Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av en National Science Foundation bevilja DMS-1463234, National Institutes of Health bidrag HL082808 och AI133634, och Lehigh University intern finansiering.

1. Förbereda VWF
<ol><li>Rekonstituera human plasma VWF för att förbereda den för märkning reaktioner. Tillsätt 100 μL avjoniserat vatten (DI) vatten till 100 μg frystorkad VWF för att skapa en 1 mg/ml VWF-stamlösning.</li>
	<li>Dialyze VWF stamlösning för att ta bort överskott glycin, vilket ökar biotin och fluorofor märkning effektivitet.<ol>
<li>Överför 50 μl VWF-stamlösning till en 0,1 ml dialysenhet med en 10 000 molekylviktsavstängning och tätning med lock. Förvara den återstående lagerlö...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

För att få högkvalitativa data av konformationsförändringar av enmolekyl med fluorescensmikroskopi enligt beskrivningen i denna metod är det viktigt att inkubera molekylen under lämplig tid, minimera dess ospecifika interaktioner med ytan och fastställa mikroskopinställningar som minskar fotoblekning. Molekylens förmåga att fritt ändra konformation är relaterad till antalet interaktioner mellan biotinstreptavidin som bildas mellan molekylen och ytan. Som tidigare nämnts måste detta kontrolleras genom att i...

Mekanismer för hur biomolekyler reagerar på miljöstimuli har studerats brett. I en flödesmiljö i synnerhet reglerar skjuvning och långsträckningskrafter konformationsförändringarna och potentiellt biomolekylernas funktion. Typiska exempel är skjuvning-inducerad upplösning av lambda DNA och von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA har använts som ett verktyg för att förstå konformationsdynamiken hos enskilda, flexibla polymerkedjor och reologi av polymerlösningar1,2,3,4. VWF är en naturlig flödessensor som aggregerar blodplättar på sårplatser av blodkärl med onormal skjuvning och flödesmönster. Reda ut VWF är viktigt för att aktivera bindningen av blodplättar till A1-domänen och kollagenbindning till A3-domänen. Dessutom tillåter hög skjuvning-inducerad A2 domän utspelar sig klyvning av VWF, som reglerar dess molekylära viktfördelning i omlopp5,6. Således kan direkt visualisering av hur dessa molekyler bete sig under flöde avsevärt förbättra vår grundläggande förståelse för deras biomekanik och funktion, vilket i sin tur kan möjliggöra nya diagnostiska och terapeutiska tillämpningar.
Typiska metoder för att karakterisera enmolekylkonformationer inkluderar optiska/magnetiska pincett, atomkraftmikroskopi (AFM) och enmolekyl Förster resonans energiöverföring (FRET)7. Enmolekylkraftspektroskopi är ett kraftfullt verktyg för att undersöka kraften och rörelsen i samband med de konformationella förändringarna av biomolekyler. Den saknar dock förmågan att kartlägga övergripande molekylära konformationer8. AFM kan avbildning med hög rumslig upplösning men är begränsad i tidsupplösning9,10. Dessutom kan kontakten mellan spetsen och provet förvirra svaret som induceras av flöde. Andra metoder som FRET och nanopore analytics bestämma enmolekyl protein vikning och utfällbara tillstånd baserat på detektion av intramolekylära avstånd och uteslutna volymer. Dessa metoder är dock fortfarande i sin linda och begränsad i sin direkta observation av enmolekylkonformationer11,12,13,14.
Å andra sidan har direkt observera makromolekyler med hög tidsmässig och rumslig upplösning under fluorescensmikroskopi förbättrat vår förståelse av enmolekyldynamik i många biologiska processer15,16. Till exempel, Fu et al. nyligen uppnått samtidig visualisering av VWF förlängning och trombocytreceptorbindning för första gången. I sitt arbete, VWF molekyler var immobiliserade på ytan av en mikrofluidisk kanal genom biotin-streptavidin interaktioner och avbilds under total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi vid varierande skjuvning flöde miljöer17. Tillämpa en liknande metod som Fu's, visar vi här att konformationer av VWF och lambda DNA kan observeras direkt under både TIRF och confocal fluorescens mikroskopi. Som visas i figur 1används mikrofluidiska enheter för att skapa och kontrollera skjuvningsflödet, och biomolekyler na immobiliseras på kanalytan. Vid applicering av varierande skjuvningsfrekvens registreras konformationer av samma molekyl för att mäta förlängningslängden, som också visas i figur 1. Metoden kan användas i stor utsträckning för att utforska andra polymerbeteenden under komplexa flödesmiljöer för både reologiska och biologiska studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Enmolekylsbeteende under mekanisk störning har karakteriserats brett för att förstå många biologiska processer. Metoder som atomkraftmikroskopi har dock begränsad tidsupplösning, medan Förster resonansenergiöverföring (FRET) endast gör det möjligt att dra slutsatsen att konformationer härleds. Fluorescensmikroskopi, å andra sidan, möjliggör realtidsinsitu visualisering av enstaka molekyler i olika flödesförhållanden. Vårt protokoll beskriver stegen för att fånga konformationella förändringar av enskilda biomolekyler under olika skjuvflödesmiljöer med fluorescensmikroskopi. Skjuvflödet skapas inuti mikrofluidiska kanaler och styrs av en sprutpump. Som demonstrationer av metoden, von Willebrand faktor (VWF) och lambda DNA är märkta med biotin och fluorofor och sedan immobiliseras på kanalytan. Deras konformationer övervakas kontinuerligt under variabelsk skjuvningsflöde med hjälp av total inre reflektion (TIRF) och konfokal fluorescensmikroskopi. Den reversibla unraveling dynamikVWF är användbara för att förstå hur dess funktion regleras i mänskligt blod, medan konformationen av lambda DNA ger insikter i biofysik makromolekyler. Protokollet kan också tillämpas i stor utsträckning för att studera polymerernas beteende, särskilt biopolymerer, i varierande flödesförhållanden och undersöka reologi av komplexa vätskor.

