Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע מענק DMS-1463234, המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL082808 ו AI133634, ואת Lehigh באוניברסיטת מימון פנימי.

1. הכנת VWF
<ol><li>מהווים מחדש את VWF פלזמה האדם כדי להכין אותו לתגובות תיוג. הוסף 100 μL של מים מוהים (DI) כדי 100 μg של VWF ה, והוא ליצור 1 mg/mL פתרון מניות VWF.</li>
	<li>Dialyze VWF פתרון מניות על מנת להסיר גליצין עודף, ובכך להגדיל את היעילות ביוטין ו fluorophore.<ol>
<li>העברת 50 μL של פתרון מניות VWF לתוך יחידת דיאליזה של 0.1 mL עם...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה של מולקולה בודדת שינויים באמצעות מיקרוסקופ הזריחה כפי שמתואר בשיטה זו, זה קריטי כדי לסקול את המולקולה למשך הזמן המתאים, למזער את האינטראקציות הלא ספציפיות שלה עם פני השטח ולבסס הגדרות מיקרוסקופ הפחתת הלבנת התמונות. היכולת של המולקולה לשנות באופן חופשי את הקש...

מנגנונים של כמה biomolecules להגיב לגירויים סביבתיים נחקרו רבות. בסביבת זרימה בפרט, הטיה והכוחות הelongational מווסת את השינויים המומסבותית והעלולים לתפקד כbiomolecules. דוגמאות טיפוסיות כוללות להטות המושרה לאחר למבדה DNA ו פון Willebrand פקטור (VWF). DNA למדא שימש כלי כדי להבין את הדינמיקה של הפרט, שרשראות פולימר גמיש ו rheology של פתרונות פולימריים1,2,3,4. VWF הוא חיישן זרימה טבעי כי אגרגטים טסיות באתרי הפצע של כלי הדם עם שיעורי גזירה חריגים דפוסי זרימה. להתיר של VWF חיוני בהפעלת האיגוד של טסיות לתחום A1 וכריכת קולגן לתחום A3. בנוסף, גבוהה המושרה להטות את התחום A2 התגלגלות מאפשר את המחשוף של vwf, אשר מווסת את התפלגות המשקל המולקולרי שלה במחזור5,6. כך, הדמיה ישירה של איך אלה מולקולות להתנהג תחת זרימה יכול לשפר מאוד את ההבנה הבסיסית של הביומכניקה שלהם ותפקוד, אשר בתורו יכול לאפשר אבחון הרומן ויישומים טיפוליים.
מתודולוגיות טיפוסיות לאפיון הקונמציות חד-מולקולות כוללות פינצטה אופטית/מגנטית, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומולקולה חד-שגרתית של העברת אנרגיית תהודה (סריג)7. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הכוח ואת התנועה הקשורים השינויים הקונפורבית של biomolecules. עם זאת, היא חסרה את היכולת למפות הקונמציות מולקולריות הכולל8. Afm מסוגל הדמיה עם רזולוציה מרחבית גבוהה אבל הוא מוגבל ברזולוציה הטמפורלית9,10. בנוסף, קשר בין העצה לבין המדגם עשוי לבלבל את התגובה הנגרמת על ידי זרימה. שיטות אחרות כמו nanopore וניתוחים לקבוע קיפול חלבון יחיד מולקולה ומדינות התפתחות מבוסס על זיהוי של מרחק מולקולרי מתוך וכולל כמויות. עם זאת, שיטות אלה עדיין בחיתוליו ומוגבלות בהתבוננות ישירה של קונמציות בודדות של מולקולה אחת11,12,13,14.
מצד שני, התבוננות ישירה בקרו באמצעות הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית תחת מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית השתפרה בהבנת הדינמיקה של מולקולה בודדת בתהליכים ביולוגיים רבים15,16. לדוגמה, פו et al. לאחרונה השיגה ויזואליזציה סימולטני של התארכות VWF ומחייב קולטן טסיות בפעם הראשונה. בעבודתם, מולקולות VWF היו מנוכי על פני השטח של ערוץ microflu, באמצעות האינטראקציות biotin-streptavidin והתמונה תחת סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (TIRF) בסביבות משתנות זרימת הטיה17. החלת שיטה דומה כמו פו של, אנחנו כאן להפגין כי קונמציות של VWF ו-DNA למדא ניתן לראות ישירות תחת השני TIRF ו-מיקרוסקופ הקונטמוקד. בדומה למוצג באיור 1, התקנים מיקרופלואידים משמשים ליצירה ולבקרה של זרימת הטיה, וbiomolecules מנודים על פני הערוץ. עם היישום של שיעורי גזירה שונים, תצורות של מולקולה זהה נרשמות למדוד את אורך ההארכה, המוצג גם באיור 1. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לחקור התנהגויות פולימר אחרות מתחת לסביבות זרימה מורכבות עבור מחקרים מרטילוגיים וביולוגיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

