Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلاً من برنامج الأشخاص (Marie Curie Actions) بموجب اتفاقية منحة REA رقم 302170 من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013)؛ مركز البحوث السريرية المتعدد التخصصات (IZKF) التابع لجامعة إرلانغن - نورمبرغ؛ مركز البحوث التعاونية TRR241 ومجموعة البحوث السريرية KFO257 من مجلس البحوث الألماني (DFG)؛ وDFG.

وقد وافقت السلطات المحلية المختصة في إرلانجن على البروتوكول التالي (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germany). تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.
ملاحظة: تثبيط قبلة GGTase بوساطة داخل IECs يسبب تغيير شديد في نفاذية الأمعاء في Pggt1bط ΔIEC الفئران24. لذل...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

على الرغم من أن تحديا من الناحية الفنية، منهجية تستند إلى المجهر intravital يمثل نهجا تجريبيا فريدة من نوعها لتصور دينامية عالية عملية الخلوية في الوقت الحقيقي، مثل سفك الخلية الأداء. حتى الآن، لا يوجد نهج تجريبي بديل لتصور البثق الخلية في الجسم الحي. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن تسهم ف...

الأمعاء هي جهاز متخصص للغاية مع وظيفة منظمة بإحكام تمكين العمليات المتضاربة، وهي التغذية والحماية من المواد الإنارة الضارة. بطانة بين الجسم البشري والبيئة، وظهارة المعوية بمثابة حاجز المادية والمناعية ويساهم في الحفاظ على التوازن المخاطي في القناة الهضمية1،2. ومن المعروف جيدا فقدان النزاهة الظهارية وزيادة نفاذية تقاطع ضيق أن تكون مرتبطة مع مرض التهاب الأمعاء (IBD)3,4,5,6. ثم تعتبر التعديلات الظهارية كمسببات ومكبرات الصوت الثانوية لالتهاب الأمعاء المزمن في IBD. وهكذا، فإن تحسين فهم التعديلات الظهارية المبكرة في القناة الهضمية لمرضى IBD ستكون ذات قيمة هائلة لتطوير استراتيجيات جديدة لاستعادة السلامة الظهارية للتنبؤ الموثوق بها والوقاية اللاحقة من الانتكاسات IBD.
يتبع ظهارة الأمعاء عملية دوران معقدة ومنظمة بإحكام. من أسفل سرداب، الخلايا الظهارية المعوية المتمايزة بشكل نهائي (IECs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات تهاجر صعودا إلى طرف villus، حيث يتم إلقاء الخلايا القديمة / التالفة في تجويف7. يمكن التوازن بين الانقسام وبثق الخلية الحفاظ على أرقام الخلايا الظهارية المعوية ، وتجنب تشكيل الثغرات والتسرب ، وكذلك تراكم الخلايا الظهارية التي يحتمل أن تؤدي إلى كتل الخلايا و ورمريجنيس8،9،10. على الرغم من الدور الرئيسي للخلية الظهارية ذرف في التجديد الفسيولوجي للظهارة القناة الهضمية، والمعرفة حول الآليات الجزيئية التي تقود قذف الخلايا في طرف villus محدودة. وهكذا، هناك حاجة للبحوث الأساسية التي توفر وصفا دقيقا لسلسلة من الأحداث الجزيئية التي تنطوي عليها الخلايا الظهارية ذرف.
التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الغشاء المخاطي المعوي هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم دوران الظهارية والأمعاء. وهكذا، في الدراسات الحية تقدم مزايا عالية على الأساليب في المختبر و السابقين في هذا السياق. وعلاوة على ذلك، تسمح تقنيات التصوير في الوقت الحقيقي بوصف تسلسل الأحداث التي تتحكم في ظواهر معينة. وفي هذا السياق، تتطلب دراسة العمليات ذات الحيوية العالية استخدام تقنيات عالية الدقة الأمثل للمراقبة المباشرة للأنسجة. تقنيات التصوير داخل الأتصال تظهر كأدوات فريدة مناسبة لدراسة الخلايا الظهارية التي تسيل في الأمعاء.
