Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado em parte por uma Fundação Nacional de Ciência sacada dMS-1463234, Institutos Nacionais de Saúde concede HL082808 e AI133634, e financiamento interno da Universidade Lehigh.

1. Preparando VWF
<ol><li>Reconstituir o VWF de plasma humano para prepará-lo para as reações de rotulagem. Adicione 100 μL de água desionizada (DI) a 100 μg de VWF liofilizado para criar uma solução de estoque VWF de 1 mg/mL.</li>
	<li>Dilatar a solução de estoque da VWF para remover o excesso de glicina, aumentando assim a eficiência de rotulagem de biotina e fluorofóforo.<ol>
<li>Transfira 50 μL da solução de estoque da VWF para uma unidade de diálise de 0,1 mL com um corte de peso molecular de 10.00...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Para obter dados de alta qualidade de alterações conformais de molécula única usando microscopia de fluorescência como descrito neste método, é fundamental incubar a molécula pela quantidade adequada de tempo, minimizar suas interações inespecíficas com a superfície e estabelecer configurações de microscópio que reduzem o fotobranqueamento. A capacidade da molécula de mudar livremente a conformação está relacionada ao número de interações biotina-streptavidin formada entre a molécula e a superfíci...

Mecanismos de como as biomoléculas respondem a estímulos ambientais têm sido amplamente estudados. Em um ambiente de fluxo em particular, as forças de cisalhamento e alongamento regulam as mudanças conformacionais e potencialmente a função das biomoléculas. Exemplos típicos incluem desvendamento induzido por cisalhamento do DNA lambda e do fator von Willebrand (VWF). O DNA lambda tem sido usado como ferramenta para entender a dinâmica conformação de cadeias de polímeros individuais e flexíveis e a reologia das soluções de polímeros1,2,3,4. VWF é um sensor de fluxo natural que agrega plaquetas em locais de feridas de vasos sanguíneos com taxas de cisalhamento anormal e padrões de fluxo. O desvendamento da VWF é essencial para ativar a vinculação de plaquetas ao domínio A1 e ligação de colágeno ao domínio A3. Além disso, o desdobramento do domínio A2 induzido por cisalhamento permite o decote da VWF, que regula sua distribuição de peso molecular na circulação5,6. Assim, a visualização direta de como essas moléculas se comportam o fluxo pode melhorar muito nossa compreensão fundamental de sua biomecânica e função, que por sua vez podem permitir novas aplicações diagnósticas e terapêuticas.
Metodologias típicas para caracterizar conformações de moléculaúnica incluem pinças ópticas/magnéticas, microscopia de força atômica (AFM) e transferência de energia de ressonância Förster de molécula única (FRET)7. A espectroscopia de força de molécula única é uma poderosa ferramenta para investigar a força e o movimento associados às mudanças conformacionais de biomoléculas. No entanto, não tem a capacidade de mapear conformações moleculares globais8. A AFM é capaz de imagens com alta resolução espacial, mas é limitada na resolução temporal9,10. Além disso, o contato entre a ponta e a amostra pode confundir a resposta induzida pelo fluxo. Outros métodos como a ANÁLISE frete e nanopore determinam o dobrável e desdobramento de proteínas de molécula única com base na detecção de distância molecular e volumes excluídos. No entanto, esses métodos ainda estão em sua infância e limitados em sua observação direta de conformações unimoléculas11,12,13,14.
Por outro lado, observar diretamente macromoléculas com alta resolução temporal e espacial microscopia de fluorescência melhorou nossa compreensão da dinâmica de moléculaúnica em muitos processos biológicos15,16. Por exemplo, Fu et al. recentemente alcançaram visualização simultânea de alongamento VWF e ligação receptor a plaqueta pela primeira vez. Em seu trabalho, as moléculas vwf foram imobilizadas na superfície de um canal microfluido através de interações biotina-streptavidin e imagens reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento17. Aplicando um método semelhante ao de Fu, demonstramos aqui que conformações de DNA VWF e lambda podem ser observadas diretamente microscopia de fluorescência TIRF e confocal. Como mostrado na Figura 1,dispositivos microfluidos são usados para criar e controlar o fluxo de cisalhamento, e as biomoléculas são imobilizadas na superfície do canal. Após a aplicação de diferentes taxas de cisalhamento, conformações da mesma molécula são registradas para medir o comprimento extensão, também mostrado na Figura 1. O método poderia ser amplamente aplicado para explorar outros comportamentos de polímeros em ambientes de fluxo complexos para estudos reológicos e biológicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

