Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
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この研究は、国立科学財団助成金DMS-1463234、国立衛生研究所助成金HL082808とAI133634、リーハイ大学の内部資金によって部分的にサポートされました。

1. VWF の準備
<ol><li>ヒトプラズマVWFを再構成し、標識反応のためにそれを調製する。100 μLの脱イオン(DI)水を100μgの凍結乾燥VWFに加え、1mg/mL VWFストック溶液を作成します。</li>
	<li>ダイアレーズVWFストック溶液は、過剰グリシンを除去するために、ビオチンおよびフルオロフォア標識効率を高める。<ol>
<li>VWFストック液50μLを0.1mL透析ユニットに移し、10,000個の分子量カットオフを行い、キャ?...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

この方法で説明したように蛍光顕微鏡を用いて単分子の立体構造変化の高品質なデータを得るためには、適切な時間のために分子をインキュベートし、表面との非特異的相互作用を最小限に抑えることが重要であるそして、フォトブリーチを減らす顕微鏡の設定を確立します。この分子が自由に立体構造を変化させる能力は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジン相互作...

生体分子が環境刺激にどう反応するかのメカニズムが広く研究されている。特に流れ環境では、せん断と伸びの力が、立体構造の変化を調節し、生体分子の機能を制御する可能性があります。代表的な例としては、ラムダDNAおよびフォン・ヴィルブランド因子(VWF)の剪断誘発解明が挙げられる。ラムダDNAは、個々の、柔軟なポリマー鎖の構造ダイナミクスとポリマー溶液1、2、3、4の流動を理解するためのツールとして使用されている。VWFは異常な剪断速度および流れのパターンの血管の傷ついた場所で血小板を凝集する自然な流れセンサーである。VWFの解明は、A1ドメインへの血小板の結合とA3ドメインへのコラーゲン結合を活性化するために不可欠である。さらに、高剪断誘導A2ドメイン展開は、循環中の分子量分布を調節するVWFの切断を可能にする5、6。したがって、これらの分子が流動下でどのように振る舞うかを直接視覚化することで、バイオメカニクスと機能に関する基本的な理解が大幅に高まり、新しい診断および治療用途が可能になります。
単一分子の立体構造を特徴付ける一般的な方法論には、光/磁気ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)および単分子フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)7が含まれる。単一分子力分光法は生体分子の立体構造変化に伴う力と運動を調べる強力なツールです。しかし、それは全体的な分子構造8をマッピングする能力を欠いている。AFMは、高い空間分解能でイメージングが可能であるが、時間分解能9、10に制限されている。また、先端と試料との接触は、流れによって誘導される応答を混乱させる可能性がある。FRETやナノポア分析のような他の方法は、分子内距離と除外された体積の検出に基づいて、単一分子タンパク質の折りたたみおよび展開状態を決定します。しかし、これらの方法は、まだ初期段階にあり、単一分子立体構造11、12、13、14の直接観察において制限されている。
一方、蛍光顕微鏡下で高い時間的および空間的分解能を有する高い時間的および空間的な高分子を直接観察することは、多くの生物学的プロセスにおける単一分子ダイナミクスの理解を改善した15,16。例えば、Fuら最近、初めてVWF伸長と血小板受容体結合の同時可視化を達成した。その研究では、VWF分子をビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して微小流体チャネルの表面に固定化し、様々な剪断流環境で全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡下で画像化した17。Fuと同様の方法を用いて、ここでは、VWFとラムダDNAの立体構造をTIRFと共焦点蛍光顕微鏡の両方で直接観察できることを実証します。図1に示すように、マイクロ流体デバイスを使用してせん断流を作成および制御し、生体分子をチャネル表面に固定化します。せん断速度の変化を適用すると、同じ分子の立体構造が記録され、伸長長を測定し、図1にも示される。この方法は、レオロジー研究と生物学的研究の両方のために複雑な流れの環境下で他のポリマー挙動を探求するために広く適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