يشير مصطلح المجهر داخلة في المنشآت إلى الأساليب التجريبية التي تستفيد من تقنيات التصوير عالية الدقة (المجهر متعدد الصور أو المجهر) لتصور الخلايا والأنسجة مباشرة في محيطها الأصلي داخل حي11. فإنه يتيح الحصول في الوقت الحقيقي من المعلومات في الجسم الحي تصل إلى قرار خلية واحدة، وينطوي على مزايا واضحة على أساليب ثابتة أو منخفضة القرار. يوفر المجهر داخل الواجهة معلومات تكميلية ويتغلب على بعض القيود من التقنيات الكلاسيكية و/أو الراقية، مثل القطع الأثرية الناتجة عن معالجة الأنسجة. في المقابل ، فإن القيد الرئيسي للمجهر داخل الرحم هو أن الأنسجة يجب أن تتعرض مباشرة للمجهر ، والتي تتطلب في معظم الحالات الجراحة. على الرغم من أن النهج المتطورة الحفاظ على حيوية وتقليل تأثير الأنسجة المصورة (غرف الجلد والنوافذ التصوير)12،13، في معظم الحالات يتم تنفيذ شق بسيط الجلد لال خارجية من الأنسجة (الجلد اللوحات)14. وفي العقد الماضي، أسهمت هذه النهج بأدلة رئيسية عن عمليات شديدة الدينامية كانت في السابق غير قابلة للإثبات. ترجمة, التصوير في الوقت الحقيقي قدمت رؤى بيولوجية جديدة على الخلايا الجذعية و الكريات البيض توجيه15, فضلا عن نشر السرطان وتشكيل الانبثاث13,16. في السياق السريري, يتم حاليا استغلال التنظير الداخلي كأداة تشخيصية للسرطان17 وأمراض الجهاز الهضمي, مثل IBD18,19; في حين أصبح الفسيفساء المجهرية confocal أداة علم الأمراض السريعة أثناء الجراحة20. معًا، ظهر الفحص المجهري داخل الرحم مؤخرًا كأداة قيمة ومتعددة الاستخدامات للبحث الطبي الحيوي والتطبيق المستقبلي في العيادة.
يتم هنا تنفيذ المجهر داخل الرحم للتصور في الوقت الحقيقي من تسرب الظهارية المعوية ومراقبة الخلايا الظهارية ذرف الأحداث. يمكن التعرف على تسرب نفاذية الأمعاء من قبل تقنيات أخرى في الجسم الحي غير الباضع، مثل القياس الكمي للإدارة شفويا من التتبع الفلورسنت في المصل21. ومع ذلك، فإن هذه التقنية لا تسمح بالمراقبة المباشرة لأداء السفك ولا الفصل بين نفاذية شبه الخلوية. يمثل الجمع بين تجارب التتبع القياسية والمجهرية داخل الرحم منهجًا مناسبًا لما يلي: 1) تحديد الاضطرابات في نفاذية الأمعاء، و ii) الفصل بين نفاذية الظهارية شبه الخلوية. بالإضافة إلى سفك الخلايا، المجهر داخل الرحم في تركيبة مع في وضع العلامات الفلورية في الجسم الحي تمكن دراسة الآليات الخلوية والجزيئية الأخرى (على سبيل المثال، ضيق تقاطع إعادة توزيع أثناء سفك الخلية باستخدام الفئران مراسل الفلورسنت22 أو التفاعلات بين IECs والخلايا الأخرى داخل الغشاء المخاطي المعوي23).
الطريقة المعروضة هنا تمثل تكييف المجهر داخلة لتمكن من المراقبة في الوقت الحقيقي من الغشاء المخاطي المعوي، وذلك باستخدام المجهر الليزر confocal (CLSM). ولذلك، فإننا نستخدم الفئران خروج المغلوب المشروط من GGTase (Geranylgeranyltransferase) في الخلايا الظهارية المعوية (IECs) في (Pggt1biΔIEC الفئران)، لأنها تعاني من مرض الأمعاء الحاد وزيادة نفاذيةالظهارية 24. يتم وصف الإعداد الجراحي للفأر وتلطيخ الغشاء المخاطي المعوي ، وكذلك الإعدادات المناسبة المستخدمة في الحصول على الصور وتحليل ما بعد الاستحواذ. يمكن أن يمكّن هذا البروتوكول الدراسات المستقبلية التي تساهم في المعرفة الحالية حول ديناميات وحركيات الخلايا الظهارية المعوية التي تسفك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون البروتوكول بمثابة أساس للتكيفات المختلفة لدراسة الظواهر الأخرى التي تحدث على سطح الغشاء المخاطي في الأمعاء، وحتى في الأنسجة الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

