Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een National Science Foundation subsidie DMS-1463234, National Institutes of Health subsidies HL082808 en AI133634, en Lehigh University interne financiering.

1. Voorbereiding van VWF
<ol><li>Reconstrueren menselijk plasma VWF om het voor te bereiden op de etikettering reacties. Voeg 100 μL gedeïoniseerd (DI) water toe aan 100 μg lyofieliseerde VWF om een VWF-voorraadoplossing van 1 mg/mL te creëren.</li>
	<li>Dialyze VWF stock oplossing om overtollige glycine te verwijderen, waardoor de biotine en fluorophore etikettering efficiëntie.<ol>
<li>Breng 50 μL VWF-voorraadoplossing over in een 0,1 mL dialyse-eenheid met een afsnijding van 10.000 moleculair gewicht en sluit ...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen van conformatieveranderingen met één molecuul met behulp van fluorescentiemicroscopie zoals beschreven in deze methode, is het van cruciaal belang om het molecuul voor de juiste hoeveelheid tijd uit te broeden, de niet-specifieke interacties met het oppervlak te minimaliseren en stel microscoopinstellingen vast die het bleken van foto's verminderen. Het vermogen van het molecuul om vrij te veranderen bevleesdheid is gerelateerd aan het aantal biotine-streptavidin interacties...

Mechanismen voor hoe biomoleculen reageren op omgevingsstimuli zijn op grote schaal bestudeerd. Vooral in een stromingsomgeving reguleren schuif- en verlengingskrachten de conformatieveranderingen en mogelijk de functie van biomoleculen. Typische voorbeelden zijn shear-geïnduceerde ontrafeling van lambda DNA en von Willebrand factor (VWF). Lambda DNA is gebruikt als een instrument om de conformatiedynamiek van individuele, flexibele polymeerketens en de reheologie van polymeeroplossingen1,2,3,4te begrijpen. VWF is een natuurlijke stroomsensor die bloedplaatjes op wondlocaties van bloedvaten samenvoegt met abnormale afschuifsnelheden en stromingspatronen. Het ontrafelen van VWF is essentieel bij het activeren van de binding van bloedplaatjes aan het A1-domein en collageenbinding aan het A3-domein. Bovendien maakt het uitvouwen van een hoge afschuifbare A2-domein het decolleté van VWF mogelijk, dat de moleculaire gewichtsverdeling in omloop5,6regelt. Zo kan directe visualisatie van hoe deze moleculen zich gedragen onder stroom ons fundamentele begrip van hun biomechanica en functie aanzienlijk verbeteren, wat op zijn beurt nieuwe diagnostische en therapeutische toepassingen mogelijk kan maken.
Typische methoden om single-molecule conformaties te karakteriseren zijn optische / magnetische pincet, atomaire kracht microscopie (AFM) en single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (FRET)7. Single-molecule kracht spectroscopie is een krachtig instrument om de kracht en beweging geassocieerd met de conformatieveranderingen van biomoleculen te onderzoeken. Het ontbreekt echter aan de mogelijkheid om de algehele moleculaire conformaties in kaart te brengen8. AFM is in staat om te beeldvorming met een hoge ruimtelijke resolutie, maar is beperkt in temporele resolutie9,10. Bovendien kan contact tussen de tip en het monster de respons die door de stroom wordt veroorzaakt, verwarren. Andere methoden zoals FRET en nanoporie analytics bepalen single-molecule eiwit vouwen en ontvouwen staten op basis van de detectie van intramoleculaire afstand en uitgesloten volumes. Deze methoden staan echter nog in de kinderschoenen en beperkt in hun directe observatie van enkelmolecuulconformaties11,12,13,14.
