Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de la National Science Foundation DMS-1463234, national Institutes of Health subventions HL082808 et AI133634, et le financement interne de l'Université Lehigh.

1. Préparation de la VWF
<ol><li>Reconstituer le plasma humain VWF pour le préparer aux réactions d'étiquetage. Ajouter 100 l'eau déionisée (DI) à 100 g de VWF lyophilisé pour créer une solution de stock VWF de 1 mg/mL.</li>
	<li>Dialyez la solution de stock VWF afin d'éliminer l'excès de glycine, augmentant ainsi l'efficacité d'étiquetage de la biotine et du fluorophore.<ol>
<li>Transférer 50 L de solution de bouillon VWF dans une unité de dialyse de 0,1 ml avec un seuil de poids moléculaire de 10 000 ...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Pour obtenir des données de haute qualité sur les changements conformationnels à molécule unique à l'aide de la microscopie de fluorescence décrite dans cette méthode, il est essentiel d'incuber la molécule pendant le temps approprié, de minimiser ses interactions non spécifiques avec la surface et établir des réglages de microscope qui réduisent le photoblanchiment. La capacité de la molécule à modifier librement la conformation est liée au nombre d'interactions biotine-streptavidine formées entre la m...

Les mécanismes de la façon dont les biomolécules réagissent aux stimuli environnementaux ont été largement étudiés. Dans un environnement d'écoulement en particulier, les forces de cisaillement et d'allongement régulent les changements conformationnels et potentiellement la fonction des biomolécules. Les exemples typiques incluent le dénouement induit par le cisaillement de l'ADN lambda et du facteur von Willebrand (VWF). Lambda DNA a été utilisé comme un outil pour comprendre la dynamique conformationnelle des chaînes individuelles et flexibles polymères et la rhéologie des solutions polymères1,2,3,4. VWF est un capteur d'écoulement naturel qui agrége les plaquettes sur les sites de plaies des vaisseaux sanguins avec des taux de cisaillement anormaux et des schémas de débit. Le dénouement de la VWF est essentiel pour activer la reliure des plaquettes au domaine A1 et la liaison au collagène au domaine A3. En outre, le déploiement du domaine A2 induit par le cisaillement élevé permet le clivage de VWF, qui régule sa répartition du poids moléculaire en circulation5,6. Ainsi, la visualisation directe de la façon dont ces molécules se comportent sous le flux peut grandement améliorer notre compréhension fondamentale de leur biomécanique et de leur fonction, ce qui peut permettre de nouvelles applications diagnostiques et thérapeutiques.
Les méthodologies typiques pour caractériser les conformations d'une seule molécule comprennent les pinces optiques/magnétiques, la microscopie de force atomique (AFM) et le transfert d'énergie de résonance à molécule unique (FRET)7. La spectroscopie de force à molécule unique est un outil puissant pour étudier la force et le mouvement associés aux changements conformationnels des biomolécules. Cependant, il n'a pas la capacité de cartographier les conformations moléculaires globales8. L'AFM est capable d'imagerie avec une haute résolution spatiale, mais est limitée dans la résolution temporelle9,10. De plus, le contact entre la pointe et l'échantillon peut confondre la réponse induite par le débit. D'autres méthodes comme le FRET et l'analyse des nanopores déterminent le pliage et le développement des protéines monomolécules en fonction de la détection de la distance intramoléculaire et des volumes exclus. Cependant, ces méthodes sont encore à leurs balbutiements et limitées dans leur observation directe des conformations monomolécules11,12,13,14.
D'autre part, l'observation directe des macromolécules à haute résolution temporelle et spatiale sous microscopie fluorescence a amélioré notre compréhension de la dynamique d'une seule molécule dans de nombreux processus biologiques15,16. Par exemple, Fu et coll. ont récemment réalisé la visualisation simultanée de l'allongement de la VWF et de la liaison des récepteurs plaquettaires pour la première fois. Dans leur travail, les molécules de VWF ont été immobilisées à la surface d'un canal microfluidique par des interactions biotin-streptavidin et représentées sous la microscopie de fluorescence interne totale (TIRF) à des environnements de flux de cisaillement variables17. En appliquant une méthode similaire à celle de Fu, nous démontrons ici que les conformations de l'ADN de VWF et de lambda peuvent être directement observées sous la microscopie de fluorescence de TIRF et de fluorescence confocale. Comme le montre la figure 1, des dispositifs microfluidiques sont utilisés pour créer et contrôler le flux de cisaillement, et les biomolécules sont immobilisées à la surface du chenal. Lors de l'application de différents taux de cisaillement, des conformations d'une même molécule sont enregistrées pour mesurer la longueur d'extension, également indiquée à la figure 1. La méthode pourrait être largement appliquée pour explorer d'autres comportements polymères dans des environnements d'écoulement complexes pour des études rhéologiques et biologiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Le comportement d'une seule molécule sous perturbation mécanique a été caractérisé largement pour comprendre beaucoup de processus biologiques. Cependant, des méthodes telles que la microscopie de force atomique ont une résolution temporelle limitée, tandis que le transfert d'énergie de résonance (FRET) ne permet que d'inférer des conformations. La microscopie de fluorescence, d'autre part, permet la visualisation in situ en temps réel de molécules uniques dans diverses conditions de débit. Notre protocole décrit les étapes pour capturer les changements conformationnels des biomolécules simples sous différents environnements de flux de cisaillement utilisant la microscopie de fluorescence. Le flux de cisaillement est créé à l'intérieur des canaux microfluidiques et contrôlé par une pompe à seringues. Comme démonstrations de la méthode, le facteur von Willebrand (VWF) et l'ADN lambda sont étiquetés avec de la biotine et du fluorophore, puis immobilisés sur la surface du chenal. Leurs conformations sont surveillées en permanence sous le flux variable de cisaillement à l'aide d'une réflexion interne totale (TIRF) et d'une microscopie à fluorescence confocale. La dynamique réversible de démêler de VWF sont utiles pour comprendre comment sa fonction est régulée dans le sang humain, tandis que la conformation de l'ADN lambda offre un aperçu de la biophysique des macromolécules. Le protocole peut également être largement appliqué pour étudier le comportement des polymères, en particulier les biopolymères, dans des conditions d'écoulement variables et pour étudier la rhéologie des fluides complexes.

