Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Грантом Национального научного фонда DMS-1463234, Национальными институтами здравоохранения, грантами HL082808 и AI133634, а также внутренним финансированием Университета Лихай.

1. Подготовка VWF
<ol><li>Восстановите плазму человека VWF, чтобы подготовить ее к маркировке реакций. Добавьте 100 л деионизированной (DI) воды в 100 мкг лиофилизированного VWF для создания 1 мг/мл VWF сзапасваемого раствора.</li>
	<li>Dialyze VWF фондовый раствор для того, чтобы удалить избыток глицина, тем с?...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Для получения высококачественных данных одномолекулярных конформационных изменений с помощью флуоресценционной микроскопии, описанной в этом методе, очень важно инкубировать молекулу в течение соответствующего количества времени, минимизировать ее неспецифические взаимодействия...

Механизмы реагирования биомолекул на экологические стимулы были изучены широко. В среде потока, в частности, сдвига и удлиненные силы регулируют конформационные изменения и, возможно, функции биомолекул. Типичные примеры включают сдвига индуцированной распутывание лямбда ДНК и фон Willebrand фактор (VWF). Ламбда ДНК была использована в качестве инструмента для понимания конформационной динамики отдельных, гибких полимерных цепей и реологии полимерных решений1,2,3,4. VWF является естественным датчиком потока, который агрегирует тромбоциты на участках раны кровеносных сосудов с ненормальными скоростью сдвига и структурой потока. Разгадка VWF имеет важное значение для активации связывания тромбоцитов с доменом A1 и связывания коллагена с доменом A3. Кроме того, высокий сдвига индуцированных A2 домена разворачивается позволяет расщепление VWF, который регулирует его молекулярное распределение веса вобращении5,6. Таким образом, прямая визуализация того, как эти молекулы ведут себя под потоком, может значительно улучшить наше фундаментальное понимание их биомеханики и функции, что, в свою очередь, может позволить новые диагностические и терапевтические применения.
Типичные методологии для характеристики одномолекулярных конформации включают оптические/магнитные пинцеты, атомную микроскопию силы (AFM) и одномолекулярную рецензируемую рецензию Фюрстера (FRET)7. Одномолекулярная силовая спектроскопия является мощным инструментом для исследования силы и движения, связанных с конформационными изменениями биомолекул. Тем не менее, ему не хватает возможности составить карту общих молекулярных конформий8. AFM способен к визуализации с высоким пространственным разрешением, но ограничен в временном разрешении9,10. Кроме того, контакт между кончиком и образцом может затруднить реакцию, вызванную потоком. Другие методы, такие как FRET и нанопорная аналитика, определяют одномолекулярные белковые складные и разворачивающиеся состояния на основе обнаружения внутримолекулярного расстояния и исключенных объемов. Тем не менее, эти методы все еще находятся в зачаточном состоянии и ограничены в их прямом наблюдении одномолекулярных конформации11,12,13,14.
С другой стороны, непосредственное наблюдение макромолекулы с высоким висальным и пространственным разрешением при флуоресценционной микроскопии улучшило наше понимание одномолекулярной динамики во многих биологических процессах15,16. Например, Fu et al. недавно впервые добились одновременной визуализации удлинения VWF и связывания рецепторов тромбоцитов. В своей работе молекулы VWF были обездвижены на поверхности микрофлюидного канала через взаимодействия биотин-стрептавидина и изображены под общей внутренней флуоресценцией (TIRF) микроскопии при различных средах потока сдвига17. Применяя аналогичный метод, как Фу, мы здесь продемонстрировать, что конформации VWF и лямбда ДНК могут быть непосредственно наблюдались как при TIRF и конфокальной флуоресценции микроскопии. Как показано на рисунке 1,микрофлюидные устройства используются для создания и контроля потока сдвига, а биомолекулы обездвижены на поверхности канала. При применении различных ставок сдвига регистрируются конформации одной и той же молекулы для измерения прорезной длины, также показанной на рисунке 1. Этот метод может быть широко применен для изучения других полимерных поведений в сложных условиях потока как для реологических, так и для биологических исследований.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Одномолекулярное поведение при механических возмущениях характеризуется широко, чтобы понять многие биологические процессы. Однако такие методы, как атомная силовая микроскопия, имеют ограниченное временное разрешение, в то время как режит энергии Фюрстера (FRET) только позволяет делать вывод о конформах. Флуоресценция микроскопии, с другой стороны, позволяет в режиме реального времени на месте визуализации отдельных молекул в различных условиях потока. Наш протокол описывает шаги по захвату конформансальных изменений отдельных биомолекул в различных средах потока сдвига с помощью флуоресценционной микроскопии. Поток сдвига создается внутри микрофлюидных каналов и контролируется шприц насосом. В качестве демонстрации метода, фон Willebrand фактор (VWF) и лямбда ДНК помечены биотин омичи и фторфора, а затем обездвижены на поверхности канала. Их конформации постоянно контролируются при переменном потоке сдвига с использованием общего внутреннего отражения (TIRF) и конфокальной флуоресценции микроскопии. Реверсивная динамика распутывания VWF полезна для понимания того, как регулируется его функция в крови человека, в то время как конформация ДНК лямбды дает представление о биофизике макромолекул. Протокол также может быть широко применен для изучения поведения полимеров, особенно биополимеров, в различных условиях потока и для исследования реологии сложных жидкостей.