Observera det dynamiska beteendet hos biomolekyler som VWF och lambda DNA är starkt beroende av att optimera deras bindning till enhetens yta. Att inkubera ytbehandlingar för de rekommenderade tiderna i den mikrofluidiska enheten är avgörande för att få bindning med några förankringspunkter, så att molekyler na fritt kan sträcka sig och slappna av vid förändrade flöde. Om proteinerna eller DNA är bundna för starkt med flera kopplingar, kommer de antingen att sträcka sig till begränsade längder eller int...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Vi presenterar ett protokoll för att immobilisera enskilda makromolekyler i mikrofluidiska enheter och kvantifiera förändringar i deras konformationer under skjuvningsflöde. Detta protokoll är användbart för att karakterisera biomekaniska och funktionella egenskaper biomolekyler såsom proteiner och DNA i en flödesmiljö.

Karaktäriserande konformationsförändringar med en molekyl under skjuvningsflöde med fluorescensmikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Kvantifiera konformationella förändringar i enstaka biomolekyler under skjuvning flöde är användbart för att förstå funktion och biofysik makromolekyler som protein och DNA. Fluorescensmikroskopi tillåter realtidsvis visualisering av enstaka molekyler i fysiologiska flödesmiljöer med hög temporal och rumslig upplösning. Detta är oöverträffad av andra tekniker som AFM.Genom att karaktärisera skjuvkraften under vilken proteiner vårt DNA har globala konformationella förändringar, kan man bättre designa läkemedel som efterliknar dessa biofysiska egenskaper. Detta protokoll kan tillämpas allmänt för att studera beteendet eller andra polymerer, särskilt bio polymerer, i varierande flödesförhållanden och att undersöka reologi av komplexa vätskor. Tidpunkten för åtgärder är avgörande för framgång.Vi föreslår att öva mikrofluidic enheten ytbehandling och fluorescens mikroskopi steg många gånger för att utföra dem på ett effektivt sätt. Fånga konformationella förändringar i biomolekyler är ett visuellt och dynamiskt fenomen som bäst ses på film. Forskare kommer att bättre förstå denna metod efter att ha sett realtidprotein och DNA-mikroskopi presenteras i denna video.För att förbereda den mikrofluidiska enheten, tillsätt fem delar av silikon elastomer bas till en del härdningsmedel i en väga båt. och rör om innehållet ordentligt i en minut för att skapa en förhärdad PDMS-lösning. Placera befälhavaren kisel wafer i en plast Petriskål och häll PDMS lösningen över rån för att skapa en fem-millimeters lager.Täck skålen och lämna den i en exsiccator under vakuum i en timme för att ta bort luftbubblor. Sedan inkubera den täckta Petriskålen vid 60 grader Celsius över natten för att bota PDMS till en flexibel fast, vilket kommer att resultera i mikrofluidiska kanaler som formas in i PDMS på PDMS wafer gränssnitt. På nästa dag, använd en rakhyvel för att skära 20 av 10 millimeter rektanglar runt varje mikrofluidisk kanal i PDMS och ta bort de rektangulära block med pincett.Använd en 25-gauge trubbig ändnål med slipade kanter för att slå ett hål med 0,5 millimeters diameter i ena änden av kanalen, och se till att hålet går helt genom PDMS-blocket. Använd en tunn nål för att slå fram PDMS ur hålet och upprepa processen i andra änden av kanalen. Placera PDMS-blocket med kanalsidan uppåt och täckmarken in i kammaren på en plasmabindningsmaskin och starta behandlingen.När behandlingen är klar, placera snabbt PDMS-blocket på ett täckslip så att kanalen är i kontakt med snedsteget. Applicera tryck på kanten av blocket, placera sedan täckplattan PDMS församling på en värmeplatta på 115 grader Celsius i 15 minuter för att förstärka den permanenta bindningen. Slutligen sätter du in en 10 centimeter lång.0,25 millimeter innerdiameter rör in i utloppshålet överst på PDMS-blocket för att vätska lätt ska kunna flöda ut ur kanalen. För von Willebrand faktor eller VWF experiment injicera upp till 10 mikroliter av 10 mikrogram per milliliter BSA-Biotin upplöst i steril 1X PBS i inloppet av mikrofluidiska enheten. Hålla inne några mikroliter av BSA-Biotin i pipettspetsen efter injektion och låt spetsen förbli inbäddad i inloppet.Låt BSA-Biotin inkubera i enheten i två timmar vilket kommer att resultera i BSA icke-specifikt bindande för täckunderlaget. Ta sedan ut pipettspetsen och injicera upp till 10 mikroliter av spärrlösningen för fallin i kanalen. Låt caseinlösningen inkubera i 30 minuter så att den kan blockera alla fria platser