機械的摂動下における単一分子挙動は、多くの生物学的プロセスを理解することが広く特徴付けられている。しかし、原子間力顕微鏡法は時間分解能が限られているのに対し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は立体構造の推測しか認めることができない。一方、蛍光顕微鏡法は、様々な流れ条件下での単一分子のリアルタイム可視化を可能にする。我々のプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて異なる剪断流環境下で単一の生体分子の立体構造変化を捉えるステップを記述する。剪断流はマイクロ流体チャネルの内部に作成され、シリンジポンプによって制御される。この方法のデモンストレーションとして、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)とラムダDNAをビオチンとフルオロフォアで標識し、チャネル表面に固定化する。それらの立体構造は、全内部反射(TIRF)および共焦点蛍光顕微鏡を用いて可変剪断流下で連続的にモニタリングされる。VWFの可逆的な解明ダイナミクスは、その機能がヒト血液中でどのように調節されているかを理解するのに役立ちますが、ラムダDNAの立体構造は高分子の生物物理学に関する洞察を提供します。プロトコルはまた、様々な流れの条件でポリマー、特に生体高分子の挙動を研究し、複雑な流体の流動を調査するために広く適用することができる。

VWFやラムダDNAなどの生体分子の動的挙動を観察することは、デバイス表面への結合を最適化することに大きく依存しています。マイクロ流体デバイスの推奨時間に対する表面処理のインキュベートは、いくつかのアンカレッジポイントとの結合を得るために重要であり、分子が流れの変化に伴って自由に伸びてリラックスできるようにします。タンパク質またはDNAが複数のリンケージと強く?...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

