Name: characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı hibe DMS-1463234, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL082808 ve AI133634 hibe ve Lehigh Üniversitesi iç finansman tarafından desteklenmiştir.

1. VWF Hazırlama
<ol><li>Etiketleme reaksiyonları için hazırlamak için insan plazmavwf yeniden. 1 mg/mL VWF stok çözeltisi oluşturmak için 100 μL deiyonize (DI) suyu 100 μg lyophilized VWF ekleyin.</li>
	<li>Aşırı glisini gidermek için VWF stok çözeltisini diyalize çevirin, bu nedenle biyotin ve florofor etiketleme verimliliğini artırın.<ol>
<li>VWF stok çözeltisinin 50 μL'sini 10.000 moleküler ağırlık kesme ve kapaklı mühürleme ile 0,1 mL diyaliz ünitesine aktarın. Kalan stok çözelti...

<ol>
	<li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow.">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li><li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow.">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li><li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow.">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li><li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kr&#246;ger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime.">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers.">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations.">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor.">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li><li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface:+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains.">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li><li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET,+NMR,+and+SAXS.">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li><li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET.">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li><li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+analytics:+sensing+of+single+molecules.">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy.">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li><li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells.">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation.">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li><li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overstretching+B-DNA:+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules.">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor.">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).</li><li>Carlsson, C., Johnsson, M., &#197;kerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+Novel+tools+for+imaging+protein&#8211;nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: Novel tools for imaging protein&#8211;nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Bu yöntemde açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanılarak tek moleküllü konformasyonel değişikliklerin yüksek kaliteli veri elde etmek için, molekülü uygun süre için kuluçkaya yatırmak, yüzeyle nonspesifik etkileşimlerini en aza indirmek çok önemlidir. ve fotobeyaztlamayı azaltan mikroskop ayarlarını kurun. Molekülün konformasyonu serbestçe değiştirebilme yeteneği, molekül ile yüzey arasında oluşan biyotin-streptavidin etkileşimlerinin sayısı ile ilgilidir. Daha önce de belirti...

Biyomoleküllerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verecek mekanizmaları geniş ölçüde incelenmiştir. Özellikle bir akış ortamında, kesme ve uzama kuvvetleri konformasyonel değişiklikleri ve potansiyel olarak biyomoleküllerin işlevini düzenler. Tipik örnekler lambda DNA ve von Willebrand faktörü (VWF) kesme kaynaklı çözülme içerir. Lambda DNA bireysel, esnek polimer zincirleri ve polimer çözeltileri1,2,3,4reolojikonformasyon dinamikleri anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır. VWF anormal kesme hızları ve akış desenleri ile kan damarlarının yara sitelerinde trombositler toplar doğal bir akış sensörüdür. VWF'nin çözülmesi, trombositlerin A1 etki alanına ve kollajenin A3 etki alanına bağlanmasını aktive etmek için gereklidir. Buna ek olarak, yüksek makas kaynaklı A2 etki alanı açılmak VWF dekolte sağlar, hangi dolaşımda moleküler ağırlık dağılımı nı düzenleyen5,6. Böylece, bu moleküllerin akış altında nasıl hareket ettiklerine doğrudan görselleştirme, biyomekanik ve işlevleri ne kadar temel anlayışlarımızı geliştirebilir, bu da yeni tanı ve tedavi uygulamaları sağlayabilir.
Tek moleküllü konformasyonları karakterize eden tipik metodolojiler arasında optik/manyetik cımbız, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (FRET)7sayılabilir. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi biyomoleküllerin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili kuvvet ve hareketi araştırmak için güçlü bir araçtır. Ancak, genel moleküler konformasyonlar8harita yeteneği yoksun. AFM yüksek uzamsal çözünürlükile görüntüleme yeteneğine sahiptir ancak zamansal çözünürlük9sınırlıdır ,10. Buna ek olarak, uç ve örnek arasındaki temas akış tarafından indüklenen yanıt ı bozabilir. FRET ve nanopore analitiği gibi diğer yöntemler, moleküler mesafe ve dışlanmış hacimlerin tespitine dayalı olarak tek moleküllü protein katlama ve açılma durumlarını belirler. Ancak, bu yöntemler hala emekleme döneminde ve tek moleküllü konformasyonlar onların doğrudan gözlem sınırlıdır11,12,13,14.
