Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della National Science Foundation DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 e AI133634, e finanziamenti interni della Lehigh University.

1. Preparazione di VWF
<ol><li>Ricostituire il VWF plasma umano per prepararlo alle reazioni di etichettatura. Aggiungete 100 l'l di acqua deionizzata (DI) a 100 g di VWF liofilizzato per creare una soluzione di stock da 1 mg/mL VWF.</li>
	<li>Dialyze Soluzione di stock VWF al fine di rimuovere l'eccesso di glicina, aumentando così l'efficienza di etichettatura della biotina e del fluoroforo.<ol>
<li>Trasferire 50 l di VWF in un'unità di dialisi da 0,1 ml con un taglio e guarnizione di peso molecolare di 10.000 unit?...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Per ottenere dati di alta qualità dei cambiamenti conformazionali a singola molecola utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in questo metodo, è fondamentale incubare la molecola per la quantità di tempo appropriato, ridurre al minimo le sue interazioni non specifiche con la superficie e definire le impostazioni del microscopio che riducono il fotosbiancamento. La capacità della molecola di cambiare liberamente la conformazione è correlata al numero di interazioni biotina-streptavidina formate tra l...

Sono stati ampiamente studiati i meccanismi di risposta alle biomolecole agli stimoli ambientali. In un ambiente di flusso in particolare, le forze di taglio e di allungamento regolano i cambiamenti conformazionali e potenzialmente la funzione delle biomolecole. Esempi tipici includono lo srotolamento indotto dalla cesoia del DNA lambda e il fattore von Willebrand (VWF). Il DNA Lambda è stato utilizzato come strumento per comprendere le dinamiche conformazionali delle singole catene polimeriche flessibili e la reologia delle soluzioni polimeriche1,2,3,4. VWF è un sensore di flusso naturale che aggrega le piastrine nei siti ferita dei vasi sanguigni con tassi di taglio anomali e modelli di flusso. Lo srotolamento di VWF è essenziale per attivare l'associazione delle piastrine al dominio A1 e il binding del collagene al dominio A3. Inoltre, l'elevata diffusione del dominio A2 indotto dalla cesoia consente la scissione di VWF, che regola la sua distribuzione del peso molecolare in circolazione5,6. Pertanto, la visualizzazione diretta di come queste molecole si comportano sotto il flusso può migliorare notevolmente la nostra comprensione fondamentale della loro biomeccanica e funzione, che a sua volta può consentire nuove applicazioni diagnostiche e terapeutiche.
Le metodologie tipiche per caratterizzare le conformazioni a singola molecola includono pinzette ottiche/magnetiche, microscopia a forza atomica (AFM) e trasferimento di energia a risonanza di rete (FRET)7a singola molecola. La spettroscopia a forza singola è un potente strumento per studiare la forza e il movimento associati ai cambiamenti conformazionali delle biomolecole. Tuttavia, manca la capacità di mappare le conformazioni molecolari complessive8. AFM è in grado di imaging ad alta risoluzione spaziale, ma è limitato nella risoluzione temporale9,10. Inoltre, il contatto tra la punta e il campione può confondere la risposta indotta dal flusso. Altri metodi come FRET e nanoporanalytics determinano gli stati di ripiegamento e dispiegamento delle proteine a singola molecola in base al rilevamento della distanza intramolecolare e dei volumi esclusi. Tuttavia, questi metodi sono ancora nella loro infanzia e limitati nella loro osservazione diretta di conformazioni a singola molecola11,12,13,14.
D'altra parte, osservare direttamente le macromolecole ad alta risoluzione temporale e spaziale nell'ambito della microscopia a fluorescenza ha migliorato la nostra comprensione della dinamica a singola molecola in molti processi biologici15,16. Ad esempio, Fu et al. ha recentemente raggiunto la visualizzazione simultanea dell'allungamento del VWF e del legame del recettore delle piastrine per la prima volta. Nel loro lavoro, le molecole VWF sono state immobilizzate sulla superficie di un canale microfluidico attraverso interazioni biotina-streptavidine e immagini sotto microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) in diversi ambienti di flusso di taglio17. Applicando un metodo simile a quello di Fu, qui dimostriamo che le conformazioni del VWF e del DNA lambda possono essere osservate direttamente sia nella microscopia TIRF che confocale a fluorescenza. Come illustrato nella Figura 1,i dispositivi microfluidici vengono utilizzati per creare e controllare il flusso di taglio e le biomolecole vengono immobilizzate sulla superficie del canale. Al momento dell'applicazione di tassi di taglio variabili, le conformazioni della stessa molecola vengono registrate per misurare la lunghezza dell'estensione, mostrata anche nella Figura 1. Il metodo potrebbe essere ampiamente applicato per esplorare altri comportamenti polimerici in ambienti di flusso complessi per studi reologici e biologici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Il comportamento di una singola molecola in perturbazione meccanica è stato ampiamente caratterizzato per comprendere molti processi biologici. Tuttavia, metodi come la microscopia a forza atomica hanno una risoluzione temporale limitata, mentre il trasferimento di energia a risonanza del Fàrster (FRET) consente solo di dedurre le conformazioni. La microscopia a fluorescenza, d'altra parte, consente la visualizzazione in tempo reale in situ di singole molecole in varie condizioni di flusso. Il nostro protocollo descrive i passaggi per catturare i cambiamenti conformazionali di singole biomolecole in diversi ambienti di flusso di taglio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il flusso di taglio viene creato all'interno di canali microfluidici e controllato da una pompa di siringa. Come dimostrazioni del metodo, il fattore von Willebrand (VWF) e il DNA lambda sono etichettati con biotina e fluoroforo e quindi immobilizzati sulla superficie del canale. Le loro conformazioni sono continuamente monitorate sotto flusso di taglio variabile utilizzando la riflessione interna totale (TIRF) e la microscopia a fluorescenza confocale. Le dinamiche reversibili di svelamento di VWF sono utili per comprendere come la sua funzione è regolata nel sangue umano, mentre la conformazione del DNA lambda offre approfondimenti sulla biofisica delle macromolecole. Il protocollo può anche essere ampiamente applicato per studiare il comportamento dei polimeri, in particolare dei biopolimeri, in condizioni di flusso variabili e per studiare la reologia dei fluidi complessi.