Aan de andere kant heeft het direct observeren van macromoleculen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie onder fluorescentiemicroscopie ons begrip van de dynamiek van één molecuul in veel biologische processenverbeterd 15,16. Zo hebben Fu et al. onlangs voor het eerst gelijktijdige visualisatie van VWF-verlenging en bloedplaatjesreceptorbinding bereikt. In hun werk werden VWF-moleculen geïmmobiliseerd op het oppervlak van een microfluïdisch kanaal door middel van biotine-streptavidin interacties en afgebeeld onder totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie in verschillende schuifstroom omgevingen17. Door een soortgelijke methode toe te passen als Fu's, tonen we hier aan dat conformaties van VWF en lambda DNA direct kunnen worden waargenomen onder zowel TIRF als confocale fluorescentiemicroscopie. Zoals in figuur 1wordt weergegeven, worden microfluïde apparaten gebruikt om de schuifstroom te maken en te controleren en worden biomoleculen geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Bij toepassing van verschillende afschuifsnelheden worden conformaties van hetzelfde molecuul geregistreerd om de lengte te meten, ook weergegeven in figuur 1. De methode kan op grote schaal worden toegepast om ander polymeergedrag te onderzoeken onder complexe stromingsomgevingen voor zowel rheologische als biologische studies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Single-molecule gedrag onder mechanische verstoring is op grote schaal gekenmerkt om veel biologische processen te begrijpen. Methoden zoals atoomkrachtmicroscopie hebben echter een beperkte tijdelijke resolutie, terwijl Förster resonance energy transfer (FRET) alleen voegformaties kan voorkomen. Fluorescentie microscopie, aan de andere kant, maakt real-time in situ visualisatie van enkele moleculen in verschillende stroomomstandigheden. Ons protocol beschrijft de stappen om conformatieveranderingen van afzonderlijke biomoleculen onder verschillende schuifstromenomgevingen vast te leggen met behulp van fluorescentiemicroscopie. De schuifstroom wordt gemaakt in microfluïde kanalen en wordt aangestuurd door een spuitpomp. Als demonstraties van de methode, von Willebrand factor (VWF) en lambda DNA worden gelabeld met biotine en fluorophore en vervolgens geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Hun conformaties worden continu gecontroleerd onder variabele schuifstroom met behulp van totale interne reflectie (TIRF) en confocale fluorescentie microscopie. De omkeerbare ontrafelende dynamiek van VWF zijn nuttig om te begrijpen hoe de functie ervan is geregeld in menselijk bloed, terwijl de conformatie van lambda DNA inzichten biedt in de biofysica van macromoleculen. Het protocol kan ook op grote schaal worden toegepast om het gedrag van polymeren, met name biopolymeren, in verschillende stromingsomstandigheden te bestuderen en om de reologie van complexe vloeistoffen te onderzoeken.

Het observeren van het dynamische gedrag van biomoleculen zoals VWF en lambda DNA is sterk afhankelijk van het optimaliseren van hun binding aan het apparaatoppervlak. Het uitbroeden van oppervlaktebehandelingen voor de aanbevolen tijden in het microfluïde apparaat is cruciaal voor het verkrijgen van binding met een paar verankeringspunten, zodat moleculen zich vrij kunnen uitbreiden en ontspannen bij het veranderen van stroom. Als de eiwitten of DNA te sterk gebonden zijn met meerdere koppelingen, zullen ze zich uitstr...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

We presenteren een protocol voor het immobiliseren van enkele macromoleculen in microfluïde apparaten en het kwantificeren van veranderingen in hun conformaties onder schuifstroom. Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische en functionele eigenschappen van biomoleculen zoals eiwitten en DNA in een stroomomgeving.

Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Het kwantificeren van de conformatieveranderingen in enkele biomoleculen onder schuifstroom is nuttig voor het begrijpen van de functie en biofysica van macromoleculen zoals eiwitten en DNA. Fluorescentiemicroscopie maakt real-time in-situ visualisatie van enkele moleculen in fysiologische stroomomgevingen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie mogelijk. Dit is ongeëvenaard door andere technieken zoals AFM.Door het karakteriseren van de afschuifkracht waaronder eiwitten ons DNA globale conformatieveranderingen hebben, kan men geneesmiddelen die deze biofysische eigenschappen nabootsen beter ontwerpen. Dit protocol kan op grote schaal worden toegepast om het gedrag of andere polymeren, met name biopolymeren, in verschillende stromingsomstandigheden te bestuderen en de reologie van complexe vloeistoffen te onderzoeken. De timing van stappen is van cruciaal belang voor succes.We raden het beoefenen van de microfluïde apparaat oppervlaktebehandeling en fluorescentie microscopie stappen vele malen uit te voeren op een efficiënte manier. Het vastleggen van conformatieveranderingen in biomoleculen is een visueel en dynamisch fenomeen dat het best op film te zien is. Wetenschappers zullen deze methode beter begrijpen na het zien van de real-time eiwit- en DNA-microscopie gepresenteerd in deze video.Om het microfluidic apparaat voor te bereiden, voegt u vijf delen siliconene elastomeerbasis toe aan een deel uithardingsmiddel in een weegboot. en roer de inhoud grondig gedurende een minuut om een voorharde PDMS-oplossing te creëren. Plaats de master siliconen wafer in een plastic petrischaal en giet de PDMS-oplossing over de wafer om een vijf millimeter laag te creëren.Bedek de schotel en laat het in een desiccator onder vacuüm voor een uur om luchtbellen te verwijderen. Dan incubeer de overdekte Petri schotel op 60 graden Celsius 's nachts om de PDMS te genezen in een flexibele vaste stof, die zal resulteren in microfluïde kanalen worden gegoten in de PDMS op de PDMS wafer interface. Gebruik de volgende dag een scheermes om rechthoeken van 20 bij 10 millimeter rond elk microfluïdisch kanaal in het PDMS te snijden en de rechthoekige blokken met een pincet te verwijderen.Gebruik een 25-gauge stompe eindnaald met geslepen randen om een gat met een diameter van 0,5 millimeter aan de ene kant van het kanaal te slaan, om ervoor te zorgen dat het gat volledig door het PDMS-blok gaat. Gebruik een dunne naald om de PDMS uit het gat te slaan en herhaal het proces aan de andere kant van het kanaal. Plaats het PDMS-blok met de kanaalzijde omhoog en de coverslip in de kamer van een plasmabindmachine en start de behandeling.Wanneer de behandeling is voltooid, plaats het PDMS-blok snel op een coverslip, zodat het kanaal in contact komt met de slip. Druk uitoefenen op de randen van het blok, plaats dan de coverslip PDMS assemblage op een hete plaat op 115 graden Celsius gedurende 15 minuten om de permanente binding te versterken. Tot slot, steek een 10-centimeter lang.0,25 millimeter binnendiameter buis in het uitlaatgat aan de bovenkant van het PDMS blok om vloeistof gemakkelijk uit het kanaal te laten stromen. Voor von Willebrand factor of VWF experimenten injecteren tot 10 microliter van 10 microgram per milliliter BSA-Biotine opgelost in steriele 1X PBS in de inlaat van het microfluïde apparaat. Steek een paar microliter BSA-Biotine in de pipetpunt na injectie en laat de punt in de inlaat blijven zitten.Laat de BSA-Biotine twee uur in het apparaat uitbroeden, wat ertoe leidt dat BSA niet specifiek aan het dekselvlak bindt. Verwijder vervolgens de pipetpunt en injecteer tot 10 microliter caseïneblokkeringsoplossing in het kanaal. Laat de caseïneoplossing 30 minuten uitbroeden, zodat het alle vrije plaatsen kan blokkeren en niet-specifieke