Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af en National Science Foundation-legat DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 og AI133634 og Lehigh Universitys interne finansiering.

1. Forberedelse af VWF
<ol><li>Rekonstituere humanplasma VWF at forberede det til mærkning reaktioner. Der tilsættes 100 μL deioniseret (DI) vand til 100 μg lyophilized VWF for at skabe en 1 mg/ml VWF-aktieopløsning.</li>
	<li>Dialyze VWF lageropløsning for at fjerne overskydende glycin, og dermed øge biotin og fluorophore mærkning effektivitet.<ol>
<li>Overfør 50 μL VWF-lageropløsning til en 0,1 ml dialyseenhed med en 10.000 molekylvægtsafskæring og forsegling med hætte. Den resterende lageropløsning op...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

For at opnå data af et enkelt molekylerekonformationsændringer ved hjælp af fluorescensmikroskopi som beskrevet i denne metode er det afgørende at inkubere molekylet i den rette tid, minimere dets uspecifikke interaktioner med overfladen og etablere mikroskopindstillinger, der reducerer fotoblegning. Molekylets evne til frit at ændre kropsbygning er relateret til antallet af biotin-streptavidin interaktioner dannet mellem molekylet og overfladen. Som tidligere nævnt skal dette kontrolleres ved at inkubere molekylet...

Mekanismer for, hvordan biomolekyler reagerer på miljømæssige stimuli er blevet undersøgt bredt. Især i et flowmiljø regulerer forskydnings- og langstrømskræfter konformationsændringerne og potentielt biomolekylernes funktion. Typiske eksempler omfatter forskydning-induceret optrævling af lambda DNA og von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA er blevet brugt som et redskab til at forstå kropsdynamik af individuelle, fleksible polymer kæder og reheologi af polymeropløsninger1,2,3,4. VWF er en naturlig flowsensor, der samler blodplader på sårsteder i blodkarrene med unormale forskydningshastigheder og flowmønstre. Optrævling af VWF er afgørende for aktivering af bindingen af blodplader til A1-domænet og kollagenbinding til A3-domænet. Desuden giver høj forskydnings-induceret A2 domæne udfolder sig kavalergang af VWF, som regulerer sin molekylvægt fordeling i omløb5,6. Således direkte visualisering af, hvordan disse molekyler opfører sig under flow kan i høj grad forbedre vores grundlæggende forståelse af deres biomekanik og funktion, som igen kan muliggøre nye diagnostiske og terapeutiske applikationer.
Typiske metoder til at karakterisere single-molekyle konformationer omfatter optiske / magnetiske pincet, atomkraft mikroskopi (AFM) og single-molekyle Förster resonans energioverførsel (FRET)7. Single-molekyle kraft spektroskopi er et kraftfuldt værktøj til at undersøge den kraft og bevægelse forbundet med konformationændringer af biomolekyler. Men det mangler evnen til at kortlægge samlede molekylære konforringer8. AFM er i stand til billeddannelse med høj rumlig opløsning, men er begrænset i tidsmæssig opløsning9,10. Desuden kan kontakt mellem spidsen og prøven forvirre svaret forårsaget af flow. Andre metoder som FRET og nanopore analyse bestemme enkelt-molekyle protein foldning og udfoldelse stater baseret på påvisning af intramolekylær afstand og udelukkede mængder. Disse metoder er dog stadig i deres vorden og begrænset i deres direkte observation af konforringer med et enkelt molekyle11,12,13,14.
På den anden side har direkte observation af makromolekyler med høj tidsmæssig og rumlig opløsning under fluorescensmikroskopi forbedret vores forståelse af enmolekyledynamik i mange biologiske processer15,16. For eksempel, Fu et al. nylig opnået samtidig visualisering af VWF forlængelse og blodplade receptor bindende for første gang. I deres arbejde blev VWF molekyler immobiliseret på overfladen af en mikrofluidic kanal gennem biotin-streptavidin interaktioner og afbildet under total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi ved varierende forskydning flow miljøer17. Ved hjælp af en lignende metode som Fu's, vi her viser, at konformationer af VWF og lambda DNA kan observeres direkte under både TIRF og konfokale fluorescens mikroskopi. Som vist i figur 1anvendes mikrofluidiske anordninger til at skabe og kontrollere forskydningsflow, og biomolekyler immobiliseres på kanalens overflade. Ved anvendelse af forskellige forskydningshastigheder registreres konformationer af samme molekyle for at måle forlængelseslængden, også vist i figur 1. Metoden kunne anvendes bredt til at udforske andre polymer adfærd under komplekse flow miljøer for både reologiske og biologiske undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Single-molekyle adfærd under mekanisk forstyrrelser er blevet karakteriseret bredt til at forstå mange biologiske processer. Metoder som atomkraftmikroskopi har imidlertid begrænset tidsmæssig opløsning, mens Förster resonansenergioverførsel (FRET) kun tillader, at konformationer udledes. Fluorescens mikroskopi, på den anden side, giver real-time in situ visualisering af enkelte molekyler i forskellige flow betingelser. Vores protokol beskriver trinene til at fange kropsbygningsændringer af enkelte biomolekyler under forskellige forskydningsflowmiljøer ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Forskydningsstrømmen skabes inde i mikrofluidiske kanaler og styres af en sprøjtepumpe. Som demonstrationer af metoden, von Willebrand faktor (VWF) og lambda DNA er mærket med biotin og fluorophore og derefter immobiliseret på kanalens overflade. Deres konformationer overvåges løbende under variabel forskydningsstrøm ved hjælp af total intern refleksion (TIRF) og mikroskopi af konfokal fluorescens. VWF's reversible optrævlingsdynamik er nyttige til at forstå, hvordan dens funktion reguleres i menneskeblod, mens kropsdannelsen af lambda DNA giver indsigt i makromolekylers biofysik. Protokollen kan også anvendes bredt til at studere adfærd polymerer, især biopolymerer, i varierende flow betingelser og til at undersøge reheologi af komplekse væsker.

