Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Science Foundation stipend DMS-1463234, National Institutes of Health tilskudd HL082808 og AI133634, og Lehigh University intern finansiering.

1. Klargjøre VWF
<ol><li>Rekonstituere humant plasma VWF for å forberede det på merkingsreaksjonene. Tilsett 100 μL deionisert (DI) vann til 100 μg lyofilisert VWF for å lage en 1 mg/ml VWF-lagerløsning.</li>
	<li>Dialyze VWF lagerløsning for å fjerne overflødig glycin, og dermed øke biotin og fluorophore merking effektivitet.<ol>
<li>Overfør 50 μL VWF-lageroppløsning til en 0,1 ml dialyseenhet med en 10 000 kutting i molekylvekt og forsegling med en hette. Oppbevar gjenværende lageroppløsning ved -20 ?...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

For å oppnå data av høy kvalitet av enkeltmolekylkonformasjonsendringer ved hjelp av fluorescensmikroskopi som beskrevet i denne metoden, er det avgjørende å inkubere molekylet i riktig tid, minimere sine uspesifikke interaksjoner med overflaten og etablere mikroskopinnstillinger som reduserer fotobleking. Molekylets evne til fritt å endre konformasjoner er relatert til antall biotin-streptavidin interaksjoner dannet mellom molekylet og overflaten. Som nevnt tidligere, må dette kontrolleres ved å inkubere molekyl...

Mekanismer for hvordan biomolekyler reagerer på miljømessige stimuli har blitt studert mye. I et strømningsmiljø spesielt regulerer skjær- og langeringskrefter konformasjonsendringene og potensielt biomolekylenes funksjon. Typiske eksempler inkluderer skjær-indusert unraveling av lambda DNA og von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA har blitt brukt som et verktøy for å forstå konformasjonsdynamikk av individuelle, fleksible polymerkjeder og revologien til polymerløsninger1,2,3,4. VWF er en naturlig strømningssensor som samler blodplater på sårsteder i blodårene med unormal skjærfrekvens og strømningsmønstre. Unraveling av VWF er avgjørende for å aktivere bindingen av blodplater til A1-domenet og kollagenbinding til A3-domenet. I tillegg, høy skjær-indusert A2 domene utfoldelse tillater spaltning av VWF, som regulerer sin molekylære vektfordeling i sirkulasjon5,6. Dermed kan direkte visualisering av hvordan disse molekylene oppfører seg under strømning i stor grad forbedre vår grunnleggende forståelse av deres biomekanikk og funksjon, noe som igjen kan muliggjøre nye diagnostiske og terapeutiske applikasjoner.
Typiske metoder for å karakterisere enkeltmolekylkonformasjoner inkluderer optiske/magnetiske pinsett, atomkraftmikroskopi (AFM) og enkeltmolekyl Förster resonansenergioverføring (FRET)7. Enkeltmolekylstyrkespektroskopi er et kraftig verktøy for å undersøke kraften og bevegelsen forbundet med konformasjonsendringene av biomolekyler. Det mangler imidlertid evnen til å kartlegge generelle molekylære konformasjoner8. AFM er i stand til å bildebehandling med høy romlig oppløsning, men er begrenset i temporal oppløsning9,10. I tillegg kan kontakt mellom spissen og prøven forvirre responsen forårsaket av flyt. Andre metoder som FRET og nanoporeanalyse bestemmer enkeltmolekylproteinfolding og utfoldelse ser ut basert på påvisning av intramolekylær avstand og ekskluderte volumer. Imidlertid er disse metodene fortsatt i sin barndom og begrenset i sin direkte observasjon av enkeltmolekylkonformasjoner11,12,13,14.
På den annen side har direkte observere makromolekyler med høy temporal og romlig oppløsning under fluorescensmikroskopi forbedret vår forståelse av enkeltmolekyldynamikk i mange biologiske prosesser15,16. For eksempel oppnådde Fu et al. nylig samtidig visualisering av VWF forlengelse og blodplatereseptorbinding for første gang. I sitt arbeid ble VWF-molekyler immobilisert på overflaten av en mikrofluidisk kanal gjennom biotin-streptavidin interaksjoner og avbildet under total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi ved varierende skjærstrømningsmiljøer17. Ved å bruke en lignende metode som Fus, viser vi her at konformasjoner av VWF og lambda DNA kan observeres direkte under både TIRF og konfokal fluorescensmikroskopi. Som vist i figur 1brukes mikrofluidiske enheter til å opprette og kontrollere skjærstrømning, og biomolekyler er immobilisert på kanaloverflaten. Ved bruk av varierende skjærhastigheter registreres konformasjoner av det samme molekylet for å måle forlengelseslengden, også vist i figur 1. Metoden kan brukes mye for å utforske andre polymeratferd under komplekse strømningsmiljøer for både revologiske og biologiske studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Enkeltmolekylatferd under mekanisk perturbasjon har blitt karakterisert mye for å forstå mange biologiske prosesser. Metoder som atomkraftmikroskopi har imidlertid begrenset tidsoppløsning, mens Förster resonansenergioverføring (FRET) bare tillater konformasjoner å bli utsatt. Fluorescensmikroskopi, derimot, tillater sanntid in situ visualisering av enkeltmolekyler under ulike strømningsforhold. Vår protokoll beskriver trinnene for å fange konformasjonelle endringer av enkeltbiomolekyler under forskjellige skjærstrømningsmiljøer ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Skjærstrømmen opprettes inne i mikrofluidiske kanaler og styres av en sprøytepumpe. Som demonstrasjoner av metoden er von Willebrand-faktor (VWF) og lambda DNA merket med biotin og fluorophore og deretter immobilisert på kanaloverflaten. Deres konformasjoner overvåkes kontinuerlig under variabel skjærstrøm ved hjelp av total intern refleksjon (TIRF) og konfokal fluorescensmikroskopi. Den reversible unraveling dynamikken i VWF er nyttig for å forstå hvordan funksjonen er regulert i menneskelig blod, mens konformasjonen av lambda DNA gir innsikt i biofysikken til makromolekyler. Protokollen kan også brukes mye for å studere atferden til polymerer, spesielt biopolymerer, i varierende strømningsforhold og for å undersøke revologien til komplekse væsker.

