动下的单分子行为被广泛描述为了解许多生物过程。然而，原子力显微镜等方法的时间分辨率有限，而Fürster共振能量转移（FRET）仅允许推断一致性。另一方面，荧光显微镜允许在各种流动条件下对单个分子进行实时原位可视化。我们的协议描述了使用荧光显微镜捕获不同剪切流环境中单生物分子的构象变化的步骤。剪切流在微流体通道内产生，由注射器泵控制。作为该方法的演示，冯·威尔布兰德因子（VWF）和lambda DNA被标记为生物素和荧光素，然后固定在通道表面。使用总内部反射 （TIRF） 和共聚焦荧光显微镜在可变剪切流下持续监测其一致性。VWF的可逆分解动力学有助于理解其功能在人类血液中的调节，而 lambda DNA 的构象提供了对大分子生物物理学的见解。该方案还可用于研究聚合物，特别是生物聚合物在不同流动条件下的行为，以及研究复杂流体的流变学。

观察生物分子（如 VWF 和 lambda DNA）的动态行为高度依赖于优化其与设备表面的结合。在微流体装置中进行推荐时间的表面处理对于获得几个锚固点的结合至关重要，以便分子在变化流量时可以自由延伸和放松。如果蛋白质或DNA与多重联系结合过强，它们要么延伸至有限长度，要么根本不延伸。在免费生物锡阻断之前，VWF 在设备表面保持无流量超过 3 分钟时，尤其会出现这种情况。VWF在表面停滞?...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

我们提出了一种在微流体器件中固定单个大分子和量化其在剪切流下其一致性变化的协议。该协议可用于描述流动环境中蛋白质和DNA等生物分子的生物力学和功能特性。

使用荧光显微镜在剪切流下描述单分子构象变化

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

量化剪切流下单个生物分子的构象变化有助于了解蛋白质和DNA等大分子的功能和生物物理。荧光显微镜允许对生理流动环境中的单分子进行实时原位可视化，具有高时空分辨率。这是其他技术（如 AFM）所无法比拟的。通过描述蛋白质的DNA具有全球构象变化的剪切力，可以更好地设计模仿这些生物物理特性的药物。该协议可广泛应用于不同流动条件下的行为或其他聚合物，特别是生物聚合物，并研究复杂流体的流变学。步骤的时机对成功至关重要。我们建议多次练习微流体装置表面处理和荧光显微镜步骤，以高效的方式执行它们。捕捉生物分子的构象变化是一种视觉和动态现象，最好在电影中观看。在看到视频中显示的实时蛋白质和DNA显微镜后，科学家们将更好地了解这种方法。要准备微流体装置，在称重船上的一个零件固化剂中加入五部分硅胶弹性体基座。彻底搅拌内容物一分钟，以创建预固化的 PDMS 解决方案。将主硅晶圆放在塑料培养皿中，将 PDMS 溶液倒在晶圆上，形成五毫米层。盖上盘子，在真空下放在干燥器中一小时，以清除气泡。然后在60摄氏度下孵育覆盖的培养皿，将PDMS固化成柔性固体，从而在PDMS晶圆接口上将微流体通道模入PDMS中。第二天，使用剃须刀在 PDMS 的每个微流体通道周围切割 20 到 10 毫米矩形，然后用钳子移除矩形块。使用具有锐化边缘的 25 规格钝端针在通道的一端打一个直径为 0.5 毫米的孔，确保孔完全穿过 PDMS 块。使用细针将 PDMS 从孔中冲出，并在通道的另一端重复此过程。将 PDMS 块与通道侧向上，盖玻片放入等离子粘合机的腔室，然后开始处理。治疗完成后，快速将 PDMS 块放在盖玻片上，使通道与滑点接触。向块的边缘施加压力，然后在 115 摄氏度的热板上放置盖玻片 PDMS 组件 15 分钟，以加固永久粘结。最后，插入一个10厘米长。0.25 毫米内径管进入 PDMS 块顶部的出孔，使液体轻松流出通道。对于冯·威勒布兰德因子或 VWF 实验，将每毫升 10 微克的 10 微升 BSA-Biotin 注入无菌 1X PBS 中，注入微流体装置的入口。注射后在移液器尖端中保留一些 BSA-Biotin 微升，并允许尖端保持嵌入进气口中。允许 BSA-Biotin 在设备中孵育两个小时，这将导致 BSA 不专门绑定到盖玻片表面。然后拆下移液器尖端，将多达 10 微升的卡明阻尼溶液注入通道。让表皮溶液孵育30分钟，这样它就可以阻断任何自由点，减少生物分子与表面的非特异性结合。取下尖端，在无菌PBS中注入多达10微升的链球菌素，该通道将结合到BSA-Biotin的生物素组。接下来，注射多达10微升的洗涤剂溶液，洗去多余的链球菌素。取出尖端，注射VF在卡芬溶液或羔羊DNA。孵育VF三分钟或羊皮DNA45分钟。然后注射五毫摩尔自由生物素，以阻止多余的链球菌素结合位点。将一毫升卡明阻断溶液装入注射器中，并固定在注射器泵中。然后将管的一端连接到注射器针上，然后流动在溶液中去除气泡。大约三分钟后，自由生物素注射将管的另一端连接到微流体装置的入口。选择 TIRF 或共分荧光显微镜的最高放大率目标。如果需要，在目标上添加一滴浸入油。将微流体装置放在显微镜舞台上，使盖玻片与目标齐平。启动亮场显微镜并调整焦点，以便可以看到碎屑和气泡等特征。然后调整 X 和 Y 方向的阶段，直到微流体通道的边缘可见并分帧。切换到 FITC 通道并根据需要调整 Z 电平和 TIRF 角度，直到可以区分单个绿色球状分子。调整激光强度和曝光时间，以可视化荧光分子，而不会过快地光漂白它们。然后调整对比度，以更好地可视化分子。自由生物素注射开始并停止从注射器泵流出整整五分钟后，使用每小时 5000 至 30，000 微升的流速观察分子构象的变化。使用 VWF 时，应用至少少量流量至关重要，例如在自由生物素注射后 5 分钟，每小时流量为 30 秒 10，000 微升。在微流体装置的各个区域重复这一操作，并定位分子，这些分子可以在启动和停止流的多个循环中扩展和放松。注意分子达到最大延伸和完全放松需要多长时间，并记录分子在剪切流下连续行为的视频。分子改变确认的灵活性通常表现为由于流量增加而应用更高的剪切速率，其加长能力。冯·威利布兰德因子分子的延伸率曲线与剪切率曲线对于蛋白质的生物力学特性的特征性非常有用。lambda DNA 的荧光显微镜图像同样显示，在 30 秒内较高的剪切率增加，在流停止后两分钟内逐渐放松。使用 VWF 时，请记住在开始流动前仅孵育三分钟和自由生物素五分钟。这对于形成可逆分解所需的最佳数量或生物素链至关重要。该方法可以适应可视化多个生物分子之间的实时相互作用，并描述其功能。例如，通过可视化VF在高剪切下解开及其与血小板粘附分子GPIb-alpha的结合，可以更好地了解血小板塞的形成。

Research

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Bioengineering

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