Observation af den dynamiske adfærd biomolekyler såsom VWF og lambda DNA er meget afhængig af at optimere deres binding til enhedens overflade. Inkubering overfladebehandlinger til de anbefalede tidspunkter i den mikrofluidiske enhed er afgørende for at opnå binding med et par forankringspunkter, således at molekyler frit kan udvide og slappe af ved skiftende flow. Hvis proteiner eller DNA er bundet for stærkt med flere forbindelser, vil de enten udvides til begrænsede længder eller slet ikke udvide. Dette sker ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Vi præsenterer en protokol for immobilisering af enkelte makromolekyler i mikrofluidiske enheder og kvantificereændringer i deres konformationer under forskydningsflow. Denne protokol er nyttig til at karakterisere biomekaniske og funktionelle egenskaber af biomolekyler såsom proteiner og DNA i et flowmiljø.

Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Kvantificering af konformationelle ændringer i enkelte biomolekyler under forskydningsflow er nyttig til at forstå makromolekylers funktion og biofysik som protein og DNA. Fluorescensmikroskopi giver real-time in-situ visualisering af enkelte molekyler i fysiologiske flow miljøer med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette er uovertruffen af andre teknikker som AFM.Ved at karakterisere den forskydning kraft, hvorunder proteiner vores DNA har globale konformationelle ændringer, kan man bedre designe lægemidler, der efterligner disse biofysiske egenskaber. Denne protokol kan anvendes i vid udstrækning til at studere adfærd eller andre polymerer, især bio polymerer, i varierende flow betingelser og til at undersøge reologi af komplekse væsker. Timingen af trin er afgørende for succes.Vi foreslår at praktisere den mikrofluidiske enhed overfladebehandling og fluorescens mikroskopi trin mange gange for at udføre dem på en effektiv måde. Optagelse kropslige ændringer i biomolekyler er et visuelt og dynamisk fænomen, der bedst ses på film. Forskere vil bedre forstå denne metode efter at have set real-time protein og DNA mikroskopi præsenteret i denne video.For at forberede mikrofluidic enheden, tilsættes fem dele af silikone elastomer base til en del hærdningsmiddel i en vejer båd. og rør indholdet grundigt i et minut for at skabe en forhærdet PDMS-opløsning. Placer master silicium wafer i en plastik petriskål og hæld PDMS løsning over wafer at skabe en fem-millimeter lag.Dæk skålen og lad den være i en ekssiccator under vakuum i en time for at fjerne luftbobler. Derefter inkubere den overdækkede Petriskål ved 60 grader Celsius natten over for at helbrede PDMS i et fleksibelt fast stof, hvilket vil resultere i mikrofluidic kanaler, der formes i PDMS på PDMS wafer interface. På den næste dag, bruge en barbermaskine til at skære 20 med 10 millimeter rektangler omkring hver microfluidic kanal i PDMS og fjerne rektangulære blokke med en pincet.Brug en 25-gauge stump ende nål med skærpede kanter til punch en 0,5 millimeter diameter hul i den ene ende af kanalen, og sørg for, at hullet går helt gennem PDMS blok. Brug en tynd nål til at slå PDMS ud af hullet og gentag processen i den anden ende af kanalen. Placer PDMS-blokken med kanalsiden op og dækslæden ind i kammeret på en plasmabindingsmaskine, og start behandlingen.Når behandlingen er afsluttet, skal du hurtigt placere PDMS-blokken på en dæksling, så kanalen er i kontakt med slipen. Tryk på blokkens kanter, og placer derefter dækslæbet PDMS-samling på en kogeplade ved 115 grader Celsius i 15 minutter for at forstærke den permanente binding. Endelig indsætte en 10-centimeter lang.0,25 millimeter slange i indre diameter ind i udløbshullet øverst på PDMS-blokken, så væsken nemt kan strømme ud af kanalen. For von Willebrand faktor eller VWF eksperimenter injicere op til 10 mikroliter af 10 mikrogram pr. milliliter BSA-Biotin opløst i steril 1X PBS i indløbet af den mikrofluidiske enhed. Tilbageholde et par mikroliter BSA-Biotin i pipettespidsen efter injektionen og lad spidsen forblive indlejret i indløbet.Lad BSA-Biotin inkubere i apparatet i to timer, hvilket vil resultere i, at BSA ikke specifikt binder sig til dækslæbets overflade. Fjern derefter pipetten spidsen og injicere op til 10 mikroliter af ind casein blokering løsning i kanalen. Lad indfalde indbindingen i indbindingen i 30 minutter, så den kan blokere alle gratis steder og reducere den uspecifikke binding af biomolekylerne til overfladen.Fjern spidsen og injicer op til 10 mikroliter streptavidin i sterile PBS i kanalen, som vil binde sig til