Osservare il comportamento dinamico di biomolecole come VWF e DNA lambda dipende fortemente dall'ottimizzazione del loro legame alla superficie del dispositivo. L'incubazione di trattamenti superficiali per i tempi raccomandati nel dispositivo microfluidico è fondamentale per ottenere il legame con alcuni punti di ancoraggio, in modo che le molecole possano estendere liberamente e rilassarsi al momento del flusso mutevole. Se le proteine o il DNA sono legati troppo fortemente con più collegamenti, si estenderanno a lun...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Presentiamo un protocollo per l'immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Quantificare i cambiamenti conformazionali nelle singole biomolecole sotto flusso di taglio è utile per comprendere la funzione e la biofisica delle macromolecole come proteine e DNA. La microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione in situ in tempo reale di singole molecole in ambienti di flusso fisiologico ad alta risoluzione temporale e spaziale. Questo non ha eguali con altre tecniche come AFM.Caratterizzando la forza di taglio sotto la quale le proteine il nostro DNA ha cambiamenti conformazionali globali, si possono progettare meglio farmaci che imitano queste proprietà biofisiche. Questo protocollo può essere ampiamente applicato per studiare il comportamento o altri polimeri, specialmente bio polimeri, in condizioni di flusso variabili e per indagare la reologia di fluidi complessi. La tempistica dei passaggi è fondamentale per il successo.Ti consigliamo di praticare più volte il trattamento superficiale del dispositivo microfluidico e i passaggi di microscopia a fluorescenza per eseguirli in modo efficiente. Catturare cambiamenti conformazionali nelle biomolecole è un fenomeno visivo e dinamico meglio visto sulla pellicola. Gli scienziati comprenderanno meglio questo metodo dopo aver visto la microscopia a base di proteine e DNA in tempo reale presentata in questo video.Per preparare il dispositivo microfluidico, aggiungere cinque parti di base in elastomero siliconico a un agente polimerizzante di una parte in una barca di pesatura. e mescolare accuratamente il contenuto per un minuto per creare una soluzione PDMS pre-curata. Posizionare il wafer di silicio principale in una piastra di Petri di plastica e versare la soluzione PDMS sul wafer per creare uno strato di cinque millimetri.Coprire il piatto e lasciarlo in un essiccatore sotto vuoto per un'ora per rimuovere le bolle d'aria. Quindi incubare la piastra di Petri coperta a 60 gradi Celsius durante la notte per curare il PDMS in un solido flessibile, che si tradurrà in canali microfluidici modellati nel PDMS all'interfaccia del wafer PDMS. Il giorno successivo, utilizzare un rasoio per tagliare rettangoli di 20 per 10 millimetri intorno a ciascun canale microfluidico nel PDMS e rimuovere i blocchi rettangolari con una pinzetta.Utilizzare un ago con estremità smussata calibro 25 con bordi affilati per perforare un foro di diametro di 0,5 millimetri ad un'estremità del canale, assicurandosi che il foro attraversa completamente il blocco PDMS. Utilizzare un ago sottile per perforare il PDMS dal foro e ripetere il processo all'altra estremità del canale. Posizionare il blocco PDMS con il lato del canale verso l'alto e il coverslip nella camera di una macchina di incollaggio al plasma e avviare il trattamento.Al termine del trattamento, posizionare rapidamente il blocco PDMS su un coverslip in modo che il canale sia in contatto con lo scivolo. Applicare pressione sui bordi del blocco, quindi posizionare l'assieme PDMS coverslip su una piastra calda a 115 gradi Celsius per 15 minuti per rinforzare il legame permanente. Infine, inserire un 10 centimetri di lunghezza.Tubo di diametro interno di 0,25 millimetri nel foro di uscita nella parte superiore del blocco PDMS per consentire al fluido di fluire facilmente fuori dal canale. Per gli esperimenti von Willebrand factor o VWF iniettare fino a 10 microlitri da 10 microgrammi per millilitro BSA-Biotina sciolti in 1X PBS sterile nell'ingresso del dispositivo microfluidico. Trattenere alcuni microlitri di BSA-Biotina nella punta della pipetta dopo l'iniezione e lasciare che la punta rimanga incorporata nell'ingresso.Consentire