Наблюдение за динамическим поведением биомолекул, таких как VWF и лямбда ДНК в большой степени зависит от оптимизации их связывания с поверхностью устройства. Инкубирование поверхностных процедур для рекомендуемого времени в микрофлюидном устройстве имеет решающее значение для получ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Мы представляем протокол для иммобилизации отдельных макромолекулв в микрофлюидных устройствах и количественной изменения в их конформации при потоке сдвига. Этот протокол полезен для характеристики биомеханических и функциональных свойств биомолекул, таких как белки и ДНК в среде потока.

Характеристика одномолекулярных конформационных изменений под стрижкой потока с флуоресценционной микроскопией

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Количественная оценка конформационных изменений в отдельных биомолекулярах под потоком снофа полезна для понимания функции и биофизики макромолекул, таких как белок и ДНК. Микроскопия флуоресценции позволяет в режиме реального времени на месте визуализировать отдельные молекулы в условиях физиологического потока с высоким временным и пространственным разрешением. Это не имеет себе равных по другим методам, как AFM.Характеризовав силу стрижки, под которой белки нашей ДНК имеют глобальные конформационные изменения, можно лучше разрабатывать препараты, имитирующие эти биофизические свойства. Этот протокол может быть широко применен для изучения поведения или других полимеров, особенно био полимеров, в различных условиях потока и для исследования реологии сложных жидкостей. Сроки шагов имеет решающее значение для успеха.Мы предлагаем практиковать микрофлюидное устройство обработки поверхности и флуоресценции микроскопии шаги много раз, чтобы выполнить их эффективным способом. Захват конформациальных изменений в биомолекулах является визуальным и динамичным явлением, которое лучше всего рассматривать на пленке. Ученые лучше поймут этот метод, увидев в режиме реального времени белок и микроскопию ДНК, представленную в этом видео.Чтобы подготовить микрофлюидное устройство, добавьте пять частей силиконовой базы еластомера к одной части лечебного агента в взвешенной лодке. и тщательно перемешать содержимое в течение одной минуты, чтобы создать предварительно вылеченное решение PDMS. Поместите мастер кремниевых пластин в пластиковой чашке Петри и залить PDMS раствор над пластиной, чтобы создать пятимиллиметровый слой.Обложка блюдо и оставить его в desiccator под вакуумом в течение одного часа, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем инкубировать покрытые чашки Петри на 60 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вылечить PDMS в гибкую твердую, что приведет к микрофлюидных каналов формируется в PDMS на интерфейс пластин PDMS. На следующий день используйте бритву, чтобы сократить 20 на 10 миллиметров прямоугольники вокруг каждого микрофлюидного канала в PDMS и удалить прямоугольные блоки с пинцетом.Используйте 25-калибровочный тупой конец иглы с заточенными краями, чтобы пробить отверстие диаметром 0,5 миллиметра на одном конце канала, убедившись, что отверстие проходит полностью через блок PDMS. Используйте тонкую иглу, чтобы пробить PDMS из отверстия и повторить процесс на другом конце канала. Поместите блок PDMS с боковой стороной канала вверх и крышкой в камеру плазменной склеивания машины и начать лечение.Когда лечение завершено, быстро поместите блок PDMS на крышку, так что канал находится в контакте с скольжения. Нанесите давление на края блока, затем поместите сборку крышки PDMS на горячую пластину при 115 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы укрепить постоянную связь. Наконец, вставьте 10-сантиметровую длину.0,25 миллиметра трубки внутреннего диаметра в отверстие розетки в верхней части блока PDMS, чтобы жидкость легко вытекать из канала. Для фактора фон Виллебранда или экспериментов VWF вводят до 10 микролитров по 10 микрограмм на миллилитр BSA-Biotin, растворенный в стерильном 1X PBS, в вход микрофлюидного устройства. Утаить несколько микролитров BSA-Biotin в кончике пипетки после инъекции и позволить кончику оставаться встроенным в входе.