せん断流下の単一生体分子の立体構造変化を定量化することは、タンパク質やDNAのような高分子の機能や生物物理学を理解するのに役立ちます。蛍光顕微鏡は、高い時間的および空間分解能を有する生理的な流れ環境における単一分子のリアルタイムのイン・ザ・ビジュアライゼーションを可能にする。これは、AFM のような他の手法とは比類のないものです。タンパク質のDNAが世界的な立体構造変化を有するせん断力を特徴付けることによって、これらの生物物理学的特性を模倣する薬物をより良く設計することができます。このプロトコルは、様々な流れの条件での挙動または他のポリマー、特にバイオポリマーを研究し、複雑な流体のレロロジーを調査するために広く適用することができます。ステップのタイミングは成功に不可欠です。マイクロ流体デバイス表面処理や蛍光顕微鏡のステップを何度も実践して、効率的に実行することを提案します。生体分子の立体構造変化を捉えるのが、フィルムで最もよく見られる視覚的で動的な現象です。科学者は、このビデオで紹介されたリアルタイムタンパク質とDNA顕微鏡を見た後、この方法をよりよく理解するでしょう。マイクロ流体装置を準備するには、シリコーンエラストマーベースの5つの部分を計量ボートの1部硬化剤に加えます。そして、十分に硬化PDMS溶液を作成するために1分間完全に攪拌します。マスターシリコンウエハーをプラスチックペトリ皿に入れ、PDMS溶液をウエハーに注ぎ、5ミリメートルの層を作ります。皿を覆い、空気泡を取り除くために1時間真空下のデシケーターに残します。その後、一晩摂氏60度で覆われたペトリ皿をインキュベートしてPDMSを柔軟な固体に治し、PDMSウエハーインターフェースでマイクロ流体チャネルをPDMSに成形します。翌日、カミソリを使用してPDMSの各マイクロ流体チャネルの周りに20を10ミリメートルの長方形でカットし、ピンセット付きの長方形ブロックを取り除きます。25ゲージの鈍い端針を使用して、鋭利なエッジを使用して、チャネルの一端に直径0.5ミリメートルの穴を開け、穴がPDMSブロックを完全に通過することを確認します。穴からPDMSをパンチアウトし、チャネルの反対側でプロセスを繰り返すために細い針を使用してください。PDMSブロックをチャネル側を上にしてカバースリップをプラズマボンディングマシンのチャンバーに入れ、処理を開始します。治療が完了したら、すぐにカバースリップにPDMSブロックを置き、チャネルがスリップに接触するようにします。ブロックの端に圧力をかけ、その後、115°CのホットプレートにカバースリップPDMSアセンブリを15分間置き、永久結合を補強します。最後に、長さ10センチメートルを挿入します。PDMSブロックの上部にある出口穴に0.25ミリメートルの内径チューブは、流体が容易に流路から流れ出るようにします。フォン・ウィレブラント因子またはVWF実験では、無菌1X PBSに溶解した1ミリリットル当たり10マイクログラムの最大10マイクロリットルをマイクロ流体デバイスの入口に注入する。注射後に数マイクロリットルのBSA-ビオチンをピペットチップに差し込み、チップを入口に埋め込んだままにします。BSA-ビオチンがデバイス内で2時間インキュベートすることを許可し、その結果、BSAはカバースリップ表面に非特異的に結合します。その後、ピペットチップを取り出し、最大10マイクロリットルのカゼインブロッキング溶液をチャネルに注入します。カゼイン溶液を30分間インキュベートして、自由な部位をブロックし、生体分子の表面への非特異的結合を低減できるようにします。先端を取り除き、無菌PBS中のストレプトアビジンを最大10マイクロリットルのストレプトアビジンをチャネルに注入し、BSA-ビオチンのビオチン群に結合する。次に、最大10マイクロリットルの洗剤溶液を注入して、過剰なストレプトアビジンを洗い流します。先端を取り外し、ケースイン溶液またはラムダDNAにVWFのいずれかを注入する。VWFを3分間、またはラムダDNAを45分間インキュベートする。その後、5ミリモルフリービオチンを注入して、過剰なストレプトアビジン結合部位をブロックする。1ミリリットルのカゼインブロッキング溶液を注射器にロードし、シリンジポンプで固定します。次に、チューブの一端をシリンジ針に取り付け、溶液中を流れ、気泡を取り除きます。遊離ビオチン注入後約3分は、マイクロ流体装置の入口にチューブの他端を取り付ける。TIRFまたは共焦点蛍光顕微鏡の最高倍率目標を選択します。必要に応じて、目的に浸漬油の滴を追加します。マイクロ流体装置を顕微鏡ステージに置き、カバースリップが目的に合ってフラッシュされるようにします。明視野顕微鏡を開始し、破片や気泡などの特徴が見えるように焦点を調整します。次に、マイクロ流体チャネルのエッジが可視になるまで X 方向と Y 方向のステージを調整し、フレームを二分します。FITCチャネルに切り替え、個々の緑色球状分子が区別されるまで、必要に応じてZレベルとTIRF角度を調整します。レーザー強度と露出時間を調整して、蛍光分子をあまりにも速く光漂白することなく視覚化します。その後、分子をよりよく視覚化するためにコントラストを調整します。注射器ポンプからの遊離ビオチン注入開始と停止流のちょうど5分後に、1時間当たり5000〜30,000マイクロリットルの流量を用いて分子立体構造の変化を観察する。VWFでは、10,000マイクロリットル/時間の流れの30秒のような少量の流量を、無料のビオチン注入のちょうど5分後に適用することが重要である。マイクロ流体デバイスの様々な領域にわたってこれを繰り返し、開始および停止流の複数のサイクルで拡張し、リラックスできる分子を見つけます。分子が最大の伸長に達し、剪断流下の分子の連続的な行動の完全なリラクゼーションと記録ビデオにかかる時間に注意してください。変化の確認に対する分子の柔軟性は、流れの増加に伴って高い剪断速度が適用されるにつれて、その長さを長くする能力によってしばしば実証される。フォン・ヴィルブランド因子分子の伸長対せん断速度曲線は、タンパク質の生体力学的特性を特徴付ける上で有用である。ラムダDNAの蛍光顕微鏡画像は、同様に、30秒でより高い剪断速度での増加延長および流れが停止した2分間にわたって緩やかな緩和を示す。VWFで作業する場合は、3分間だけインキュベートし、5分間無料のビオチンを流れ始める前に必ずインキュベートしてください。これは、可逆的な解明に必要な最適な数またはビオチンストレプトアビジン結合を形成するために重要です。この方法は、複数の生体分子間のリアルタイム相互作用を可視化し、その機能を特徴付けるために適応することができる。例えば、高剪断下でのVWFの解明と、この方法での血小板接着分子GPIb-αとの結合を視覚化することで、血小板プラグ形成をよりよく理解することができた。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

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蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

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Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

シングルまたは共存化学/電気/せん断応力刺激下で細胞応答を研究するためのマイクロ流体デバイスを設計

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...