Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

이 작품은 국립 과학 재단 보조금 DMS-1463234, 건강의 국립 연구소 보조금 HL082808 및 AI133634, 및 리하이 대학 내부 자금에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. VWF 준비
<ol><li>인간 플라즈마 VWF를 재구성하여 라벨링 반응을 준비합니다. 1mg/mL VWF 스톡 솔루션을 만들기 위해 100 μL의 탈이온화(DI) 물을 100 μg의 동열VWF에 추가합니다.</li>
	<li>초과 글리신을 제거하기 위해 VWF 스톡 솔루션을 투석하여 비오틴 및 플루오로포어 라벨링 효율을 높입니다.<ol>
<li>VWF 스톡 솔루션 50 μL을 0.1 mL 투석 장치로 10,000 분자량 컷오프 및 캡으로 밀봉합니다. 남은 재고 용액을...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

이 방법에 설명된 바와 같이 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 구성 변화의 고품질 데이터를 얻으려면 적절한 시간 동안 분자를 배양하고 표면과의 비특이적 상호 작용을 최소화하는 것이 중요합니다. 그리고 광 표백을 줄이는 현미경 설정을 설정합니다. 자유롭게 변형을 변경하는 분자의 능력은 분자와 표면 사이에 형성 된 비오틴 스트렙타비딘 상호 작용의 수와 관련이 있습니다. 앞서 언급했...

생체 분자가 환경 자극에 반응하는 방식의 메커니즘은 널리 연구되었습니다. 특히 유동 환경에서 전단 및 연신력은 형태 변화와 잠재적으로 생체 분자의 기능을 조절합니다. 대표적인 예로는 람다 DNA 및 폰 윌레브란트 인자(VWF)의 전단 유도 해명이 있다. 람다 DNA는 개별, 유연한 폴리머 사슬의 형태 역학 및 폴리머 용액1,2,3,4의변성학을 이해하는 도구로 사용되어 왔다. VWF는 비정상적인 전단 속도 및 흐름 패턴으로 혈관의 상처 부위에 혈소판을 응집시키는 자연 유량 센서입니다. VWF의 해명은 A1 도메인에 혈소판의 결합을 활성화하고 A3 도메인에 결합하는 콜라겐을 활성화시키는 데 필수적이다. 또한, 높은 전단 유도 A2 도메인 전개는 순환5,6에서분자량 분포를 조절VWF의 분열을 허용한다. 따라서, 이 분자가 흐름의 밑에 어떻게 작동하는지의 직접적인 시각화는 그(것)들의 생체 역학 및 기능에 대한 우리의 근본적인 이해를 크게 향상할 수 있고, 이는 차례차례로 새로운 진단 및 치료 응용을 가능하게 할 수 있습니다.
단일 분자 적합성을 특성화하는 일반적인 방법론으로는 광학/자기 핀셋, 원자력 현미경 검사법(AFM) 및 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달(FRET)7이포함됩니다. 단 하나 분자 힘 분광학은 생체 분자의 형태 변화와 관련되었던 힘 그리고 운동을 조사하는 강력한 공구입니다. 그러나, 전체 분자 적합성을 매핑하는 능력이 부족하다8. AFM은 높은 공간 해상도로 이미징이 가능하지만 시간해상도9,10으로제한됩니다. 또한, 팁과 샘플 사이의 접촉은 흐름에 의해 유도된 반응을 혼동시킬 수 있다. FRET 및 nanopore 분석과 같은 다른 방법은 분자 내 거리 및 제외 된 볼륨의 검출에 따라 단일 분자 단백질 접기 및 전개 상태를 결정합니다. 그러나, 이들 방법은 아직 초기 단계에 있으며 단일 분자 적합성11,12,13,14의직접적인 관찰에 제한적이다.
한편, 형광 현미경 검사법에 의하여 높은 시간 및 공간 분해능을 가진 거대분자를 직접 관찰하는 것은 많은 생물학적 과정에서 단일 분자 역학에 대한 우리의 이해를 향상시켰습니다15,16. 예를 들어, Fu et al. 최근 처음으로 VWF 신장 및 혈소판 수용체 결합의 동시 시각화를 달성했다. 그들의 작업에서, VWF 분자는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 미세유체 채널의 표면에 고정되었고, 다양한 전단 유동 환경에서 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 이미지화되었다17. Fu's와 유사한 방법을 적용하여, 우리는 여기에서 VWF와 람다 DNA의 적합성이 TIRF 및 공초점 형광 현미경 검사법 하에서 직접 관찰될 수 있음을 보여줍니다. 그림 1과같이 미세 유체 장치는 전단 흐름을 생성하고 제어하는 데 사용되며 생체 분자는 채널 표면에 고정됩니다. 다양한 전단 속도의 적용시, 동일한 분자의 적합성은 연장 길이를 측정하기 위해 기록되며, 또한 그림 1에도시된 바와 같습니다. 이 방법은 유변학 및 생물학적 연구를 위해 복잡한 흐름 환경에서 다른 폴리머 거동을 탐구하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