alla BSA-Biotina di incubare nel dispositivo per due ore, il che si tradurrà in BSA non specificamente legante alla superficie del coverslip. Quindi rimuovere la punta della pipetta e iniettare fino a 10 microlitri di soluzione di blocco della caseina nel canale. Lasciare incubare la soluzione di caseina per 30 minuti in modo che possa bloccare eventuali siti liberi e ridurre il legame non specifico delle biomolecole alla superficie.Rimuovere la punta e iniettare fino a 10 microlitri di streptavidina in PBS sterile nel canale, che si legherà ai gruppi di biotina della BSA-Biotina. Successivamente, iniettare fino a 10 microlitri di soluzione detergente per lavare via la streptavidina in eccesso. Rimuovere la punta e iniettare VWF in soluzione di caseina o DNA lambda.Incubare VWF per tre minuti o DNA lambda per 45 minuti. Quindi iniettare cinque biotina senza millimolare per bloccare i siti di legame di streptavidina in eccesso. Caricare un millilitro di soluzione di blocco della caseina in una siringa e fissarlo in una pompa per siringhe.Quindi attaccare un'estremità del tubo all'ago della siringa e scorrere nella soluzione per rimuovere le bolle d'aria. Circa tre minuti dopo l'iniezione libera di biotina attaccare l'altra estremità del tubo all'ingresso del dispositivo microfluidico. Selezionare l'obiettivo di ingrandimento più alto del TIRF o del microscopio a fluorescenza confocale.Se necessario, aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo. Posizionare il dispositivo microfluidico sullo stadio del microscopio in modo che il coverslip sia a filo con l'obiettivo. Avviare la microscopia a campo luminoso e regolare la messa a fuoco in modo che funzioni come detriti e bolle siano visibili.Quindi regolare lo stadio nelle direzioni X e Y fino a quando il bordo del canale microfluidico è visibile e divide in due il fotogramma. Passare al canale FITC e regolare il livello Z e l'angolo TIRF in base alle esigenze fino a distinguere le singole molecole globulari verdi. Regola l'intensità del laser e il tempo di esposizione per visualizzare le molecole fluorescenti senza fotolicenza troppo rapidamente.Quindi regolare il contrasto per visualizzare meglio le molecole. Esattamente cinque minuti dopo l'iniezione gratuita di biotina, avviare e interrompere il flusso dalla pompa della siringa per osservare i cambiamenti nella conformazione molecolare utilizzando portate tra 5000 e 30.000 microlitri all'ora. Con VWF è fondamentale applicare almeno una piccola quantità di flusso, come 30 secondi di flusso di 10.000 microliter all'ora esattamente cinque minuti dopo l'iniezione di biotina libera.Ripeti questo in varie aree del dispositivo microfluidico e individua molecole che possono estendersi e rilassarsi su più cicli di avvio e arresto del flusso. Si noti quanto tempo ci vuole perché le molecole raggiungano la massima estensione e completa rilassamento e registrino video del comportamento continuo delle molecole sotto flusso di taglio. La flessibilità di una molecola per cambiare la conferma è spesso dimostrata dalla sua capacità di allungarsi man mano che vengono applicate velocità di taglio più elevate a causa dell'aumento del flusso.La curva di estensione rispetto alla velocità di taglio di una molecola del fattore di von Willebrand è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche della proteina. Analogamente, le immagini di microscopia a fluorescenza del DNA lambda mostrano un aumento dell'estensione a tassi di taglio più elevati a 30 secondi e un rilassamento graduale oltre due minuti dopo l'arresto del flusso. Quando si lavora con VWF, ricordarsi di incubarlo solo per tre minuti e biotina libera per cinque minuti prima di iniziare il flusso.Questo è fondamentale per formare il numero ottimale o i collegamenti biotina-streptavidina necessari per lo svelamento reversibile. Questo metodo può essere adattato per visualizzare le interazioni in tempo reale tra più biomolecole e caratterizzare le loro funzioni. Ad esempio, si potrebbe comprendere meglio la formazione della spina piastrinica visualizzando il VWF che si dipana sotto taglio elevato e il suo legame con la molecola di adesione piastrinica GPIb-alpha con questo metodo.

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...