התנהגות מולקולה בודדת תחת הפרטורציה מכנית התאפיין באופן נרחב בהבנת תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, שיטות כגון מיקרוסקופ של כוח אטומי יש ברזולוציה מוגבלת בזמן, בעוד Förster העברת אנרגיה (לדאוג) רק לאפשר את התצורות להיות משתמעת. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, מאפשר בזמן אמת הדמיה באתרו של מולקולות יחיד בתנאי זרימה שונים. הפרוטוקול שלנו מתאר את השלבים ללכידת שינויים בbiomolecules בודדים תחת סביבות זרימת הטיה שונות באמצעות מיקרוסקופ קרינה. זרימת ההטיה נוצרת בתוך ערוצי microflu, ונשלטת על ידי משאבת מזרק. כמו הפגנות של השיטה, וון וילבלאנד מקדם (vwf) ו-DNA למדא מתויגים עם ביוטין ו fluorophore ולאחר מכן לקיבוע על פני הערוץ. הקונמציות שלהם מנוטרים ברציפות באמצעות הטיה משתנה באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) ומיקרוסקופ מיקרומוקד. הדינמיקה להתיר הפיך של VWF הם שימושיים להבנת כיצד תפקידה מוסדר בדם האדם, תוך היווצרות של DNA למדא מציע תובנות לביופיזיקה של קרו. הפרוטוקול יכול גם להיות מיושם באופן נרחב כדי ללמוד את ההתנהגות של פולימרים, במיוחד biopolymers, בתנאי זרימה שונים לחקור rheology של נוזלים מורכבים.

צפייה בהתנהגות הדינמית של biomolecules כגון VWF ו-DNA למדא הוא תלוי מאוד במיטוב הכריכה שלהם למשטח המכשיר. הטיפול במשטח המים המומלץ במכשיר המיקרו-פלואידיג חיוני להשגת מחייב עם כמה נקודות מעגן, כך שמולקולות יכולות להאריך ולהירגע על הזרימה המשתנה. אם החלבונים או הדנ א מאוגדים חזק מדי עם קישורים מרובי?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

אנו מציגים פרוטוקול לשתק קרו יחיד במכשירים מיקרופלואידים וכביכמת שינויים בקונמציות שלהם תחת זרימת הטיה. פרוטוקול זה שימושי לאפיון המאפיינים הביומכאני והפונקציונלי של biomolecules כגון חלבונים ו-DNA בסביבת זרימה.

