Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias DMS-1463234, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL082808 y AI133634, y la financiación interna de la Universidad de Lehigh.

1. Preparación de La VWF
<ol><li>Reconstituir el VWF de plasma humano para prepararlo para las reacciones de etiquetado. Añadir 100 l de agua desionizada (DI) a 100 g de FVW liofilizado para crear una solución de stock de VWF de 1 mg/ml.</li>
	<li>Solución de stock dialíze VWF para eliminar el exceso de glicina, aumentando así la eficiencia de etiquetado de biotina y fluoróforo.<ol>
<li>Transfiera 50 ml de solución de material DeVWF a una unidad de diálisis de 0,1 ml con un corte de peso molecular de 10.000 y ...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Para obtener datos de alta calidad de cambios de conformación de una sola molécula utilizando la microscopía de fluorescencia como se describe en este método, es fundamental incubar la molécula durante el tiempo adecuado, minimizar sus interacciones inespecíficas con la superficie y establecer ajustes de microscopio que reduzcan el fotoblanqueo. La capacidad de la molécula para cambiar libremente la conformación está relacionada con el número de interacciones biotina-estreptavidina formadas entre la molécula y...

Se han estudiado ampliamente los mecanismos de cómo las biomoléculas responden a los estímulos ambientales. En un entorno de flujo en particular, las fuerzas de cizallamiento y elongacional regulan los cambios de conformación y potencialmente la función de las biomoléculas. Ejemplos típicos incluyen el desenmarañamiento inducido por cizallamiento del ADN lambda y el factor von Willebrand (VWF). Lambda DNA se ha utilizado como herramienta para comprender la dinámica conformacional de las cadenas de polímeros individuales y flexibles y la reología de las soluciones poliméricas1,2,3,4. El VWF es un sensor de flujo natural que agrega plaquetas en los sitios de las heridas de los vasos sanguíneos con tasas de cizallamiento y patrones de flujo anormales. El desenmarañamiento de VWF es esencial para activar la unión de plaquetas al dominio A1 y la unión de colágeno al dominio A3. Además, el desdoblamiento del dominio A2 inducido por alto cizallamiento permite el escisión del VWF, que regula su distribución del peso molecular en la circulación5,6. Por lo tanto, la visualización directa de cómo estas moléculas se comportan bajo el flujo puede mejorar en gran medida nuestra comprensión fundamental de su biomecánica y función, lo que a su vez puede permitir nuevas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
Las metodologías típicas para caracterizar las conformaciones de una sola molécula incluyen pinzas ópticas/magnéticas, microscopía de fuerza atómica (AFM) y transferencia de energía de resonancia de una sola molécula (FRET)7. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula es una poderosa herramienta para investigar la fuerza y el movimiento asociados con los cambios de conformación de las biomoléculas. Sin embargo, carece de la capacidad de mapear las conformaciones moleculares generales8. AFM es capaz de crear imágenes con alta resolución espacial, pero está limitada en resolución temporal9,10. Además, el contacto entre la punta y la muestra puede confundir la respuesta inducida por el flujo. Otros métodos como el FRET y el análisis de nanoporos determinan los estados de plegado y despliegue de proteínas de una sola molécula en función de la detección de la distancia intramolecular y los volúmenes excluidos. Sin embargo, estos métodos todavía están en su infancia y limitados en su observación directa de las conformaciones de una sola molécula11,12,13,14.
Por otro lado, observar directamente macromoléculas con alta resolución temporal y espacial bajo microscopía de fluorescencia ha mejorado nuestra comprensión de la dinámica de una sola molécula en muchos procesos biológicos15,16. Por ejemplo, Fu y otros lograron recientemente la visualización simultánea del alargamiento VWF y la unión del receptor de plaquetas por primera vez. En su trabajo, las moléculas de VWF fueron inmovilizadas en la superficie de un canal microfluídico a través de interacciones biotina-estreptavidina e imágenes bajo microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) en diferentes ambientes de flujo de cizallamiento17. Aplicando un método similar al de Fu, aquí demostramos que las conformaciones de VWF y ADN lambda se pueden observar directamente bajo TIRF y microscopía de fluorescencia confocal. Como se muestra en la Figura 1,los dispositivos microfluídicos se utilizan para crear y controlar el flujo de cizallamiento, y las biomoléculas se inmovilizan en la superficie del canal. Tras la aplicación de diferentes tasas de cizallamiento, se registran conformaciones de la misma molécula para medir la longitud de la extensión, también se muestra en la Figura 1. El método podría aplicarse ampliamente para explorar otros comportamientos de polímeros en entornos de flujo complejos para estudios reológicos y biológicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

