Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch eine Nationale Wissenschaftsstiftung unterstützt, die DMS-1463234, die Nationalen Gesundheitsinstitute HL082808 und AI133634 und die interne Finanzierung der Lehigh University gewährt.

1. Vorbereitung von VWF
<ol><li>Rekonstituieren Sie menschliches Plasma VWF, um es für die Etikettierungsreaktionen vorzubereiten. Fügen Sie 100 l deionisiertes (DI) Wasser zu 100 g lyophilisiertem VWF hinzu, um eine VWF-Lagerlösung mit 1 mg/ml zu erstellen.</li>
	<li>Dialyze VWF-Lagerlösung, um überschüssiges Glycin zu entfernen und damit die Biotin- und Fluorophor-Etikettierungseffizienz zu erhöhen.<ol>
<li>Übertragen Sie 50 l VWF-Lagerlösung in eine 0,1 ml Dialyseeinheit mit einem 10.000 Molekulargewichtsab...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. 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S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Um qualitativ hochwertige Daten von konbildenden Veränderungen einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, wie in dieser Methode beschrieben, ist es wichtig, das Molekül für die entsprechende Zeit zu inkubieren, seine unspezifischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu minimieren. und stellen Sie Mikroskopeinstellungen ein, die das Photobleichen reduzieren. Die Fähigkeit des Moleküls, die Konformation frei zu verändern, hängt mit der Anzahl der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen zusam...

Mechanismen, wie Biomoleküle auf Umweltreize reagieren, wurden umfassend untersucht. Insbesondere in einer Strömungsumgebung regulieren Scher- und Dehnungskräfte die Konformationsveränderungen und potenziell die Funktion von Biomolekülen. Typische Beispiele sind das scherinduzierte Entwirren der Lambda-DNA und der von Willebrand-Faktor (VWF). Lambda DNA wurde als Werkzeug verwendet, um die konforme Dynamik einzelner, flexibler Polymerketten und die Rheologie von Polymerlösungen1,2,3,4zu verstehen. VWF ist ein natürlicher Strömungssensor, der Blutplättchen an Wundstellen von Blutgefäßen mit abnormalen Scherraten und Strömungsmustern aggregiert. Die Auflösung von VWF ist für die Aktivierung der Bindung von Thrombozyten an die A1-Domäne und der Kollagenbindung an den A3-Bereich unerlässlich. Darüber hinaus ermöglicht die hochscherinduzierte A2-Domänenentfaltung die Spaltung von VWF, das seine Molekulargewichtsverteilung im Umlaufreguliert 5,6. Die direkte Visualisierung des Verhaltens dieser Moleküle unter fließendem Fluss kann unser grundlegendes Verständnis ihrer Biomechanik und Funktion erheblich verbessern, was wiederum neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen ermöglichen kann.
Typische Methoden zur Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationen sind optische/magnetische Pinzette, Atomkraftmikroskopie (AFM) und einmolekulare Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)7. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Kraft und Bewegung zu untersuchen, die mit den konformen Veränderungen von Biomolekülen verbunden sind. Es fehlt jedoch die Fähigkeit, allgemeine molekulare Konformationen8abzubilden. AFM ist in der Lage, Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung, ist aber in der zeitlichen Auflösung9,10begrenzt. Darüber hinaus kann der Kontakt zwischen der Spitze und der Probe die durch den Durchfluss induzierte Reaktion verwirren. Andere Methoden wie FRET und Nanopore Analytics bestimmen die Faltung und Entfaltung von Einzelmolekülproteinen auf der Grundlage des Nachweises von intramolekularer Entfernung und ausgeschlossenen Volumina. Diese Methoden stecken jedoch noch in den Kinderschuhen und sind in ihrer direkten Beobachtung der Einzelmolekül-Konformationen11,12,13,14begrenzt.