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

כימות השינויים הקונפורמיים במולקולות ביולוגיות בודדות תחת זרימת הגזיר שימושי להבנת התפקוד והביופיזיקה של מקרומולקולות כמו חלבון ו- DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה בזמן אמת של מולקולות בודדות בסביבות זרימה פיזיולוגיות ברזולוציה זמנית ומזרית גבוהה. זה ללא תחרות על ידי טכניקות אחרות כמו AFM.על ידי אפיון כוח ההטיה שתחתיו חלבונים ה-DNA שלנו יש שינויים קונפורמיים גלובליים, אפשר לעצב טוב יותר תרופות המחקות תכונות ביופיזיות אלה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי ללמוד את ההתנהגות או פולימרים אחרים, במיוחד פולימרים ביולוגיים, בתנאי זרימה משתנים ולחקור את הריאולוגיה של נוזלים מורכבים. עיתוי הצעדים הוא קריטי להצלחה.אנו ממליצים לתרגל את הטיפול משטח המכשיר microfluidic ומיקרוסקופיה פלואורסצנטי צעדים פעמים רבות כדי לבצע אותם בצורה יעילה. לכידת שינויים קונפורמיים בביומולקולים היא תופעה ויזואלית ודינמית התבהר בצורה הטובה ביותר על הסרט. מדענים יבינו טוב יותר שיטה זו לאחר שראו את החלבון בזמן אמת ומיקרוסקופיה DNA המוצגים בסרטון זה.כדי להכין את המכשיר microfluidic, להוסיף חמישה חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון לחלק אחד ריפוי סוכן בסירת שקילה. ומערבבים את התוכן ביסודיות במשך דקה אחת כדי ליצור פתרון PDMS נרפא מראש. מניחים את רקיק הסיליקון הראשי בצלחת פטרי מפלסטיק ויוצקים את תטגם PDMS על הוופל כדי ליצור שכבה של חמישה מילימטרים.מכסים את המנה ומשאירים אותה בשובע תחת ואקום למשך שעה כדי להסיר בועות אוויר. ואז להדק את צלחת פטרי מכוסה ב 60 מעלות צלזיוס לילה כדי לרפא את PDMS לתוך מוצק גמיש, אשר יגרום ערוצים microfluidic להיות מעוצב לתוך PDMS בממשק רקיק PDMS. ביום שלמחרת, השתמש בתער כדי לחתוך 20 על ידי 10 מלבנים מילימטר סביב כל ערוץ microfluidic ב PDMS ולהסיר את בלוקים מלבניים עם פינצטה.השתמש מחט קצה קהה 25-מד עם קצוות מחודדים כדי לחבוט חור בקוטר 0.5 מילימטר בקצה אחד של התעלה, לוודא כי החור עובר לחלוטין דרך בלוק PDMS. השתמש במחט דקה כדי לחבוט PDMS מתוך החור ולחזור על התהליך בקצה השני של הערוץ. מניחים את בלוק PDMS עם צד הערוץ למעלה ואת כיסוי לתוך התא של מכונת מליטה פלזמה ולהתחיל את הטיפול.לאחר השלמת הטיפול, מקם במהירות את בלוק ה- PDMS על קו כיסוי כך שהתעלה נמצאת במגע עם הפתק. החל לחץ על הקצוות של הבלוק, ולאחר מכן למקם את הרכבה PDMS coverslip על צלחת חמה ב 115 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לחזק את הקשר הקבוע. לבסוף, הכנס אורך של 10 ס"מ.צינור בקוטר פנימי של 0.25 מילימטר לתוך חור השקע בחלק העליון של בלוק PDMS כדי לאפשר לנוזל לזרום בקלות מהתעלה. עבור גורם פון וילברנד או ניסויים VWF להזריק עד 10 microliters של 10 מיקרוגרם למיליליטר BSA-ביוטין מומס PBS סטרילי 1X לתוך התוך של המכשיר microfluidic. לעכב כמה microliters של BSA-ביוטין בקצה פיפטה לאחר ההזרקה ולאפשר את הקצה להישאר מוטבע במבונית.אפשר BSA-ביוטין דגירה במכשיר במשך שעתיים אשר יגרום BSA לא מחייב במיוחד על פני השטח coverslip. לאחר מכן להסיר את קצה פיפטה ולהזריק עד 10 microliters של פתרון חסימת קסטין לתוך הערוץ. אפשר לפתרון קסטין דגירה במשך 30 דקות, כך שהוא יכול לחסום את כל האתרים בחינם ולהפחית מחייב לא ספציפי של biomolecules על פני השטח.