Å observere den dynamiske oppførselen til biomolekyler som VWF og lambda DNA er svært avhengig av å optimalisere bindingen til enhetsoverflaten. Inkubering av overflatebehandlinger for de anbefalte tidene i mikrofluidisk enhet er avgjørende for å oppnå binding med noen forankringspunkter, slik at molekyler fritt kan utvide og slappe av ved endring av strømning. Hvis proteinene eller DNA-et er bundet for sterkt med flere koblinger, vil de enten strekke seg til begrensede lengder eller ikke strekke seg i det hele t...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Vi presenterer en protokoll for å immobilisere enkeltmakromolekyler i mikrofluidiske enheter og kvantifisere endringer i deres konformasjoner under skjærstrøm. Denne protokollen er nyttig for å karakterisere biomekaniske og funksjonelle egenskaper av biomolekyler som proteiner og DNA i et strømningsmiljø.

Karakterisere enkeltmolekylkonformasjonsendringer under skjærstrøm med fluorescensmikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Kvantifisering av konformasjonsendringene i enkeltbiomolekyler under skjærstrøm er nyttig for å forstå funksjonen og biofysikken til makromolekyler som protein og DNA. Fluorescensmikroskopi tillater sanntids in-situ visualisering av enkeltmolekyler i fysiologiske strømningsmiljøer med høy temporal og romlig oppløsning. Dette er uovertruffen av andre teknikker som AFM.Ved å karakterisere skjærkraften der proteiner vårt DNA har globale konformasjonsendringer, kan man bedre designe legemidler som etterligner disse biofysiske egenskapene. Denne protokollen kan brukes mye for å studere atferd eller andre polymerer, spesielt biopolymerer, i varierende strømningsforhold og for å undersøke reologien til komplekse væsker. Tidspunktet for trinnene er avgjørende for suksess.Vi foreslår at du praktiserer mikrofluidisk enhetsoverflatebehandling og fluorescensmikroskopi trinn mange ganger for å utføre dem på en effektiv måte. Å fange konformasjonsendringer i biomolekyler er et visuelt og dynamisk fenomen som best ses på film. Forskere vil bedre forstå denne metoden etter å ha sett sanntidsproteinet og DNA-mikroskopien som presenteres i denne videoen.For å forberede mikrofluidisk enhet, legg til fem deler silikon elastomer base til en del herding agent i en veiebåt. og rør innholdet grundig i ett minutt for å lage en forhåndsherdet PDMS-løsning. Legg master silisiumwafer i en plast Petri skål og hell PDMS-løsningen over wafer for å skape et fem millimeter lag.Dekk parabolen og la den stå i en desiccator under vakuum i en time for å fjerne luftbobler. Deretter inkubere den dekkede petriskålen ved 60 grader Celsius over natten for å kurere PDMS til et fleksibelt fast stoff, noe som vil resultere i at mikrofluidiske kanaler blir støpt inn i PDMS på PDMS wafer-grensesnittet. På neste dag, bruk en barberhøvel til å kutte 20 med 10 millimeter rektangler rundt hver mikrofluidisk kanal i PDMS og fjerne de rektangulære blokkene med pinsett.Bruk en 25-gauge stump endenål med spisse kanter for å slå et hull med 0,5 millimeter diameter i den ene enden av kanalen, og pass på at hullet går helt gjennom PDMS-blokken. Bruk en tynn nål til å slå PDMS ut av hullet og gjenta prosessen i den andre enden av kanalen. Plasser PDMS-blokken med kanalen med side opp og dekkglasset inn i kammeret på en plasmabindingsmaskin og start behandlingen.Når behandlingen er fullført, plasserer du raskt PDMS-blokken på en dekkslips slik at kanalen er i kontakt med slip. Påfør trykk på kantene av blokken, og plasser deretter dekkglasset PDMS-enheten på en kokeplate ved 115 grader Celsius i 15 minutter for å forsterke den permanente bindingen. Til slutt setter du inn en 10-centimeter lang.0,25 millimeter indre diameter rør inn i utløpshullet på toppen av PDMS-blokken slik at væsken lett kan strømme ut av kanalen. For von Willebrand faktor eller VWF eksperimenter injisere opptil 10 mikroliter på 10 mikrogram per milliliter BSA-Biotin oppløst i sterile 1X PBS i innløpet av mikrofluidic enheten. Hold tilbake noen mikroliter bsa-biotin i pipettespissen etter injeksjon og la spissen forbli innebygd i innløpet.La BSA-Biotin inkubere i enheten i to timer, noe som vil resultere i at BSA ikke er spesifikt bindende til dekkglassoverflaten. Fjern deretter pipettespissen og injiser opptil 10 