يسمح المجهر الداخلي للأمعاء باستخدام التصوير confocal الملاحظة في الوقت الحقيقي من سفك الخلايا الظهارية وتسرب الحاجز في الحيوانات الحية. ولذلك ، فإن الغشاء المخاطي المعوي للفئران المُجَنَّبة مُلطّخة موضعيًا بصبغ غير محدد (acriflavine) وتتبع فلوري (رودامين - ب ديكستران) ، مثبتًا على لوحة مشطفة بالمحلول الملحي ومصوّرة مباشرة باستخدام مجهر confocal. يمكن لهذه التقنية أن تكمل تقنيات أخرى غير الغازية لتحديد تسرب نفاذية الأمعاء، مثل مرور transmucosal من المقتفيات تدار شفويا. بالإضافة إلى هذا، النهج المعروض هنا يسمح بالمراقبة المباشرة للأحداث تسليط الخلية في الوقت الحقيقي. في تركيبة مع الفئران مراسل الفلورسنت المناسبة، وهذا النهج هو مناسبة لتسليط الضوء على الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في قذف الخلايا الظهارية المعوية، وكذلك لعمليات بيولوجية أخرى. في العقود الماضية، ساهمت دراسات مثيرة للاهتمام باستخدام المجهر داخل الرحم في المعرفة حول نفاذية الأمعاء البطانية، واتصال الأمعاء في الخلايا المناعية، والتواصل بين المناعة والظهارية، وغزو المكونات اللماحية، من بين أمور أخرى. معا، فإن البروتوكول المقدم هنا ليس فقط تساعد على زيادة فهم آليات التحكم في قذف الخلايا الظهارية، ولكن يمكن أيضا أن يكون أساسا للتنمية من النهج الأخرى لاستخدامها كأدوات لتصور عملية أخرى الخلوية ديناميكية للغاية، حتى في الأنسجة الأخرى. ومن بين القيود التقنية، فإن الخصائص البصرية للأنسجة المحددة، فضلا عن تكنولوجيا التصوير المختارة وتكوين المجهر، من شأنها أن تحدد بدورها مسافة عمل التصوير، ودقة الصور المكتسبة.

يصف البروتوكول المعروض هنا نهجًا قائمًا على المجهر الداخلي لتصور تسرب الظهارة المعوية ومراقبة أداء سفك الخلايا في الأمعاء في الوقت الفعلي. باختصار ، يتم تخدير الفئران وتقديمها إلى التحضير الجراحي من أجل الكشف عن سطح الأمعاء الدقيقة المخاطية. ثم تلطخ IECs عن طريق تطبيق موض...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

الاستفادة من المجهر داخل مدينة، طريقة المقدمة هنا تمكن التصور في الوقت الحقيقي من الظهارية الأمعاء سفك الخلايا في الحيوانات الحية. لذلك ، يتم تصوير الغشاء المخاطي المعوي الملون موضعيًا (acriflavine و rhodamineB-dextran) من الفئران المُضنِع إلى دقة خلية واحدة باستخدام المجهر confocal.