Andererseits hat die direkte Beobachtung von Makromolekülen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung unter Fluoreszenzmikroskopie unser Verständnis der Einzelmoleküldynamik in vielen biologischen Prozessenverbessert 15,16. So haben Fu et al. kürzlich erstmals eine gleichzeitige Visualisierung der VWF-Dehnung und der Thrombozytenrezeptorbindung erreicht. In ihrer Arbeit wurden VWF-Moleküle auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals durch Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen immobilisiert und unter totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) in unterschiedlichen Scherflussumgebungen abgebildet17. Mit einer ähnlichen Methode wie Fu zeigen wir hier, dass Konformationen von VWF- und Lambda-DNA sowohl unter TIRF- als auch in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie direkt beobachtet werden können. Wie in Abbildung 1dargestellt, werden mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um den Scherfluss zu erzeugen und zu steuern, und Biomoleküle werden auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Bei Anwendung unterschiedlicher Scherraten werden Konformationen desselben Moleküls aufgezeichnet, um die Verlängerungslänge zu messen, siehe auch abbildung 1. Die Methode könnte weit verbreitet angewendet werden, um andere Polymerverhalten unter komplexen Strömungsumgebungen sowohl für rheologische als auch für biologische Studien zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Das Verhalten von Einzelmolekülen unter mechanischer Störung wurde weithin charakterisiert, um viele biologische Prozesse zu verstehen. Methoden wie die Atomkraftmikroskopie haben jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung, während Förster Resonanzenergieübertragung (FRET) nur die Ableitung von Konformationen zulässt. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle unter verschiedenen Strömungsbedingungen. Unser Protokoll beschreibt die Schritte zur Erfassung von konformen Veränderungen einzelner Biomoleküle in verschiedenen Scherflussumgebungen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Scherstrom wird in mikrofluidischen Kanälen erzeugt und über eine Spritzenpumpe gesteuert. Als Demonstrationen der Methode werden von Willebrand-Faktor (VWF) und Lambda-DNA mit Biotin und Fluorophor gekennzeichnet und dann auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Ihre Konformationen werden unter variablem Scherstrom kontinuierlich mit Derinkintheitierreflexion (TIRF) und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Die reversible Entwirrungsdynamik von VWF ist nützlich, um zu verstehen, wie seine Funktion im menschlichen Blut reguliert wird, während die Konformation der Lambda-DNA Einblicke in die Biophysik von Makromolekülen bietet. Das Protokoll kann auch weit verbreitet werden, um das Verhalten von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen.

Die Beobachtung des dynamischen Verhaltens von Biomolekülen wie VWF und Lambda DNA hängt in hohem Maße von der Optimierung ihrer Bindung an die Geräteoberfläche ab. Die Inkubation von Oberflächenbehandlungen für die empfohlenen Zeiten im mikrofluidischen Gerät ist entscheidend, um eine Bindung mit wenigen Verankerungspunkten zu erhalten, so dass moleküle sich bei wechselndem Fluss frei ausdehnen und entspannen können. Wenn die Proteine oder die DNA zu stark mit mehreren Verbindungen gebunden sind, werden sie si...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Die Quantifizierung der konformen Veränderungen in einzelnen Biomolekülen unter Scherfluss ist nützlich, um die Funktion und Biophysik von Makromolekülen wie Protein und DNA zu verstehen. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle in physiologischen Strömungsumgebungen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies ist unübertroffen von anderen Techniken wie AFM.Durch die Charakterisierung der Scherkraft, unter der unsere DNA globale Konformationsveränderungen hat, kann man besser Medikamente entwerfen, die diese biophysikalischen Eigenschaften imitieren. Dieses Protokoll kann weit verbreitet werden, um das Verhalten oder andere Polymere, insbesondere Biopolymere, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen. Der Zeitpunkt der Schritte ist entscheidend für den Erfolg.Wir empfehlen, die Oberflächenbehandlung und Fluoreszenzmikroskopie der mikrofluidischen Geräte mehrmals zu praktizieren, um sie effizient auszuführen. Die Erfassung von konformen Veränderungen in Biomolekülen ist ein visuelles und dynamisches Phänomen, das am besten auf Film betrachtet wird. Wissenschaftler werden diese Methode besser verstehen, nachdem sie die in diesem Video vorgestellte Echtzeit-Protein- und DNA-Mikroskopie gesehen haben.Um das mikrofluidische Gerät vorzubereiten, fügen Sie fünf Teile der Silikonelastomerbasis zu einem TeilHärtungsmittel in einem Wägeboot hinzu. und rühren Sie den Inhalt gründlich für eine Minute, um eine vorgehärtete PDMS-Lösung zu erstellen. Legen Sie den Master-Silizium-Wafer in eine Kunststoff-Petrischale und gießen Sie die PDMS-Lösung über den Wafer, um eine Fünf-Millimeter-Schicht zu erstellen.Bedecken Sie die Schale und lassen Sie sie in einem Trockentrockner unter Vakuum für eine Stunde, um Luftblasen zu entfernen. Dann inkubieren Sie die bedeckte Petrischale bei 60 Grad Celsius über Nacht, um das PDMS in einen flexiblen Feststoff auszuhärten, was dazu führt, dass an der PDMS-Wafer-Schnittstelle mikrofluidische Kanäle in das PDMS eingegossen werden. Verwenden Sie am nächsten Tag mit einem Rasiermesser 20 mal 10 Millimeter Rechtecke um jeden mikrofluidischen Kanal im PDMS und entfernen Sie die rechteckigen Blöcke mit einer Pinzette.Verwenden Sie eine 25-Spur stumpfe Endnadel mit geschärften Kanten, um ein Loch von 0,5 Millimetern an einem Ende des Kanals zu schlagen, um sicherzustellen, dass das Loch vollständig durch den PDMS-Block geht. Verwenden Sie eine dünne Nadel, um das PDMS aus dem Loch zu stanzen und den Prozess am anderen Ende des Kanals zu wiederholen. Legen Sie den PDMS-Block mit der Kanalseite nach oben und dem Deckelrutsch in die Kammer einer Plasma-Bindungsmaschine und starten Sie die Behandlung.Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, legen Sie den PDMS-Block schnell auf einen Deckel, so dass der Kanal mit dem Schlupf in Berührung kommt. Drücken Sie auf die Ränder des Blocks, und legen Sie dann die Abdeckungsrutsch-PDMS-Baugruppe 15 Minuten lang auf eine Kochplatte bei 115 Grad Celsius, um die dauerhafte Bindung zu verstärken. Fügen Sie schließlich eine Länge von 10 Zentimetern ein.0,25 Millimeter Innendurchmesser Rohr in das Auslassloch an der Oberseite des PDMS-Blocks, damit Flüssigkeit leicht aus dem Kanal fließen kann. Für von Willebrand-Faktor- oder VWF-Experimente injizieren bis zu 10 Mikroliter von 10 Mikroliter pro Milliliter BSA-Biotin in sterilem 1X PBS gelöst in den Einlass des mikrofluidischen Geräts. Halten Sie nach der Injektion ein paar Mikroliter BSA-Biotin in der Pipettenspitze ein und lassen Sie die Spitze in den Einlass einbetten.Lassen Sie das BSA-Biotin zwei Stunden lang im Gerät inkubieren, was dazu führt, dass BSA nicht spezifisch an die Deckbedeckungsoberfläche bindet. Entfernen Sie dann die Pipettenspitze und injizieren Sie bis zu 10 Mikroliter Casein-Blockierlösung in den Kanal. Lassen Sie die Casein-Lösung 30 Minuten lang inkubieren, damit sie freie Stellen blockieren und die unspezifische Bindung der Biomoleküle an die Oberfläche reduzieren kann.Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie bis zu 10 Mikroliter Streptavidin in sterilem PBS in den Kanal, der an die Biotingruppen des BSA-Biotins bindet. Als nächstes injizieren Sie bis zu 10 Mikroliter Waschmittellösung, um überschüssiges Streptavidin wegzuwaschen. Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie entweder VWF in Casein-Lösung oder Lambda-DNA.Inkubieren Sie VWF für drei Minuten oder Lambda-DNA für 45 Minuten. Dann injizieren Sie fünf Millimolar freies Biotin, um die überschüssigen Streptavidin-Bindungsstellen zu blockieren. Einen Milliliter Casein-Blockierlösung in eine Spritze geben und in einer Spritzenpumpe sichern.Befestigen Sie dann ein Ende des Schlauches an der Spritzennadel und fließen Sie in die Lösung, um Luftblasen zu entfernen. Etwa drei Minuten nach der kostenlosen Biotin-Injektion das andere Ende des Rohres am Einlass des mikrofluidischen Geräts befestigen. Wählen Sie das höchste Vergrößerungsziel des TIRF- oder konfokalen Fluoreszenzmikroskops aus.Fügen Sie bei Bedarf einen Tropfen Tauchöl auf das Ziel. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf die Mikroskopstufe, so dass der Deckelschlupf bündig mit dem Objektiv ist. Starten Sie die Hellfeldmikroskopie und passen Sie den Fokus so an, dass Features wie Schmutz und Blasen sichtbar sind.Passen Sie dann die Bühne in X- und Y-Richtung an, bis der Rand des mikrofluidischen Kanals sichtbar ist und den Rahmen zerschneidet. Wechseln Sie zum FITC-Kanal und passen Sie den Z-Pegel und den TIRF-Winkel nach Bedarf an, bis die einzelnen grünen Kugelmoleküle unterschieden werden können. Passen Sie die Laserintensität und Belichtungszeit an, um fluoreszierende Moleküle zu visualisieren, ohne sie zu schnell zu photobleicht zu machen.Passen Sie dann den Kontrast an, um die Moleküle besser zu visualisieren. Genau fünf Minuten nach der kostenlosen Biotin-Injektion starten und stoppen Sie den Fluss aus der Spritzenpumpe, um die Veränderungen der molekularen Konformation mit Durchflussraten zwischen 5000 und 30.000 Mikroliter pro Stunde zu beobachten. Bei VWF ist es wichtig, mindestens eine kleine Menge Anfluss anzuwenden, wie 30 Sekunden 10.000 Mikroliter pro Stunde Genau fünf Minuten nach der kostenlosen Biotininjektion.Wiederholen Sie dies in verschiedenen Bereichen des mikrofluidischen Geräts und lokalisieren Sie Moleküle, die sich bei mehreren Zyklen des Startens und Stoppens des Durchflusses ausdehnen und entspannen können. Beachten Sie, wie lange es dauert, bis Moleküle die maximale Ausdehnung erreichen und die Entspannung vollständig abschließen und Videos des kontinuierlichen Verhaltens von Molekülen unter Scherfluss aufzeichnen. Die Flexibilität eines Moleküls, die Bestätigung zu ändern, wird oft durch seine Fähigkeit zur Verlängerung demonstriert, da höhere Scherraten aufgrund des zunehmenden Durchflusses angewendet werden.Die Verlängerung stolieren der Scherrate eines von Willebrand-Faktormoleküls ist nützlich, um die biomechanischen Eigenschaften des Proteins zu charakterisieren. Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Lambda-DNA zeigen in ähnlicher Weise eine erhöhte Ausdehnung bei höheren Scherraten bei 30 Sekunden und eine allmähliche Entspannung über zwei Minuten nach dem Anhalten des Durchflusses. Wenn Sie mit VWF arbeiten, denken Sie daran, es nur für drei Minuten zu inkubieren und Biotin für fünf Minuten vor dem Start des Flusses freizugeben.Dies ist entscheidend für die Bildung der optimalen Anzahl oder Biotin-Streptavidin-Verbindungen, die für das reversible Entwirren benötigt werden. Diese Methode kann angepasst werden, um Echtzeit-Wechselwirkungen zwischen mehreren Biomolekülen zu visualisieren und ihre Funktionen zu charakterisieren. Zum Beispiel könnte man die Thrombozytensteckerbildung besser verstehen, indem man VWF visualisiert, das sich unter hoher Schere entwirrt und seine Bindung mit dem Thrombozytenadhäsionsmolekül GPIb-alpha mit dieser Methode.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Forschung

Biotechnik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...