El comportamiento de una sola molécula bajo perturbación mecánica se ha caracterizado ampliamente para entender muchos procesos biológicos. Sin embargo, métodos como la microscopía de fuerza atómica tienen una resolución temporal limitada, mientras que la transferencia de energía por resonancia de ferster (FRET) solo permite deducir las conformaciones. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en diversas condiciones de flujo. Nuestro protocolo describe los pasos para capturar los cambios de conformación de biomoléculas individuales en diferentes entornos de flujo de cizallamiento mediante microscopía de fluorescencia. El flujo de cizallamiento se crea dentro de canales microfluídicos y se controla mediante una bomba de jeringa. Como demostraciones del método, el factor von Willebrand (VWF) y el ADN lambda están etiquetados con biotina y fluoróforo y luego se inmovilizan en la superficie del canal. Sus conformaciones se monitorean continuamente bajo flujo de cizallamiento variable utilizando la reflexión interna total (TIRF) y la microscopía de fluorescencia confocal. La dinámica reversible de desenmaraña de VWF es útil para entender cómo su función está regulada en la sangre humana, mientras que la conformación del ADN lambda ofrece información sobre la biofísica de las macromoléculas. El protocolo también se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento de los polímeros, especialmente los biopolímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos.

Observar el comportamiento dinámico de biomoléculas como El VWF y el ADN lambda depende en gran medida de optimizar su unión a la superficie del dispositivo. Incubar tratamientos superficiales para los tiempos recomendados en el dispositivo microfluídico es crucial para obtener la unión con algunos puntos de anclaje, de modo que las moléculas puedan extenderse libremente y relajarse al cambiar de flujo. Si las proteínas o el ADN están unidos demasiado fuertemente con múltiples enlaces, se extenderán a longitude...

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Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Presentamos un protocolo para inmovilizar macromoléculas individuales en dispositivos microfluídicos y cuantificar los cambios en sus conformaciones bajo el flujo de cizallamiento. Este protocolo es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas y funcionales de biomoléculas como proteínas y ADN en un entorno de flujo.

Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Cuantificar los cambios conformacionales en biomoléculas individuales bajo flujo de cizallamiento es útil para entender la función y la biofísica de las macromoléculas como la proteína y el ADN. La microscopía de fluorescencia permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en entornos de flujo fisiológico con alta resolución temporal y espacial. Esto no tiene comparación con otras técnicas como AFM.Al caracterizar la fuerza de cizallamiento bajo la cual las proteínas nuestro ADN tienen cambios conformacionales globales, uno puede diseñar mejor fármacos que imitan estas propiedades biofísicas. Este protocolo se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento u otros polímeros, especialmente biomé polímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos. El momento de los pasos es fundamental para el éxito.Sugerimos practicar el tratamiento de la superficie del dispositivo microfluídico y los pasos de la microscopía de fluorescencia muchas veces para ejecutarlos de una manera eficiente. Capturar los cambios conformacionales en las biomoléculas es un fenómeno visual y dinámico mejor visto en el cine. Los científicos comprenderán mejor este método después de ver la microscopía de proteína y ADN en tiempo real presentada en este video.Para preparar el dispositivo microfluídico, agregue cinco partes de la base de elastómero de silicona a un agente de curado de una parte en un bote de pesaje. y remueva el contenido a fondo durante un minuto para crear una solución PDMS precurada. Coloque la oblea de silicio maestro en un plato de Petri de plástico y vierta la solución PDMS sobre la oblea para crear una capa de cinco milímetros.Cubra el plato y déjelo en un desecador al vacío durante una hora para eliminar las burbujas de aire. Luego incuba el plato De Petri cubierto a 60 grados Celsius durante la noche para curar el PDMS en un sólido flexible, lo que resultará en canales microfluídicos siendo moldeados en el PDMS en la interfaz de oblea PDMS. Al día siguiente, utilice una maquinilla de afeitar para cortar rectángulos de 20 por 10 milímetros alrededor de cada canal microfluídico en el PDMS y quitar los bloques rectangulares con pinzas.Utilice una aguja de extremo contundente de calibre 25 con bordes afilados para perforar un agujero de 0,5 milímetros de diámetro en un extremo del canal, asegurándose de que el agujero pasa completamente a través del bloque PDMS. Utilice una aguja delgada para perforar el PDMS fuera del agujero y repetir el proceso en el otro extremo del canal. Coloque el bloque PDMS con el lado del canal hacia arriba y el cubreobjetos en la cámara de una máquina de unión de plasma e inicie el tratamiento.Una vez completado el tratamiento, coloque rápidamente el bloque PDMS en un cubreobjetos para que el canal esté en contacto con el resbalón. Aplique presión en los bordes del bloque y, a continuación, coloque el conjunto PDMS de contracción en una placa caliente a 115 grados Celsius durante 15 minutos para reforzar la unión permanente. Finalmente, inserte un 10 centímetros de largo.Tubo de 0,25 milímetros de diámetro interior en el orificio de salida en la parte superior del bloque PDMS para permitir que el fluido fluya fácilmente fuera del canal. Para experimentos con factor von Willebrand o VWF, inyectan hasta 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro BSA-Biotin disuelto en 1X PBS estéril en la entrada del dispositivo microfluídico. Retenga unos microlitros de BSA-Biotin en la punta de la pipeta después de la inyección y permita que la punta permanezca incrustada en la entrada.Permita que la BSA-Biotina se incuba en el dispositivo durante dos horas, lo que dará lugar a la unión de BSA no específicamente a la superficie del cubreobjetos. A continuación, retire la punta de la pipeta e inyecte hasta 10 microlitros de solución de bloqueo de caseína en el canal. Permita que la solución de caseína se incuba durante 30 minutos para que pueda bloquear cualquier sitio libre y reducir la unión inespecífico de las biomoléculas a la superficie.Retire la punta e inyecte hasta 10 microlitros de estreptavidina en PBS estéril en el canal, que se unirán a los grupos de biotina de la BSA-Biotina. A continuación, inyecte hasta 10 microlitros de solución detergente para eliminar el exceso de estreptavidina. Retire la punta e inyecte VWF en solución de caseína o ADN lambda.Incubar el VWF durante tres minutos o ADN lambda durante 45 minutos. A continuación, inyecte cinco biotina libre de mililitros para bloquear el exceso de sitios de unión a estreptavidina. Cargue un mililitro de solución de bloqueo de caseína en una jeringa y fíjela en una bomba de jeringa.A continuación, conecte un extremo del tubo a la aguja de la jeringa y fluya en la solución para eliminar las burbujas de aire. Aproximadamente tres minutos después de la inyección de biotina libre, conecte el otro extremo del tubo a la entrada del dispositivo microfluídico. Seleccione el objetivo de aumento más alto del microscopio TIRF o fluorescencia confocal.Si es necesario, añada una gota de aceite de inmersión en el objetivo. Coloque el dispositivo microfluídico en la etapa del microscopio para que el cubreobjetos esté al ras del objetivo. Inicie la microscopía de campo brillante y ajuste el enfoque para que funciones como desechos y burbujas sean visibles.A continuación, ajuste el escenario en las direcciones X e Y hasta que el borde del canal microfluídico sea visible y bisects el marco. Cambie al canal FITC y ajuste el nivel Z y el ángulo TIRF según sea necesario hasta que se puedan distinguir las moléculas globulares verdes individuales. Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para visualizar moléculas fluorescentes sin fotoblanquearlas demasiado rápido.A continuación, ajuste el contraste para visualizar mejor las moléculas. Exactamente cinco minutos después de la inyección libre de biotina iniciar y detener el flujo de la bomba de la jeringa para observar los cambios en la conformación molecular utilizando caudales entre 5000 y 30 000 microlitros por hora. Con VWF es fundamental aplicar al menos una pequeña cantidad de flujo, como 30 segundos de 10.000 microlitros por hora fluyen exactamente cinco minutos después de la inyección gratuita de biotina.Repita esto en varias áreas del dispositivo microfluídico y localice moléculas que puedan extenderse y relajarse en múltiples ciclos de flujo de arranque y parada. Tenga en cuenta cuánto tiempo tardan las moléculas en alcanzar la máxima extensión y completar la relajación y grabar videos del comportamiento continuo de las moléculas bajo flujo de cizallamiento. La flexibilidad de una molécula para cambiar la confirmación a menudo se demuestra por su capacidad de alargarse a medida que se aplican tasas de cizallamiento más altas debido al aumento del flujo.La curva de extensión frente a la velocidad de cizallamiento de una molécula de factor von Willebrand es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas de la proteína. Las imágenes de microscopía de fluorescencia del ADN lambda muestran de manera similar una mayor extensión sobre tasas de cizallamiento más altas a los 30 segundos y relajación gradual durante dos minutos después de detener el flujo. Cuando trabaje con VWF, recuerde incubarlo solo durante tres minutos y liberar biotina durante cinco minutos antes de iniciar el flujo.Esto es fundamental para formar el número óptimo o los enlaces de biotina-estreptavidina necesarios para el desenmarañado reversible. Este método se puede adaptar para visualizar interacciones en tiempo real entre múltiples biomoléculas y caracterizar sus funciones. Por ejemplo, se podría entender mejor la formación de tapones plaquetario visualizando el VWF desentrañando bajo alta cizalladura y su unión con la molécula de adhesión plaquetaria GPIb-alpha con este método.

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High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

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Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...