mikroliter med e-og-små bokstaver i blokkeringsløsningen i kanalen. La caseinløsningen inkubere i 30 minutter, slik at den kan blokkere alle gratis steder og redusere uspesifikk binding av biomolekylene til overflaten.Fjern spissen og injiser opptil 10 mikroliter streptavidin i steril PBS inn i kanalen, som vil binde seg til biotingruppene til BSA-Biotin. Deretter injiserer du opptil 10 mikroliter vaskemiddeloppløsning for å vaske bort overflødig streptavidin. Fjern spissen og injiser enten VWF i casein oppløsning eller lambda DNA.Inkuber VWF i tre minutter eller lambda DNA i 45 minutter. Deretter injiserer du fem millimolar gratis biotin for å blokkere de overskytende streptavidin bindingsstedene. Legg ett milliliter med caseinblokkeringsoppløsning i en sprøyte og fest den i en sprøytepumpe.Fest deretter den ene enden av slangen til sprøyten nålen og flyt i løsningen for å fjerne luftbobler. Omtrent tre minutter etter den frie biotininjeksjonen festes den andre enden av røret til innløpet på mikrofluidisk enhet. Velg det høyeste forstørrelsesmålet for TIRF eller konfokal fluorescensmikroskopet.Om nødvendig, tilsett en dråpe nedsenking olje på målet. Plasser mikrofluidisk enhet på mikroskopstadiet slik at dekkglasset er i flukt med målet. Start mikroskopi med lyst felt og juster fokuset slik at funksjoner som rusk og bobler er synlige.Juster deretter trinnet i X- og Y-retningene til kanten av mikrofluidkanalen er synlig og deler rammen. Bytt til FITC-kanalen og juster Z-nivået og TIRF-vinkelen etter behov til de enkelte grønne kulemolekylene kan skilles ut. Juster laserintensiteten og eksponeringstiden for å visualisere fluorescerende molekyler uten å fotoble dem for fort.Juster deretter kontrasten for å bedre visualisere molekylene. Nøyaktig fem minutter etter fri biotin injeksjon start og stopp flyt fra sprøytepumpen for å observere endringene i molekylær konformasjon ved hjelp av strømningshastigheter mellom 5000 og 30,000 mikroliter per time. Med VWF er det viktig å bruke minst en liten mengde strømning, for eksempel 30 sekunder med 10 000 mikroliter per time flyt nøyaktig fem minutter etter gratis biotin injeksjon.Gjenta dette gjennom ulike områder av mikrofluidisk enhet og finn molekyler som kan strekke seg og slappe av ved flere sykluser med start- og stoppstrøm. Legg merke til hvor lang tid det tar for molekyler å nå maksimal forlengelse og fullføre avslapning og registrere videoer av den kontinuerlige oppførselen til molekyler under skjærstrøm. Fleksibiliteten til et molekyl for å endre bekreftelse er ofte demonstrert av sin evne til å forlenge som høyere skjærhastigheter brukes på grunn av økende flyt.Forlengelsen versus skjærhastighetskurven til et von Willebrand faktormolekyl er nyttig for å karakterisere proteinets biomekaniske egenskaper. Fluorescens mikroskopi bilder av lambda DNA tilsvarende viser økt forlengelse på høyere skjær priser på 30 sekunder og gradvis avslapning over to minutter etter flyten er stoppet. Når du arbeider med VWF, husk å inkubere det bare i tre minutter og gratis biotin i fem minutter før startflyten.Dette er avgjørende for å danne det optimale antallet eller biotin-streptavidin-koblingene som trengs for reversibel unraveling. Denne metoden kan tilpasses for å visualisere sanntidsinteraksjoner mellom flere biomolekyler og karakterisere deres funksjoner. For eksempel kan man bedre forstå blodplatepluggdannelse ved å visualisere VWF unraveling under høy skjær og binding med blodplateadhesjonsmolekylet GPIb-alfa med denne metoden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallell-plate Flow Chamber og kontinuerlig flyt Circuit å evaluere endoteliale progenitorceller henhold Laminar Flow skjærspenning

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Opprette Lim og Løselig overgangar for Imaging Cell Migration med fluorescens mikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer til Studer konformasjonsendringer i membran proteiner uttrykt i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Photoactivated Lokalisering Mikros med bimolecular fluorescens Komplemente (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Designing mikrofluid Enheter for å studere cellulære responser Under Singel eller andre sykdoms Kjemisk / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...