Разрешить BSA-Biotin инкубировать в устройстве в течение двух часов, что приведет к BSA не специально связывания с поверхностью крышки. Затем снимите наконечник пипетки и ввелите в канал до 10 микролитров раствора блокировки тактина. Разрешить рафин решение инкубировать в течение 30 минут, чтобы он может блокировать любые свободные сайты и уменьшить неспецифическое связывание биомолекул на поверхность.Удалите наконечник и ввилите до 10 микролитров стрептавидина в стерильный PBS в канал, который будет связываться с биотин групп BSA-biotin. Затем ввимите до 10 микролитров моющего раствора, чтобы смыть лишний стрептавидин. Удалите наконечник и ввилите либо VWF в случае раствора или ДНК лямбды.Инкубировать VWF в течение трех минут или ДНК лямбды в течение 45 минут. Затем ввисьйте пять миллимоляр свободного биотина, чтобы заблокировать избыток стрептавидина связывающих участков. Загрузите один миллилитр таксин, блокирующий раствор, в шприц и закрелите его в шприц-насосе.Затем прикрепите один конец трубки к шприцу иглы и поток в растворе, чтобы удалить пузырьки воздуха. Примерно через три минуты после бесплатной инъекции биотина прикрепите другой конец трубки к входу микрофлюидного устройства. Выберите наивысшую цель увеличения TIRF или конфокального флуоресцентный микроскоп.При необходимости добавьте каплю масла погружения на цель. Поместите микрофлюидное устройство на сцену микроскопа так, чтобы обложка была заподлицо с целью. Начните микроскопию яркого поля и отрегулируйте фокус так, чтобы были видны такие объекты, как мусор и пузыри.Затем отрегулируйте сцену в направлениях X и Y до тех пор, пока не будет виден край микрофлюидного канала и не будет разделена на рамку. Переключитесь на канал FITC и отрегулируйте угол q и TIRF по мере необходимости до тех пор, пока не будут различимы отдельные зеленые шаровые молекулы. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции, чтобы визуализировать флуоресцентные молекулы без их слишком быстрого фотоотбела.Затем отрегулируйте контраст, чтобы лучше визуализировать молекулы. Ровно через пять минут после начала бесплатной инъекции биотина и остановки потока из шприца насоса, чтобы наблюдать изменения в молекулярной конформации с использованием потока ставки между 5000 и 30000 микролитров в час. С VWF очень важно применять по крайней мере небольшое количество потока, например, 30 секунд 10 000 микролитров в час потока ровно через пять минут после бесплатной инъекции биотина.Повторите это во всех различных областях микрофлюидного устройства и найти молекулы, которые могут расширить и расслабиться на несколько циклов запуска и остановки потока. Обратите внимание, сколько времени требуется молекулам, чтобы достичь максимального расширения и полного расслабления и записывать видео непрерывного поведения молекул под потоком стрижки. Гибкость молекулы для изменения подтверждения часто демонстрируется его способностью удлиняться по мере того, как более высокие скорости снора применяются из-за увеличения потока.Расширение по сравнению с кривой скорости снопы молекулы фактора фон Виллебранда полезно для характеристики биомеханических свойств белка. Флуоресценция микроскопии изображения ДНК lambda аналогичным образом показывают увеличение расширения на более высокие скорости стрижки на 30 секунд и постепенное расслабление в течение двух минут после того, как поток остановлен. При работе с VWF, не забудьте инкубировать его только в течение трех минут и бесплатный биотин в течение пяти минут до начала потока.Это имеет решающее значение для формирования оптимального числа или биотин-стрептавидин связей, необходимых для обратимого распутывания. Этот метод может быть адаптирован для визуализации взаимодействия в режиме реального времени между несколькими биомолекулами и характеристики их функций. Например, можно было бы лучше понять образование свечи тромбоцитов, визуализируя VWF распутывание под высоким снофом и его связывание с молекулой адгезии тромбоцитов GPIb-альфа с помощью этого метода.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Свечение резонанс переноса энергии по изучению конформационных изменений мембранных белков выражается в клетках млекопитающих

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Фотоактивированные Локализация микроскопия с Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Этикетка без одной молекулы обнаружения, используя Microtoroid оптических резонаторов

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...