Öte yandan, floresan mikroskopisi altında yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip makromoleküllerin doğrudan gözlemlenmesi, birçok biyolojik süreçte tek moleküllü dinamikleri anlamamızı geliştirmiştir15,16. Örneğin, Fu ve ark. son zamanlarda ilk kez VWF uzama ve trombosit reseptör bağlama eşzamanlı görselleştirme elde etti. Çalışmalarında, VWF molekülleri biotin-streptavidin etkileşimleri yoluyla bir mikroakışkan kanalın yüzeyinde immobilize edildi ve değişen kesme akış ortamlarında toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi altında görüntülendi17. Fu's gibi benzer bir yöntem uygulayarak, burada VWF ve lambda DNA konformasyonları doğrudan TIRF ve konfokal floresan mikroskopi altında görülebilir göstermektedir. Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroakışkan cihazlar kesme akışını oluşturmak ve kontrol etmek için kullanılır ve biyomoleküller kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Değişen kesme hızlarının uygulanması üzerine, aynı molekülün konformasyonları, Şekil 1'dede gösterilen uzatma uzunluğunu ölçmek için kaydedilir. Yöntem, hem reolojik hem de biyolojik çalışmalar için karmaşık akış ortamları altında diğer polimer davranışlarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A30006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Spin P-6 Gel Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td>Use as free biotin in Step 5.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dCTP</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-195</td>
			<td>No. 1 &#189;, 22 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float Buoys for Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212S</td>
			<td>Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Dialysis Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>10K MWCO, 0.1 mL volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Blocking Solution</td>
			<td>CANDOR Bioscience</td>
			<td>110 050</td>
			<td>Use as casein blocking solution throughout protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Cleanroom Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-120-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>von Willebrand Factor, Human Plasma</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>681300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Dye</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>17580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 mm Inner Diameter Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 Gauge Needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>JG2505X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing single-molecule conformational changes under shear flow with fluorescence microscopy

Mekanik tedirginlik altında tek moleküllü davranış birçok biyolojik süreçleri anlamak için yaygın olarak karakterize edilmiştir. Ancak, atomik kuvvet mikroskobu gibi yöntemler insidansı sınırlı zamansal çözünürlüğe sahipken, Förster rezonans enerji transferi (FRET) sadece konformasyonların çıkarılsın. Floresan mikroskopi, diğer taraftan, çeşitli akış koşullarında tek moleküllerin yerinde görselleştirme gerçek zamanlı sağlar. Protokolümüz, floresan mikroskobu kullanarak farklı kesme akış ortamları altında tek biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini yakalama adımlarını açıklamaktadır. Kesme akışı mikroakışkan kanallar içinde oluşturulur ve bir şırınga pompası tarafından kontrol edilir. Yöntemin gösterimleri olarak von Willebrand faktörü (VWF) ve lambda DNA'sı biotin ve florofor ile etiketlenir ve kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Konformasyonları toplam iç yansıma (TIRF) ve konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak değişken kesme akışı altında sürekli olarak izlenir. VWF'nin geri dönüşümlü çözülme dinamikleri, işlevinin insan kanında nasıl düzenlendiğini anlamak için yararlıdır, lambda DNA'sının konformasyonu ise makromoleküllerin biyofiziği hakkında öngörüler sunar. Protokol aynı zamanda polimerlerin, özellikle de biyopolimerlerin, değişen akış koşullarındaki davranışlarını incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için de yaygın olarak uygulanabilir.