기계적 섭동 하에서 단일 분자 거동은 많은 생물학적 과정을 이해하는 것이 널리 특징지어졌다. 그러나, 원자력 현미경 검사법과 같은 방법은 시간적 분해능이 제한되어 있는 반면, Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 적합성만 유추할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 각종 교류 조건에 있는 단 하나 분자의 situ 가시화에서 실시간 허용합니다. 우리의 프로토콜은 형광 현미경 검사법을 사용하여 다른 전단 흐름 환경에서 단일 생체 분자의 형태 변화를 포착하는 단계를 설명합니다. 전단 흐름은 미세 유체 채널 내부에서 생성되며 주사기 펌프에 의해 제어됩니다. 방법의 데모로, 폰 윌레브란트 인자 (VWF) 및 람다 DNA는 비오틴과 플루오로포어로 표지된 다음 채널 표면에 고정됩니다. 이들의 적합성은 총 내부 반사(TIRF) 및 공초점 형광 현미경 을 사용하여 가변 전단 흐름 하에서 지속적으로 모니터링됩니다. VWF의 가역적 해명 역학은 그 기능이 인간의 혈액에서 어떻게 조절되는지 이해하는 데 유용하며 람다 DNA의 형태는 거대 분자의 생물 물리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 유동 조건에서 폴리머, 특히 생체 고분자의 거동을 연구하고 복잡한 유체의 유변학을 조사하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.

VWF 및 람다 DNA와 같은 생체 분자의 동적 거동을 관찰하는 것은 장치 표면에 대한 결합을 최적화하는 데 크게 의존합니다. 미세 유체 장치에서 권장 시간 동안 표면 처리를 배양하는 것은 분자가 변화하는 흐름에 따라 자유롭게 확장하고 릴렉스 할 수 있도록 몇 가지 앵커리지 포인트와 결합을 얻는 데 중요합니다. 단백질 또는 DNA가 다중 연결로 너무 강하게 결합되는 경우에, 그(것)들은 한정된 길?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

우리는 미세 유체 장치에서 단일 거대 분자를 고정시키고 전단 흐름하에서 적합성의 변화를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유동 환경에서 단백질 및 DNA와 같은 생체 분자의 생체 역학 적 및 기능적 특성을 특성화하는 데 유용합니다.