نهج المجهر الداخلي القائم على تقييم نفاذية المعوية وخلية الظهارية ذرف الأداء

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

باستخدام المجهر داخل واهية، وهذا البروتوكول تمكن من تصور في الوقت الحقيقي من الأنسجة المعوية تصل إلى قرار خلية واحدة ودراسة العمليات ديناميكية للغاية مثل سفك الخلايا. في تركيبة مع التجارب التتبع القياسية، يسمح هذا البروتوكول بتحديد كل من الاضطرابات نفاذية الأمعاء في الجسم الحي والتمييز بين البارا ونفاذية عبر الخلية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول كأساس لوضع نهج إضافية للمجهر داخل الرحم لتصور عمليات أخرى ذات طابع خلوي شديد الحيوية من المصالح داخل الأنسجة المختلفة.إن العرض المرئي لهذه الطريقة ضروري لفهم خطوات الإعداد الجراحي ووضع الحيوان الحي بطريقة تسهل الحصول على الصورة على سطح المخاط المعوي. قبل البدء في الإجراء، قم بتشغيل مربع القاعدة والماسح الضوئي لمجهر المسح الضوئي بالليزر confocal واضغط على بدء تشغيل الكمبيوتر. قم بتشغيل برنامج الحصول على الصور وحدد التكوين المناسب.لتعيين دقة الصورة المناسبة، حدد التكوين والأجهزة والدقة وعمق البت و12. ضمن قائمة الاستحواذ، حدد XYZT لوضع الحصول على الصور وحدد الهدف إلى 20 أو 40X. لإعداد إعداد الاكتساب التسلسلي، انقر فوق البحث وإضافة وتحديد بين الإطارات.لتكوين تسلسل واحد، قم بتشغيل مربع الليزر المرئي. تعيين أنبوب الmultiplier الضوئي واحد على وتحديد الطول الموجي للانبعاثات. لتكوين التسلسل الثاني، قم بتشغيل مربع الليزر المرئي.تعيين أنبوب الmultiplier الضوئي اثنين على وتحديد الطول الموجي للانبعاثات. ثم قم بتنشيط أشعة الليزر المناسبة. بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القارص، استخدم براعم القطن لتطبيق مرهم على عيون الماوس المُغَدَّد، ثم قم بعمل شق سنتيمتر واحد في منطقة البطين الأيسر من البطن.استخدام ملقط لإضفاء مظهر من ثلاثة إلى خمسة سنتيمتر قطعة من الأمعاء. جعل اثنين من شقوق صغيرة في الجزء العلوي والسفلي من الجزء الأمعاء وإدخال micropipette الزجاج في تجويف الأمعاء. ثم استخدام الكهربائية لفتح الجزء الخارجي الأمعاء طوليا على طول الجانب المضادة للميناتيكي وفضح الغشاء المخاطي.شطف الأنسجة لفترة وجيزة مع محلول ملحي لإزالة محتوى البراز. لتلطيخ سطح الغشاء المخاطي المعوي، تطبيق 100 ميكرولترات من مليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول acriflavine في قطرات على سطح المخاطية المكشوفة والسماح لللطخة لتطوير لمدة ثلاث دقائق قبل غسل الحل المتبقي مع برنامج تلفزيوني. المقبل, تطبيق 100 ميكروليترات من اثنين مليغرام لكل ملليلتر رودامين ديكستران حل في قطرات إلى الغشاء المخاطي لمدة ثلاث دقائق الحضانة قبل الغسيل مع برنامج تلفزيوني.ثم ضع الماوس المُغفَّر على شريحة غلاف مثبتة على الغرفة المشطفة بـ 37 درجة مئوية من المالحة ، وقم بتعديل الموقف إذا لزم الأمر ، ووضع الإعداد على مرحلة المجهر المقلوب. مباشرة بعد وضع الماوس على المسرح، بدوره على مصدر الضوء وضبط موقف س ص حتى محور الإضاءة يركز على إعداد الأنسجة. من أجل تحديد حقل الرؤية، حدد مكعب التصفية المناسب.