och minska ospecifik bindning av biomolekylerna till ytan.Ta bort spetsen och injicera upp till 10 mikroliter streptavidin i steril PBS i kanalen, vilket kommer att binda till biotingrupperna i BSA-Biotin. Därefter injicera upp till 10 mikroliter av tvättmedelslösning för att tvätta bort överflödigt streptavidin. Ta bort spetsen och injicera antingen VWF i caseinlösning eller lambda DNA.Inkubera VWF i tre minuter eller lambda-DNA i 45 minuter. Injicera sedan fem millimolar fritt biotin för att blockera de överskjutande streptavidinbindningsställena. Fyll på en milliliter av ralinblockeringslösning i en spruta och säkra den i en sprutpump.Fäst sedan ena änden av slangen på sprutnålen och flöda i lösningen för att avlägsna luftbubblor. Cirka tre minuter efter den fria biotininjektionen fäster den andra änden av röret på inloppet till den mikrofluidiska enheten. Välj den högsta förstoringsmålet för TIRF eller confocal fluorescence mikroskop.Om det behövs, tillsätt en droppe nedsänkning olja på målet. Placera den mikrofluidiska enheten på mikroskopstadiet så att täckfärgen är i jämnhöjd med målsättningen. Starta ljusfältsmikroskopi och justera fokus så att funktioner som skräp och bubblor syns.Justera sedan scenen i riktningen X och Y tills kanten på den mikrofluidiska kanalen är synlig och bisects ramen. Byt till FITC-kanalen och justera Z-nivå och TIRF-vinkel efter behov tills de enskilda gröna klotformiga molekylerna kan särskiljas. Justera laserintensitet och exponeringstid för att visualisera fluorescerande molekyler utan att fotobleaching dem för snabbt.Justera sedan kontrasten för att bättre visualisera molekylerna. Exakt fem minuter efter fri biotininsprutning start och stopp flöde från sprutan pumpen att observera de förändringar i molekylär konformation med hjälp av flödeshastigheter mellan 5000 och 30, 000 mikroliter per timme. Med VWF är det viktigt att applicera minst en liten mängd flöde, såsom 30 sekunder på 10, 000 mikroliter per timme flöde exakt fem minuter efter fri biotin injektion.Upprepa detta i olika områden av mikrofluidiska enheten och lokalisera molekyler som kan förlänga och koppla av på flera cykler av start och stopp flöde. Notera hur lång tid det tar för molekyler att nå maximal förlängning och fullständig avkoppling och spela in videor av det kontinuerliga beteendet hos molekyler under skjuvningsflöde. Flexibiliteten hos en molekyl för att ändra bekräftelse framgår ofta av dess förmåga att förlänga som högre skjuvhastighet tillämpas på grund av ökande flöde.Förlängningen kontra skjuvhastighetskurvan för en von Willebrand-faktormolekyl är användbar för att karakterisera proteinets biomekaniska egenskaper. Fluorescens mikroskopi bilder av lambda DNA på samma sätt visar ökad förlängning på högre skjuvhastighet på 30 sekunder och gradvis avkoppling under två minuter efter flödet stoppas. När du arbetar med VWF, kom ihåg att inkubera det bara i tre minuter och fritt biotin i fem minuter innan du börjar flödet.Detta är avgörande för att bilda det optimala antalet eller biotin-streptavidin länkar som behövs för reversibel nysta upp. Denna metod kan anpassas för att visualisera realtidsinteraktioner mellan flera biomolekyler och karakterisera deras funktioner. Till exempel kunde man bättre förstå blodplättar pluggbildning genom att visualisera VWF reda ut under hög skjuvning och dess bindning med trombocytadhesionsmolekylen GPIb-alfa med denna metod.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallell-platta Flow avdelningen och kontinuerligt Circuit att utvärdera Endothelial stamceller i laminärt flöde Shear stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Skapa Lim och lösliga övertoningar för Imaging cellmigration med fluorescensmikroskopi

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Undersöka Receptor-ligand System av Cellulosome med AFM-baserad Single-molekyl Force spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminiscens Resonance Energy Transfer att studera strukturförändringar i membranproteiner i däggdjursceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Fotoaktiverat Lokalisering Mikroskopi med Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enda molekyl fluorescensmikroskopi på Planar bilayers stöds

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Utforma mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svaren Under Singel eller samexisterande Chemical / Elektrisk / Shear stresstimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...