הסר את הקצה ולהזריק עד 10 microliters של סטרפטבידין PBS סטרילי לתוך הערוץ, אשר ייקשר לקבוצות ביוטין של BSA-ביוטין. לאחר מכן, להזריק עד 10 microliters של פתרון דטרגנט לשטוף את סטרפטבידין עודף. הסר את הקצה ולהזריק גם VWF בתספורת קסטין או DNA lambda.דגירה VWF במשך שלוש דקות או DNA lambda במשך 45 דקות. ואז להזריק חמישה ביוטין חינם מילימולר כדי לחסום את אתרי קשירה סטרפטבידין עודף. לטעון מיליליטר אחד של פתרון חסימת קמין לתוך מזרק ולאבטח אותו במשאבת מזרק.לאחר מכן לצרף קצה אחד של צינורות המחט מזרק לזרום בתסרון כדי להסיר בועות אוויר. כשלוש דקות לאחר הזרקת ביוטין חינם לחבר את הקצה השני של הצינור לתוך ההתקן microfluidic. בחר את מטרת ההגדלה הגבוהה ביותר של המיקרוסקופ TIRF או הפלואורסצנטיות הקונפוקנטית.במידת הצורך, מוסיפים טיפת שמן טבילה על המטרה. מניחים את המכשיר microfluidic על שלב המיקרוסקופ, כך coverslip הוא סומק עם המטרה. התחל מיקרוסקופיה של שדה בהיר והתאם את המוקד כך שתכונות כגון פסולת ובועות יהיו גלויות.לאחר מכן התאימו את הבמה בכיווני X ו-Y עד שקצה הערוץ המיקרופלואידי יהיה גלוי וחצה את המסגרת. עברו לערוץ FITC והתאימו את רמת Z ואת זווית TIRF לפי הצורך עד שניתן יהיה להבדיל בין המולקולות הירוקות הבודדות. התאימו את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה כדי לדמיין מולקולות פלואורסצנטיות מבלי לצלם אותן מהר מדי.ואז להתאים את הניגוד כדי לדמיין טוב יותר את המולקולות. בדיוק חמש דקות לאחר הזרקת ביוטין חינם להתחיל לעצור את הזרימה ממשאבת המזרק כדי לבחון את השינויים קונפורמציה מולקולרית באמצעות שיעורי זרימה בין 5000 ו 30, 000 microliters לשעה. עם VWF זה קריטי ליישם לפחות כמות קטנה של זרימה, כגון 30 שניות של 10, 000 מיקרוליטר לשעה לזרום בדיוק חמש דקות לאחר הזרקת ביוטין חינם.חזור על זה לאורך אזורים שונים של המכשיר microfluidic ולאתר מולקולות שיכולות להרחיב ולהירגע על מחזורים מרובים של התחלה ועצירת זרימה. שים לב כמה זמן לוקח למולקולות להגיע להארכה מקסימלית ולהשלים הרפיה ולהקליט קטעי וידאו של התנהגות רציפה של מולקולות תחת זרימת הגזלה. הגמישות של מולקולה לשנות אישור מוכחת לעתים קרובות על ידי יכולתו להתארך ככל ששיעורי הטיה גבוהים יותר מוחלים עקב זרימה גוברת.ההרחבה לעומת עקומת קצב ההטיה של מולקולת גורם פון וילברנד שימושית לאפיון המאפיינים הביומכניים של החלבון. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של דנ"א למדה מראות גם הארכה מוגברת בשיעורי גימה גבוהים יותר ב-30 שניות ורגיעה הדרגתית במשך שתי דקות לאחר שהזרימה נעצרת. כאשר עובדים עם VWF, זכור להחגירה זה רק במשך שלוש דקות ביוטין חינם במשך חמש דקות לפני תחילת הזרימה.זה קריטי לצורת המספר האופטימלי או הקישורים ביוטין סטרפטוודין הדרושים לחשיפה הפיכה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לדמיין אינטראקציות בזמן אמת בין ביומולקולים מרובים ולאפיין את הפונקציות שלהם. לדוגמה, אפשר להבין טוב יותר היווצרות תקע טסיות דם על ידי הדמיה VWF נפרם תחת גזיר גבוה ואת הכריכה שלה עם מולקולת הידבקות טסיות GPIb-אלפא בשיטה זו.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...