binding van de biomoleculen aan het oppervlak kan verminderen.Verwijder de tip en injecteer tot 10 microliter streptavidin in steriele PBS in het kanaal, dat zich bindt aan de biotinegroepen van de BSA-Biotine. Vervolgens injecteren tot 10 microliter wasmiddel oplossing weg te wassen overtollige streptavidin. Verwijder de tip en injecteer vwf in caseïne oplossing of lambda DNA.Incubbate VWF gedurende drie minuten of lambda DNA gedurende 45 minuten. Injecteer vervolgens vijf millimolar vrije biotine om de overtollige streptavidin bindingsplaatsen te blokkeren. Laad een milliliter caseïneblokkerende oplossing in een spuit en zet deze vast in een spuitpomp.Bevestig vervolgens een uiteinde van de slang aan de spuitnaald en stroom in de oplossing om luchtbellen te verwijderen. Ongeveer drie minuten na de vrije biotine-injectie bevestigt u het andere uiteinde van de buis aan de inlaat van het microfluïde apparaat. Selecteer de hoogste vergrotingsdoelstelling van de TIRF- of confocale fluorescentiemicroscoop.Voeg indien nodig een druppel onderdompelingsolie toe aan het doel. Plaats het microfluïde apparaat op het microscooppodium, zodat de coverslip gelijk is met het doel. Start helder-veld microscopie en pas de focus, zodat functies zoals puin en bellen zichtbaar zijn.Pas vervolgens het stadium in de X- en Y-richtingen aan totdat de rand van het microfluïde kanaal zichtbaar is en het frame doorsnijdt. Schakel over naar het FITC-kanaal en pas de Z-hoek en de TIRF-hoek zo nodig aan totdat de afzonderlijke groene bolvormige moleculen kunnen worden onderscheiden. Pas laserintensiteit en belichtingstijd aan om fluorescerende moleculen te visualiseren zonder ze te snel te fotobleachen.Pas vervolgens het contrast aan om de moleculen beter te visualiseren. Precies vijf minuten na de vrije biotine injectie start en stop stroom van de spuitpomp om de veranderingen in moleculaire conformatie met behulp van stroomsnelheden tussen 5000 en 30.000 microliter per uur te observeren. Met VWF is het van cruciaal belang om ten minste een kleine hoeveelheid stroom toe te passen, zoals 30 seconden van 10.000 microliter per uur stroom precies vijf minuten na de vrije biotine injectie.Herhaal dit in verschillende gebieden van het microfluïde apparaat en lokaliseren moleculen die kunnen uitbreiden en ontspannen op meerdere cycli van het starten en stoppen van de stroom. Merk op hoe lang het duurt voordat moleculen een maximale uitbreiding bereiken en volledige ontspanning en video's opnemen van het continue gedrag van moleculen onder schuifstroom. De flexibiliteit van een molecuul om bevestiging te veranderen wordt vaak aangetoond door zijn vermogen om te verlengen als hogere schuifsnelheden worden toegepast als gevolg van toenemende stroom.De uitbreiding versus afschuifsnelheid curve van een von Willebrand factor molecuul is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische eigenschappen van het eiwit. Fluorescentie microscopie beelden van lambda DNA tonen eveneens verhoogde uitbreiding op hogere afschuifsnelheden bij 30 seconden en geleidelijke ontspanning meer dan twee minuten na stroom wordt gestopt. Bij het werken met VWF, vergeet niet om het uit te broeden slechts voor drie minuten en gratis biotine gedurende vijf minuten voor het starten van de stroom.Dit is van cruciaal belang voor het vormen van het optimale getal of biotine-streptavidin koppelingen die nodig zijn voor omkeerbare ontrafeling. Deze methode kan worden aangepast om real-time interacties tussen meerdere biomoleculen te visualiseren en hun functies te karakteriseren. Zo zou men de vorming van bloedplaatjesplug's beter kunnen begrijpen door vwf te visualiseren die met hoge afschuif en de binding ervan met het bloedplaatjesathesiemolecuul GPIb-alpha met deze methode wordt gevisualiseerd.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...