biotingrupperne i BSA-Biotin. Dernæst injicere op til 10 mikroliter vaskemiddel opløsning til at vaske væk overskydende streptavidin. Fjern spidsen og injicer enten VWF i enuinopløsning eller lambda DNA.Inkuber VWF i tre minutter eller lambda DNA i 45 minutter. Derefter injicere fem millimolar gratis biotin at blokere den overskydende streptavidin bindende steder. Læg en milliliter ind caseinblokerende opløsning i en sprøjte, og fastgør den i en sprøjtepumpe.Fastgør derefter den ene ende af slangen til sprøjtenålen og flow i opløsningen for at fjerne luftbobler. Ca. tre minutter efter den gratis biotinindsprøjtning fastgøres den anden ende af røret til mikrofluidisk anordnings indløb. Vælg den højeste forstørrelsesmålsætning for TIRF- eller konfokal fluorescensmikroskop.Hvis det er nødvendigt, tilsættes en dråbe nedsænkning olie på målet. Anbring den mikrofluidiske anordning på mikroskopstadiet, så dækslæbet flugter med målet. Start mikroskopi med lyse felter, og juster fokus, så funktioner som snavs og bobler er synlige.Juster derefter scenen i X- og Y-retningen, indtil kanten af den mikrofluidiske kanal er synlig og skærer rammen. Skift til FITC-kanalen, og juster Z-niveauet og TIRF-vinklen efter behov, indtil de enkelte grønne kugleformede molekyler kan skelnes fra. Juster laserintensitet og eksponeringstid for at visualisere lysstofrør uden at fotobleaching dem for hurtigt.Juster derefter kontrasten for bedre at visualisere molekylerne. Præcis fem minutter efter fri biotin injektion start og stop flow fra sprøjten pumpen til at observere ændringerne i molekylær kropsbygning ved hjælp af strømningshastigheder mellem 5000 og 30, 000 mikroliter i timen. Med VWF er det afgørende at anvende mindst en lille mængde flow, såsom 30 sekunder af 10,000 mikroliter i timen flow præcis fem minutter efter gratis biotin injektion.Gentag dette i forskellige områder af den mikrofluidiske enhed og lokalisere molekyler, der kan udvide og slappe af på flere cyklusser af start og stop flow. Bemærk, hvor lang tid det tager for molekyler at nå maksimal forlængelse og fuldstændig afslapning og optage videoer af den kontinuerlige adfærd af molekyler under forskydning flow. Fleksibiliteten af et molekyle til at ændre bekræftelse er ofte demonstreret ved sin evne til at forlænge som højere forskydning satser anvendes på grund af stigende flow.Forlængelsen versus forskydningshastighedskurven af et von Willebrand faktormolekyle er nyttigt til at karakterisere proteinets biomekaniske egenskaber. Fluorescens mikroskopi billeder af lambda DNA tilsvarende viser øget forlængelse ved højere forskydning satser på 30 sekunder og gradvis afslapning over to minutter efter flow er stoppet. Når du arbejder med VWF, skal du huske at inkubere den kun i tre minutter og fri biotin i fem minutter, før du starter flowet.Dette er afgørende for at danne det optimale antal eller biotin-streptavidin forbindelser er nødvendige for reversible optrævling. Denne metode kan tilpasses til at visualisere realtid interaktioner mellem flere biomolekyler og karakterisere deres funktioner. For eksempel kunne man bedre forstå blodplade stik dannelse ved at visualisere VWF optrævling under høj forskydning og dens binding med blodplade vedhæftning molekyle GPIb-alpha med denne metode.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-plade Flow Afdeling og Continuous Flow Circuit at evaluere endoteliale stamceller under Laminar Flow forskydningsspænding

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed enkelt-molekyle Tving proteolyse målinger ved hjælp Magnetiske Pincetter

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Oprettelse Lim og Opløseligt Gradienter for Imaging Cell Migration med Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høj opløsning Spatiotemporal Analyse af receptor Dynamics ved Single-molekyle fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence resonansenergioverførsel at studere konformationsændringer i Membranproteiner udtrykkes i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoaktiveret Lokalisering Mikroskopi med bimolekylær Fluorescens Komplementering (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescens Mikroskopi på Planar Understøttet dobbeltlag

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri Single Molecule Detection Brug Microtoroid Optiske Resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Design mikrofluidenheder for at studere cellulære reaktioner under ét eller samtidig eksisterende Chemical / El / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...