O comportamento de uma única molécula perturbação mecânica tem sido amplamente caracterizado para entender muitos processos biológicos. No entanto, métodos como microscopia da força atômica têm resolução temporal limitada, enquanto a transferência de energia de ressonância förster (FRET) só permite que conformações sejam inferidas. A microscopia de fluorescência, por outro lado, permite a visualização em tempo real de moléculas únicas em várias condições de fluxo. Nosso protocolo descreve as etapas para capturar alterações conformacionais de biomoléculas únicas em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento usando microscopia de fluorescência. O fluxo de cisalhamento é criado dentro de canais microfluidos e controlado por uma bomba de seringa. Como demonstrações do método, o fator von Willebrand (VWF) e o DNA lambda são rotulados com biotina e fluoroforo e depois imobilizados na superfície do canal. Suas conformações são continuamente monitoradas fluxo de cisalhamento variável utilizando reflexão interna total (TIRF) e microscopia de fluorescência confocal. A dinâmica reversível de desvendar a VWF é útil para entender como sua função é regulada no sangue humano, enquanto a conformação do DNA lambda oferece insights sobre a biofísica das macromoléculas. O protocolo também pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento dos polímeros, especialmente biopolímeros, em condições variadas de fluxo e investigar a reologia de fluidos complexos.

Observar o comportamento dinâmico de biomoléculas como VWF e DNA lambda é altamente dependente da otimização de sua ligação com a superfície do dispositivo. A incubação de tratamentos superficiais para os tempos recomendados no dispositivo microfluido é crucial para obter a ligação com alguns pontos de ancoragem, para que as moléculas possam se estender livremente e relaxar ao mudar o fluxo. Se as proteínas ou DNA estiverem muito fortemente ligados a várias ligações, elas se estenderão a comprimentos l...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Apresentamos um protocolo para imobilizar macromoléculas únicas em dispositivos microfluidos e quantificar mudanças em suas conformações fluxo de cisalhamento. Este protocolo é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas e funcionais de biomoléculas, como proteínas e DNA, em um ambiente de fluxo.