VWF ve lambda DNA gibi biyomoleküllerin dinamik davranışlarını gözlemlemek cihaz yüzeyine bağlanmalarını optimize etmeye son derece bağlıdır. Mikroakışkan cihazda önerilen süreler için yüzey tedavileri inkübasyon birkaç ankraj noktaları ile bağlayıcı elde etmek için çok önemlidir, böylece moleküller serbestçe genişletmek ve akış değişen üzerine dinlenmek. Proteinler veya DNA birden fazla bağlantı ile çok güçlü bir şekilde bağlı ise, ya sınırlı uzunluklara kadar uzatır ya ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Kesme akışı altında tek biyo-moleküllerdeki konformasyonel değişikliklerin ölçülmesi, protein ve DNA gibi makromoleküllerin işlevini ve biyofiziğinin anlaşılmasında yararlıdır. Floresan mikroskopisi, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip fizyolojik akış ortamlarında tek moleküllerin gerçek zamanlı yerinde görüntülenmesine olanak sağlar. Bu AFM gibi diğer teknikler tarafından eşsizdir.DNA'mızın küresel konformasyonel değişikliklere sahip olduğu kesme kuvvetini karakterize ederek, bu biyofiziksel özellikleri taklit eden ilaçlar daha iyi tasarlanabilir. Bu protokol, değişen akış koşullarında davranış veya diğer polimerleri, özellikle de biyo polimerleri incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir. Adımların zamanlaması başarı için çok önemlidir.Mikroakışkan cihaz yüzey işleme ve floresan mikroskobu adımlarını verimli bir şekilde yürütmek için birçok kez uygulamanızı öneririz. Biyomoleküllerdeki konformasyonel değişiklikleri yakalamak, filmde en iyi izlenen görsel ve dinamik bir olgudur. Bilim adamları bu videoda sunulan gerçek zamanlı protein ve DNA mikroskobu gördükten sonra bu yöntemi daha iyi anlayacaktır.Mikroakışkan cihazı hazırlamak için, bir parça tartı teknesinde bir parça kür ajan silikon elastomer baz beş parça ekleyin. ve önceden tedavi edilmiş bir PDMS çözümü oluşturmak için içeriği bir dakika boyunca iyice karıştırın. Plastik bir Petri kabına ana silikon gofret yerleştirin ve beş milimetrelik bir tabaka oluşturmak için gofret üzerine PDMS çözüm dökün.Çanak kapağı ve hava kabarcıkları kaldırmak için bir saat vakum altında bir kurutucu bırakın. Daha sonra, PDMS'yi esnek bir katıhaline getirmek için bir gecede 60 santigrat derecede kapalı Petri kabını kuluçkaya yatırın, bu da pdms gofret arabiriminde mikroakışkan kanalların PDMS'ye şekillendirilmesine neden olur. Ertesi gün, PDMS her mikroakışkan kanal etrafında 20 tarafından 10 milimetre dikdörtgenler kesmek ve cımbız ile dikdörtgen blokları kaldırmak için bir jilet kullanın.Kanalın bir ucundaki 0,5 milimetre çapındaki deliği delmek için keskinleştirilmiş kenarlı 25 kalibrelik künt uçlu iğne kullanın ve deliğin PDMS bloğundan tamamen geçtiğinden emin olun. PDMS'yi delikten çıkarmak için ince bir iğne kullanın ve kanalın diğer ucundaki işlemi tekrarlayın. PDMS bloğunu kanal tarafı yukarı ve kapak lı bir plazma yapıştırma makinesinin odasına yerleştirin ve tedaviye başlayın.Tedavi tamamlandığında, PDMS bloğunu hızlı bir şekilde bir kapak kaymasına yerleştirin, böylece kanal kaymayla temas halindedir. Bloğun kenarlarına basınç uygulayın, ardından kalıcı bağı güçlendirmek için coverslip PDMS tertibatını 115 santigrat derecede 15 dakika sıcak bir tabağa yerleştirin. Son olarak, 10 santimetre uzunluğunda ekleyin.0.25 milimetrelik iç çaplı tüp PDMS bloğunun üst kısmındaki çıkış deliğine sıvının kanaldan kolayca akmasını sağlar. Von Willebrand faktörü veya VWF deneyleri için, steril 1X PBS'de çözünmüş mililitre Başına 10 mikrolitreye kadar 10 mikrolitreye kadar mikrolitre lik mikroakışkan cihazın girişine enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra pipet ucunda birkaç mikrolitre BSA-Biotin tutun ve ucun girişte gömülü kalmasını bekleyin.BSA-Biotin'in cihazda iki saat kuluçkaya yatmasını bekleyin ve bu da BSA'nın