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

전단 흐름 하에서 단일 바이오 분자의 변형 변화를 정량화하는 것은 단백질과 DNA와 같은 거대 분자의 기능 및 생물 물리학을 이해하는 데 유용합니다. 형광 현미경 검사는 높은 시간적 및 공간 해상도를 가진 생리적인 흐름 환경에서 단일 분자의 실시간 시상 시각화를 허용합니다. 이것은 AFM과 같은 다른 기술에 의해 타의 추종을 불허합니다.우리의 DNA가 전 세계적인 형태 변화를 가지고 있는 전단력을 특성화함으로써 이러한 생체 물리학적 특성을 모방하는 약물을 더 잘 설계할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 유동 조건에서 거동 또는 다른 폴리머, 특히 바이오 폴리머를 연구하고 복잡한 유체의 유변학을 조사하기 위해 널리 적용될 수 있다. 단계의 타이밍은 성공에 매우 중요합니다.우리는 미세 유체 장치 표면 처리 및 형광 현미경 검사법을 효율적인 방식으로 실행하기 위해 여러 번 단계를 연습하는 것이 좋습니다. 생체 분자의 형성적 변화를 포착하는 것은 영화에서 가장 잘 볼 수 있는 시각적이고 역동적인 현상입니다. 과학자는 이 비디오에 제시된 실시간 단백질 및 DNA 현미경 검사를 본 후에 이 방법을 더 잘 이해할 것입니다.미세 유체 장치를 준비하려면 무게 보트에 실리콘 엘라스토머 베이스의 5부분을 한 부품 경화제에 추가합니다. 1분 동안 내용을 철저히 저어 미리 경화된 PDMS 솔루션을 만듭니다. 마스터 실리콘 웨이퍼를 플라스틱 페트리 접시에 넣고 웨이퍼 위에 PDMS 용액을 부어 5mm 층을 만듭니다.접시를 덮고 기포를 제거하기 위해 진공 상태에서 건조기로 1 시간 동안 둡니다. 그런 다음 덮여 페트리 접시를 하룻밤 사이에 섭씨 60도에서 배양하여 PDMS를 유연한 고체로 치료하여 PDMS 웨이퍼 인터페이스에서 미세 유체 채널이 PDMS로 성형됩니다. 다음 날 면도기를 사용하여 PDMS의 각 미세 유체 채널 주위에서 20mm 10mm 직사각형을 자르고 핀셋으로 직사각형 블록을 제거합니다.선명한 가장자리가 있는 25게이지 블런트 엔드 바늘을 사용하여 채널의 한쪽 끝에 0.5 밀리미터 직경의 구멍을 뚫어 구멍이 PDMS 블록을 완전히 통과하도록 합니다. 얇은 바늘을 사용하여 PDMS를 구멍 밖으로 펀치하고 채널의 다른 쪽 끝에서 프로세스를 반복합니다. 채널 측과 커버슬립을 플라즈마 본딩 기계의 챔버에 올려 놓고 치료를 시작합니다.치료가 완료되면 채널이 슬립과 접촉할 수 있도록 PDMS 블록을 커버슬립에 신속하게 배치합니다. 블록 의 가장자리에 압력을 가한 다음 커버 슬립 PDMS 어셈블리를 115도의 온수 판에 놓고 영구 결합을 강화합니다. 마지막으로 길이10cm를 삽입합니다.0.25 밀리미터 내부 직경 튜브가 PDMS 블록 상단의 출구 구멍으로 들어가유체가 채널에서 쉽게 흘러 나올 수 있도록 합니다. 폰 윌란트 인자 또는 VWF 실험의 경우 멸균 1X PBS에 용존되는 밀리리터 BSA-Biotin당 최대 10마이크로리터를 미세유체 장치의 입구에 주입합니다. 주입 후 파이펫 팁에 BSA-비오틴의 몇 마이크로리터를 보류하고 팁이 입구에 내장된 상태로 유지되도록 합니다.BSA-Biotin이 2시간 동안 장치에 배양되도록 허용하여 BSA가 커버슬립 표면에 특이히 결합되지 않습니다. 그런 다음 파이펫 팁을 제거하고 최대 10 마이크로 리터의 카제인 차단 용액을 채널에 주입합니다. 