L'observation du comportement dynamique des biomolécules telles que vwF et lambda DNA dépend fortement de l'optimisation de leur liaison à la surface de l'appareil. L'incubation des traitements de surface pour les temps recommandés dans le dispositif microfluidique est cruciale pour obtenir la liaison avec quelques points d'ancrage, de sorte que les molécules peuvent librement s'étendre et se détendre lors de l'évolution du débit. Si les protéines ou l'ADN sont liés trop fortement avec des liens multiples, ils...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Nous présentons un protocole pour immobiliser les macromolécules simples dans les dispositifs microfluidiques et quantifier les changements dans leurs conformations sous le flux de cisaillement. Ce protocole est utile pour caractériser les propriétés biomécaniques et fonctionnelles des biomolécules telles que les protéines et l'ADN dans un environnement de flux.

Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

La quantification des changements conformationnels dans les biomolécules simples sous le flux de cisaillement est utile pour comprendre la fonction et la biophysique des macromolécules comme les protéines et l’ADN. La microscopie par fluorescence permet la visualisation in situ en temps réel de molécules uniques dans des environnements de flux physiologiques à haute résolution temporelle et spatiale. Cela est inégalé par d’autres techniques comme l’AFM.En caractérisant la force de cisaillement sous laquelle les protéines de notre ADN ont des changements conformationnels mondiaux, on peut mieux concevoir des médicaments qui imitent ces propriétés biophysiques. Ce protocole peut être largement appliqué pour étudier le comportement ou d’autres polymères, en particulier les polymères biologiques, dans des conditions d’écoulement variables et pour étudier la rhéologie des fluides complexes. Le moment des étapes est essentiel au succès.Nous suggérons de pratiquer le traitement de surface du dispositif microfluidique et la microscopie de fluorescence étapes de nombreuses fois pour les exécuter d’une manière efficace. Capturer les changements conformationnels dans les biomolécules est un phénomène visuel et dynamique mieux vu sur le film. Les scientifiques comprendront mieux cette méthode après avoir vu la microscopie protéique et ADN en temps réel présentée dans cette vidéo.Pour préparer l’appareil microfluidique, ajouter cinq parties de la base de l’élastomer en silicone à un agent de séchage de pièce dans un bateau de pesage. et remuer soigneusement le contenu pendant une minute pour créer une solution PDMS pré-durcie. Placez la plaquette de silicium maître dans une boîte de Pétri en plastique et versez la solution PDMS sur la gaufrette pour créer une couche de cinq millimètres.Couvrir le plat et le laisser dans un dessiccateur sous vide pendant une heure pour enlever les bulles d’air. Puis incuber la boîte de Pétri couverte à 60 degrés Celsius pendant la nuit pour guérir le PDMS dans un solide flexible, ce qui se traduira par des canaux microfluidiques étant moulés dans le PDMS à l’interface de gaufrette PDMS. Le lendemain, utilisez un rasoir pour couper 20 rectangles de 10 millimètres autour de chaque canal microfluidique dans le PDMS et retirez les blocs rectangulaires à l’aide d’une pince à épiler.Utilisez une aiguille à extrémité émoussée de calibre 25 avec des bords aiguisés pour percer un trou de 0,5 millimètre de diamètre à une extrémité du chenal, en vous assurant que le trou passe complètement à travers le bloc PDMS. Utilisez une aiguille fine pour perforer le PDMS hors du trou et répéter le processus à l’autre extrémité du canal. Placez le bloc PDMS avec le côté canal vers le haut et le coverslip dans la chambre d’une machine de liaison plasmatique et commencer le traitement.Lorsque le traitement est terminé, placez rapidement le bloc PDMS sur un coverslip de sorte que le canal est en contact avec le glissement. Appliquer une pression sur les bords du bloc, puis placer l’assemblage PDMS coverslip sur une plaque chaude à 115 degrés Celsius pendant 15 minutes pour renforcer la liaison permanente. Enfin, insérez un 10 centimètres de long.Tube de diamètre intérieur de 0,25 millimètre dans le trou de sortie en haut du bloc PDMS pour permettre au fluide de sortir facilement du canal. Pour le facteur von Willebrand ou vwf expériences injecter jusqu’à 10 microlitres de 10 microgrammes par millilitre BSA-Biotin dissous dans stérile 1X PBS dans l’entrée de l’appareil microfluidique. Retenir quelques microlitres de BSA-Biotin dans la pointe de la pipette après l’injection et laisser la pointe rester encastrée dans l’entrée.Laissez le