افتح الغالق واستخدم عجلات الماكرو والصغرى للتركيز على سطح الغشاء المخاطي المعوي. ضبط موقف س ص لتحديد موقع منطقة حيث يمكن تصور عدة زغب داخل مجال الرؤية وتغيير مكعب مرشح للتحقق من أن تلطيخ دكستران رودامين هو أيضا مرئية في هذا المجال. عندما تم تحديد منطقة ذات أهمية، ابدأ عملية الحصول على الصورة وحدد التسلسل الأول لضبط قوة الليزر، والمكاسب، والتواؤم للتسلسل الأول.ثم حدد التسلسل الثاني وضبط قوة الليزر ، وكسب ، وإزاحة للتسلسل الثاني. لتعريف نطاق Z-مكدس، افتح القائمة المنسدلة Z-مكدس. استخدام التحكم في الوصول إلى Z للتركيز على سطح الغشاء المخاطي وانقر فوق ابدأ.التركيز على الحد السفلي من حيث إشارة لا يزال يمكن الكشف عنها وانقر فوق نهاية. حدد أرقام مكدسات Z، وتجنب هفوات الوقت أطول من دقيقتين لنقاط الوقت المتتاليتين، وافتح القائمة الزمنية لتحديد تصغير واقتناء حتى التوقف. لتحديد متوسط البند، حدد البحث عن واحد، متوسط البند الثاني، البحث عن اثنين، ومتوسط البند الثاني.ثم للحصول على الصور، تعيين تنسيق إلى 1024 × 1024 بكسل والسرعة إلى 400 وانقر فوق ابدأ. GGTase ظهارية الظهارية THTASE فئران مشروطة ناقصة وضعت أمراض الأمعاء الحاد كما يتضح من زيادة في درجة الضرر النسيجي للأمعاء الدقيقة وزيادة نفاذية الظهارية المعوية يمكن أيضا الكشف عن طريق التتبع في التجارب في vivo باستخدام إدارة شفويا FITC-dextran. ويمكن تحديد أحداث سفك الخلية كخليات تتحرك من أحادية الظهارة إلى التجويف، مما يؤدي إلى ثغرات مؤقتة في سقف الظهارة التي يتم إغلاقها في النهاية عن طريق الاتصال بين الخلايا المجاورة، وهو ما يسمى تأثير السوستة.ويلاحظ أن هذه الثغرات في كل من فئران التحكم ونقص GGTase ، على الرغم من أن تواتر هذه الظاهرة أعلى في هذه الأخيرة. ومن المثير للاهتمام, خلايا أخرى تظهر أيضا إلى امتصاص dextran. هذه ما يسمى أحداث الخلايا نفاذية تحدث أيضا أساسا في الفئران خروج المغلوب المشروطة.ويمكن إجراء الالتصاق المناعي للبروتينات المتصلة بالهياكل السيّدة والمضيقة ذات الأهمية لتحديد أهداف محددة تسهم في حدوث اضطرابات نفاذية ظهارية محتملة تتحدد عن طريق المجهر الداخلي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل الظواهر الأخرى على سطح الغشاء المخاطي المعوي ، مثل التسرب البطانية أو الاتصال الظهاري المناعي في سياق العدوى المعوية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

بي ار بي كنهج جديد للوقاية من العدوى: إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; الخصائص المضادة للميكروبات من PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

وضع النطاقي الحماقي الفيروسات محددة بوساطة خلية الحصانة ELISPOT الفحص لتقييم الإنترفيرون γ-عقب الحبل السري زرع الدم

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

نموذج الالتهاب الرئوي القوي في مناعيا القوارض لتقييم مضاد للبكتيريا فعالية ضد<i&gt; S. الرئوية</i&gt;،<i&gt; H. النزلية</i&gt;،<i&gt; K. الرئوية</i&gt;،<em&gt; P. الزنجارية</em&gt; أو<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث المعوية المشتقة لدراسة وتعديل الحماية الخلوية الظهاريه ضد السالمونيلا ومسببات الامراض الأخرى

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...