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Quantificar as alterações conformais em biomoléculas únicas sob fluxo de cisalhamento é útil para entender a função e a biofísica de macromoléculas como proteína e DNA. A microscopia de fluorescência permite a visualização em tempo real in situ de moléculas únicas em ambientes de fluxo fisiológico com alta resolução temporal e espacial. Isso é incomparável por outras técnicas como a AFM.Ao caracterizar a força de tesoura sob a qual as proteínas do nosso DNA têm alterações conformais globais, pode-se projetar melhor drogas que imitam essas propriedades biofísicas. Este protocolo pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento ou outros polímeros, especialmente os biopolímeros, em diferentes condições de fluxo e para investigar a reologia de fluidos complexos. O timing das etapas é fundamental para o sucesso.Sugerimos a prática do tratamento de superfície do dispositivo microfluido e passos de microscopia de fluorescência muitas vezes para executá-los de forma eficiente. Capturar mudanças conformais em biomoléculas é um fenômeno visual e dinâmico melhor visto no filme. Os cientistas entenderão melhor esse método depois de ver a microscopia de proteína e DNA em tempo real apresentada neste vídeo.Para preparar o dispositivo microfluido, adicione cinco partes da base de elastômero de silicone a uma parte do agente de cura em um barco de pesagem. e mexa o conteúdo completamente por um minuto para criar uma solução PDMS pré-curada. Coloque o wafer de silício mestre em uma placa de Petri de plástico e despeje a solução PDMS sobre o wafer para criar uma camada de cinco milímetros.Cubra o prato e deixe-o em um desiccador sob vácuo por uma hora para remover bolhas de ar. Em seguida, incubar a placa de Petri coberta a 60 graus Celsius durante a noite para curar o PDMS em um sólido flexível, o que resultará em canais microfluidos sendo moldados no PDMS na interface do wafer PDMS. No dia seguinte, use uma navalha para cortar retângulos de 20 por 10 milímetros em torno de cada canal microfluido no PDMS e remova os blocos retangulares com pinças.Use uma agulha de extremidade sem medida de 25 bitolas com bordas afiadas para perfurar um buraco de 0,5 milímetros de diâmetro em uma extremidade do canal, certificando-se de que o orifício passe completamente pelo bloco PDMS. Use uma agulha fina para socar o PDMS para fora do orifício e repetir o processo na outra extremidade do canal. Coloque o bloco PDMS com o lado do canal para cima e a tampa na câmara de uma máquina de ligação plasmática e inicie o tratamento.Quando o tratamento estiver concluído, coloque rapidamente o bloco PDMS em uma tampa para que o canal esteja em contato com o deslizamento. Aplique pressão nas bordas do bloco e coloque o conjunto PDMS em uma placa quente a 115 graus Celsius por 15 minutos para reforçar o vínculo permanente. Por fim, insira um comprimento de 10 centímetros.Tubo de diâmetro interno de 0,25 milímetros no orifício de saída na parte superior do bloco PDMS para permitir que o fluido flua facilmente para fora do canal. Para o fator von Willebrand ou experimentos VWF injetar até 10 microlitres de 10 microgramas por mililitro BSA-Biotin dissolvido em PBS 1X estéril na entrada do dispositivo microfluido. Retenha alguns microliters de BSA-Biotin na ponta da pipeta após a injeção e deixe que a ponta permaneça embutida na entrada.Permita que o BSA-Biotin incubar no dispositivo por duas horas, o que resultará em BSA não especificamente ligado à superfície do deslizamento de tampas. Em seguida, remova a ponta da pipeta e injete até 10 microliters de solução de bloqueio de caseína no canal. Permita que a solução casein incubar por 30 minutos para que possa bloquear quaisquer locais livres e reduzir a ligação inespecífica das biomoléculas à superfície.Remova a ponta e injete até 10 microliters de streptavidina em PBS estéril no canal, que se ligará aos grupos de biotina do BSA-Biotin. Em seguida, injete até 10 microliters de solução detergente para lavar o excesso de streptavidina. Remova a ponta e injete vwf em solução de caseína ou DNA lambda.Incubar VWF por três minutos ou DNA lambda por 45 minutos. Em seguida, injete cinco biotinas livres de milimólar para bloquear o excesso de energia. Carregue um mililitro da solução de bloqueio de caixa em uma seringa e fixe-a em uma bomba de seringa.Em seguida, conecte uma extremidade da tubulação à agulha da seringa e flua na solução para remover bolhas de ar. Aproximadamente três minutos após a injeção de biotina gratuita anexar a outra extremidade do tubo à entrada do dispositivo microfluido. Selecione o objetivo de ampliação mais alto do TIRF ou microscópio de fluorescência confocal.Se necessário, adicione uma gota de óleo de imersão no objetivo. Coloque o dispositivo microfluido no estágio do microscópio para que o deslizamento esteja alinhado com o objetivo. Inicie a microscopia de campo brilhante e ajuste o foco para que características como detritos e bolhas sejam visíveis.Em seguida, ajuste o estágio nas direções X e Y até que a borda do canal microfluido seja visível e bissecte o quadro. Mude para o canal FITC e ajuste o nível Z e o ângulo TIRF conforme necessário até que as moléculas globulares verdes individuais possam ser distinguidas. Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para visualizar moléculas fluorescentes sem fotografá-las muito rapidamente.Em seguida, ajuste o contraste para melhor visualizar as moléculas. Exatamente cinco minutos após o início livre da injeção de biotina e o fluxo de parada da bomba de seringa para observar as mudanças na conformação molecular usando taxas de fluxo entre 5000 e 30.000 microliters por hora. Com o VWF é fundamental aplicar pelo menos uma pequena quantidade de fluxo, como 30 segundos de 10.000 microliter por hora, exatamente cinco minutos após a injeção gratuita de biotina.Repita isso em várias áreas do dispositivo microfluido e localize moléculas que podem se estender e relaxar em vários ciclos de fluxo de partida e parada. Observe quanto tempo leva para as moléculas atingirem a extensão máxima e completarem o relaxamento e gravar vídeos do comportamento contínuo das moléculas sob fluxo de cisalhamento. A flexibilidade de uma molécula para alterar a confirmação é frequentemente demonstrada por sua capacidade de alongar à medida que taxas mais altas de cisalhamento são aplicadas devido ao aumento do fluxo.A curva de extensão versus taxa de corte de uma molécula fator von Willebrand é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas da proteína. Imagens de microscopia de fluorescência do DNA lambda também mostram aumento da extensão sobre taxas de cisalhamento mais altas em 30 segundos e relaxamento gradual ao longo de dois minutos após o fluxo ser interrompido. Ao trabalhar com VWF, lembre-se de incuba-lo apenas por três minutos e biotina livre por cinco minutos antes de iniciar o fluxo.Isso é fundamental para formar o número ideal ou ligações biotina-streptavidina necessárias para desvendar reversíveis. Este método pode ser adaptado para visualizar interações em tempo real entre múltiplas biomoléculas e caracterizar suas funções. Por exemplo, pode-se entender melhor a formação de plugue de plaquetas visualizando o VWF desvendando sob cisalhamento alto e sua ligação com a molécula de adesão plaqueta GPIb-alfa com este método.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...