kapak yüzeyine özel olarak bağlanmamasıyla sonuçlanır. Daha sonra pipet ucunu çıkarın ve kanala 10 mikrolitreye kadar kazein engelleme çözeltisi enjekte edin. Kazein çözeltisinin 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin, böylece serbest bölgeleri bloke edebilir ve biyomoleküllerin yüzeye olan spesifik olmayan bağlanmasını azaltabilir.Ucu çıkarın ve steril PBS streptavidin 10 mikrolitre kadar enjekte kanala, Hangi BSA-Biotin biotin gruplarına bağlanacak. Daha sonra, fazla streptavidini temizlemek için 10 mikrolitreye kadar deterjan çözeltisi enjekte edin. Ucu çıkarın ve kazein çözeltisi veya lambda DNA ya VWF enjekte.VWF'yi üç dakika veya lambda DNA'sını 45 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra aşırı streptavidin bağlayıcı siteleri engellemek için beş milimolar ücretsiz biotin enjekte. Bir mililitre kazein engelleme çözeltisini şırıngaya yükleyin ve şırınga pompasına sabitlayın.Sonra şırınga iğne ve hava kabarcıkları kaldırmak için çözelti akışı için boru bir ucunu takın. Serbest biotin enjeksiyonundan yaklaşık üç dakika sonra tüpün diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine takın. TIRF veya konfokal floresan mikroskobunun en yüksek büyütme hedefini seçin.Gerekirse, hedefe daldırma yağı bir damla ekleyin. Mikroakışkan cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin, böylece kapak kayması hedefe doğru sifonu çeksin. Parlak alan mikroskobu başlatın ve enkaz ve kabarcıklar gibi özellikleri görünür böylece odak ayarlayın.Daha sonra mikroakışkan kanalın kenarı görünene ve çerçeveyi ikiye bölene kadar X ve Y yönünde sahneyi ayarlayın. FITC kanalına geçin ve bireysel yeşil küresel moleküller ayırt edilene kadar gerektiği gibi Z seviyesi ve TIRF açısını ayarlayın. Floresan molekülleri çok hızlı bir şekilde fotobeyazlama yapmadan görselleştirmek için lazer yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın.Daha sonra molekülleri daha iyi görselleştirmek için kontrastı ayarlayın. Tam beş dakika ücretsiz biotin enjeksiyonu başlatmak ve saatte 5000 ve 30, 000 mikrolitre arasında akış oranları kullanarak moleküler konformasyon değişiklikleri gözlemlemek için şırınga pompası akışını durdurmak sonra. VWF ile, ücretsiz biotin enjeksiyonundan tam beş dakika sonra saatte 30 saniyelik 10, 000 mikrolitre lik akış gibi en az az bir akış uygulamak önemlidir.Bunu mikroakışkan cihazın çeşitli alanlarında tekrarlayın ve akışı başlatma ve durdurma nın birden fazla döngüsü nde genişletip dinlendirebilecek molekülleri bulun. Moleküllerin maksimum uzantıya ulaşmasının ve tam gevşemeye ulaşması ve kesme akışı altındaki moleküllerin sürekli davranışlarının videolarını kaydetmelerinin ne kadar sürdüğünü unutmayın. Bir molekülün onayını değiştirme esnekliği, artan akış nedeniyle daha yüksek kesme hızları uygulandığı için uzabilme yeteneği yle sık lıkla ortaya konmuştur.Von Willebrand faktör molekülünün uzatma ve kesme hızı eğrisi proteinin biyomekanik özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır. Lambda DNA floresan mikroskopi görüntüleri benzer şekilde 30 saniye yüksek kesme hızları ve akış durdurulduktan sonra iki dakika içinde kademeli gevşeme üzerine artan uzantısı göstermektedir. VWF ile çalışırken, akış başlamadan önce sadece üç dakika ve ücretsiz biotin için beş dakika kuluçka unutmayın.Bu, geri dönüşümlü çözülme için gerekli en uygun sayı veya biotin-streptavidin bağlantıları oluşturmak için önemlidir. Bu yöntem, birden fazla biyomolekül arasındaki gerçek zamanlı etkileşimleri görselleştirmek ve işlevlerini karakterize etmek için uyarlanabilir. Örneğin, vwf'nin yüksek makas altında çözünmesini ve trombosit yapışma molekülü GPIb-alfa ile bağlanmasını görselleştirerek trombosit fişi oluşumunu daha iyi anlamak daha iyi olabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...