BSA-Biotin couver dans l’appareil pendant deux heures, ce qui entraînera une liaison non spécifique bsa à la surface du coverslip. Retirez ensuite la pointe pipette et injectez jusqu’à 10 microlitres de solution de blocage de la caséine dans le canal. Laissez la solution de caséine couver pendant 30 minutes afin qu’elle puisse bloquer tous les sites libres et réduire la liaison non spécifique des biomolécules à la surface.Retirer la pointe et injecter jusqu’à 10 microlitres de streptavidine dans le canal stérile PBS, qui se liera aux groupes de biotine de la BSA-Biotine. Ensuite, injectez jusqu’à 10 microlitres de solution détergente pour laver l’excès de streptavidine. Retirer la pointe et injecter soit VWF dans la solution casein ou lambda ADN.Incuber vwf pendant trois minutes ou lambda ADN pendant 45 minutes. Injectez ensuite cinq millimolaires de biotine libre pour bloquer l’excès de streptavidine. Chargez un millilitre de solution de blocage de la caséine dans une seringue et fixez-le dans une pompe à seringues.Fixez ensuite une extrémité du tube à l’aiguille de seringue et coulez dans la solution pour enlever les bulles d’air. Environ trois minutes après l’injection gratuite de biotine, fixez l’autre extrémité du tube à l’entrée du dispositif microfluidique. Sélectionnez l’objectif de grossissement le plus élevé du microscope à fluorescence TIRF ou confocal.Si nécessaire, ajouter une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif. Placez le dispositif microfluidique sur l’étape du microscope de sorte que le coverslip est rincé avec l’objectif. Démarrez la microscopie à champ lumineux et ajustez la mise au point de sorte que des caractéristiques telles que les débris et les bulles soient visibles.Ajustez ensuite la scène dans les directions X et Y jusqu’à ce que le bord du canal microfluidique soit visible et coupe le cadre en deux. Passez au canal FITC et ajustez le niveau Z et l’angle TIRF au besoin jusqu’à ce que les molécules globulaires vertes individuelles puissent être distinguées. Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition pour visualiser les molécules fluorescentes sans les photobleaching trop rapidement.Ajustez ensuite le contraste pour mieux visualiser les molécules. Exactement cinq minutes après le début de l’injection gratuite de biotine et l’arrêt du flux de la pompe à seringues pour observer les changements dans la conformation moléculaire en utilisant des débits entre 5000 et 30.000 microlitres par heure. Avec VWF, il est essentiel d’appliquer au moins une petite quantité de flux, comme 30 secondes de 10 000 microlitres par heure exactement cinq minutes après l’injection gratuite de biotine.Répétez cette activité dans diverses zones du dispositif microfluidique et localisez les molécules qui peuvent s’étendre et se détendre sur plusieurs cycles de démarrage et d’arrêt du débit. Notez combien de temps il faut aux molécules pour atteindre l’extension maximale et la relaxation complète et enregistrer des vidéos du comportement continu des molécules sous le flux de cisaillement. La flexibilité d’une molécule pour changer la confirmation est souvent démontrée par sa capacité à s’allonger à mesure que des taux de cisaillement plus élevés sont appliqués en raison de l’augmentation du débit.La courbe de taux d’extension par rapport au cisaillement d’une molécule de facteur von Willebrand est utile pour caractériser les propriétés biomécaniques de la protéine. Les images de microscopie de fluorescence de l’ADN de lambda montrent également l’extension accrue sur des taux plus élevés de cisaillement à 30 secondes et la relaxation graduelle plus de deux minutes après que le flux soit arrêté. Lorsque vous travaillez avec VWF, n’oubliez pas de l’incuber seulement pendant trois minutes et de libérer la biotine pendant cinq minutes avant de commencer le flux.Ceci est essentiel pour former le nombre optimal ou les liens biotine-streptavidine nécessaires pour le dénouement réversible. Cette méthode peut être adaptée pour visualiser les interactions en temps réel entre plusieurs biomolécules et caractériser leurs fonctions. Par exemple, on pourrait mieux comprendre la formation de bouchons de plaquettes en visualisant VWF démêler sous le cisaillement élevé et sa liaison avec la molécule d’adhérence plaquettaire GPIb-alpha avec cette méthode.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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Bio-ingénierie

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer pour étudier les changements conformationnels dans des protéines membranaires exprimés dans les cellules de mammifères

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...