카제인 용액이 30분 동안 배양하여 무료 부위를 차단하고 표면에 생체 분자의 비특이적 결합을 줄일 수 있도록 하십시오.팁을 제거하고 BSA-Biotin의 비오틴 그룹에 결합됩니다 채널에 멸균 PBS에 스트렙타비딘의 10 마이크로 리터를 주입합니다. 다음으로, 최대 10마이크로리터의 세제 용액을 주입하여 과도한 스트렙타비딘을 씻어냅니다. 팁을 제거하고 카제인 용액 또는 람다 DNA에 VWF를 주입합니다.VWF를 3분 동안 배양하거나 람다 DNA를 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 5 밀리풀프리 비오틴을 주입하여 과도한 스트렙타비딘 결합 부위를 차단합니다. 카제인 블로킹 용액 1밀리리터를 주사기에 적재하고 주사기 펌프에 고정합니다.그런 다음 튜브의 한쪽 끝을 주사기 바늘에 부착하고 용액의 흐름을 사용하여 기포를 제거합니다. 무료 비오틴 주입 후 약 3 분 마이크로 유체 장치의 입구에 튜브의 다른 끝을 부착한다. TIRF 또는 공초점 형광 현미경의 가장 높은 배율 목표를 선택합니다.필요한 경우 목표에 침수 오일 한 방울을 추가합니다. 현미경 단계에 미세 유체 장치를 배치하여 커버슬립이 목표와 플러시되도록 합니다. 밝은 필드 현미경 검사를 시작하고 파편과 거품과 같은 기능이 보이면 초점을 조정하십시오.그런 다음 미세 유체 채널의 가장자리가 표시되고 프레임을 양분할 때까지 X 및 Y 방향으로 스테이지를 조정합니다. FITC 채널로 전환하고 개별 녹색 구형 분자를 구별할 수 있을 때까지 필요에 따라 Z 레벨 및 TIRF 각도를 조정합니다. 레이저 강도와 노출 시간을 조정하여 너무 빨리 광표백하지 않고 형광 분자를 시각화합니다.그런 다음 분자를 더 잘 시각화하기 위해 대비를 조정합니다. 무료 비오틴 주입 개시 후 정확히 5 분 및 주사기 펌프에서 흐름을 중지시간 당 5000 과 30, 000 마이크로 리터 사이의 유량을 사용하여 분자 형성의 변화를 관찰한다. VWF를 사용하면 무료 비오틴 주입 후 정확히 5분 후에 시간당 30초 10, 000 마이크로리터 흐름과 같은 소량의 흐름을 적용하는 것이 중요합니다.미세 유체 장치의 다양한 영역에 걸쳐 이 것을 반복하고 흐름을 시작하고 중지하는 여러 주기에 연장하고 완화 할 수있는 분자를 찾습니다. 분자가 최대 연장에 도달하고 완전한 이완에 도달하는 데 걸리는 시간을 기록하고 전단 흐름 하에서 분자의 지속적인 행동의 비디오를 녹화하십시오. 확인을 변경하는 분자의 유연성은 종종 증가 흐름으로 인해 더 높은 전단 속도가 적용으로 길어질 수있는 능력에 의해 입증된다.폰 윌란트 인자 분자의 전단 속도 곡선 대 확장은 단백질의 생체 역학적 특성을 특성화하는 데 유용하다. 람다 DNA의 형광 현미경 이미지는 유사하게 30 초에 더 높은 전단 비율에 증가한 확장을 보여주고 흐름이 중단된 후에 2 분 동안 점진적인 이완. VWF와 함께 작업할 때는 흐름을 시작하기 전에 3분 동안만 배양하고 5분 동안 무료 비오틴을 무료로 배양해야 합니다.이는 가역적 해명에 필요한 최적의 수 또는 비오틴 스트렙타비딘 연결을 형성하는 데 매우 중요합니다. 이 방법은 다중 생체 분자 간의 실시간 상호 작용을 시각화하고 기능을 특성화하도록 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법으로 혈소판 접착 분자 GPIb-alpha와 함께 높은 전단및 결합하에 해명하는 VWF를 시각화하여 혈소판 플러그 형성을 더 잘 이해할 수 있었다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...