Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra People Program (Marie Curie-aktionerne) under REA-tilskudsaftalen nummer 302170 i Eu's syvende rammeprogram (RP7/2007-2013); det tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetet Erlangen-Nürnberg; Det Kollaborative Forskningscenter TRR241 og den kliniske forskningsgruppe KFO257 fra det tyske forskningsråd (DFG); og DFG.

Følgende protokol er godkendt af de relevante lokale myndigheder i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus blev anbragt under specifikke patogen-fri betingelser.
BEMÆRK: Hæmning af GGTase-medieret prenylation inden for IEC'er forårsager en alvorlig ændring af intestinal permeabilitet i Pggt1biΔIEC mus24. Derfor blev denne musemodel brugt til at demonstrere, hvordan protokollen kan være nyttig til at studere tarmbarriere...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Selv om teknisk udfordrende, intravital mikroskopi-baseret metode repræsenterer en unik eksperimentel tilgang til at visualisere meget dynamisk cellulære proces i realtid, såsom celle kaste ydeevne. Hidtil er der ingen alternativ eksperimentel tilgang til visualisering celle ekstrudering in vivo. Vi mener, at denne protokol kan bidrage til beskrivelsen af forskellige cellulære processer, der spiller en rolle i vedligeholdelsen af tarmhomostase.
Drage fordel af intravital mikroskopi, den me...

Tarmen er et højt specialiseret organ med en stramt reguleret funktion, der muliggør modstridende processer, nemlig ernæring og beskyttelse mod skadelige luminalstoffer. Foring mellem den menneskelige krop og miljøet, tarmepitel fungerer som en fysisk og immunologisk barriere og bidrager til opretholdelsen af slimhinde homøostase itarmen 1,,2. Tab af epitelintegritet og øget tæt vejkrydspermeabilitet er velkendt for at være forbundet med inflammatorisk tarmsygdom (IBD)3,4,5,6. Epitelændringer betragtes derefter som årsager og sekundære forstærkere til kronisk tarmbetændelse i IBD. Således, en forbedret forståelse af tidlige epitelændringer i tarmen af IBD patienter ville være af enorm værdi for udviklingen af nye strategier til at genoprette epitelintegritet for pålidelig forudsigelse og efterfølgende forebyggelse af IBD tilbagefald.
Intestinal epitel følger en kompleks og stramt reguleret omsætningsproces. Fra kryptbunden, terminalt differentierede tarm epitelceller (IEC' er) stammer fra pluripotente stamceller migrere opad til villus spids, hvor alderen / beskadigede celler er kastet i lumen7. Ligevægten mellem deling og celle ekstrudering gør det muligt at opretholde tarm epitelcelletal, undgå dannelsen af huller og lækage, samt ophobning af epitelceller potentielt fører til cellemasser og tumorigenesis8,9,10. På trods af den centrale rolle epitelcelleudsedeling i den fysiologiske fornyelse af tarmepitelet er kendskabet til de molekylære mekanismer, der driver ekstruderingen af celler på villus-spidsen, begrænset. Der er således behov for grundforskning, der giver en præcis beskrivelse af rækkefølgen af molekylære hændelser, der er involveret i epitelcelleudgydelse.
Komplekse interaktioner mellem forskellige celletyper i tarmslimhinden er nøglen til at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer epitelomsætning og tarmhomøostase. In vivo-undersøgelser giver således store fordele i forhold til in vitro- og ex vivo-tilgange i denne sammenhæng. Desuden giver realtidsbilleddannelsesteknikker mulighed for beskrivelse af rækkefølgen af begivenheder, der styrer specifikke fænomener. I denne sammenhæng kræver studiet af meget dynamiske processer brugen af optimerede højopløsningsteknikker til direkte observation af vævet. Intravital billeddannelse teknikker fremstå som unikke egnede værktøjer til undersøgelse af epitelcelle kaste i tarmen.
Udtrykket "intravital mikroskopi" henviser til eksperimentelle tilgange, der udnytter billedbehandlingsteknikker med høj opløsning (multiphoton eller konfokal mikroskopi) til direkte at visualisere celler og væv i deres oprindelige omgivelser i et levende dyr11. Det muliggør realtidserhvervelse af in vivo-oplysninger op til encelleløsning og medfører klare fordele i forhold til statiske eller lave opløsningsmetoder. Intravital mikroskopi giver supplerende oplysninger og overvinde nogle begrænsninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, såsom artefakter på grund af vævsbehandling. I modsætning hertil er den vigtigste begrænsning af intravital mikroskopi, at vævet skal være direkte udsat for mikroskopet, som i de fleste tilfælde kræver operation. Selv om sofistikerede tilgange bevare vitalitet og minimere virkningen af det afbildede væv (skinfold kamre og billeddannelse vinduer)12,13, i de fleste tilfælde en simpel hud snit udføres for eksternalisering af vævet (hud flapper)14. I det seneste årti har disse tilgange bidraget med nøglevidne om meget dynamiske processer, som tidligere var uudgrundelige. Translationelt, real-time billeddannelse forudsat nye biologiske indsigter på stamceller og leukocytter homing15, samt kræft formidling og metastasedannelse 13,16. I den kliniske sammenhæng udnyttes endomikroskopi i øjeblikket som et diagnostiskværktøj for kræft 17 og gastrointestinale sygdomme, såsom IBD18,19; mens konfokale mosaicking mikroskopi blev en hurtig patologi værktøj under kirurgi20. Sammen har intravital mikroskopi på det seneste vist sig som et værdifuldt og alsidigt værktøj til biomedicinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.
Intravital mikroskopi er her implementeret for real-time visualisering af intestinal epitellækage og observation af epitelcelle kaste begivenheder. Udsivning af intestinal gennemtrængelighed kan identificeres ved hjælp af andre in vivo noninvasive teknikker, såsom kvantificering af mundtlig administration af fluorescerende stoffer i serum21. Denne teknik gør det imidlertid ikke muligt at foretage direkte observation af udskillelsen af ydeevnen eller adskillelsen mellem para- og transcellulær permeabilitet. Kombinationen af standardsporingsforsøg og intravital mikroskopi repræsenterer en passende tilgang til: i) identificere forstyrrelser i tarmpermeabilitet og ii) adskille mellem para- og transcellulære epitelperabilitet. Ud over celleudgydelse muliggør intravital mikroskopi i kombination med in vivo fluorescensmærkning studiet af andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks. tæt krydsfordeling under celleudgydelse ved hjælp af fluorescerende reportermus22 eller interaktioner mellem IEC'er og andre celler i tarmslimhinden23).
Den metode, der præsenteres her, repræsenterer en tilpasning af intravital mikroskopi for at muliggøre real-time observation af tarmslimhinden ved hjælp af konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM). Derfor bruger vi betingede knock-out mus af GGTase (Geranylgeranyltransferase) i intestinal epitelceller (IEC' er) i (Pggt1biΔIEC mus), da de lider af en alvorlig tarmsygdom og øget epitelperabilitet24. Kirurgisk forberedelse af musen og farvning af tarmslimhinden, samt passende indstillinger, der anvendes til billeddannelse erhvervelse og post-erhvervelse analyse er beskrevet. Denne protokol kan muliggøre fremtidige undersøgelser, der bidrager til den nuværende viden om dynamik og kinetik af intestinal epitelcelleudgydelse. Desuden kunne protokollen danne grundlag for forskellige tilpasninger for at undersøge andre fænomener, der forekommer på overfladen af tarmslimhinden, og selv på andre væv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Intravital mikroskopi af tarmen ved hjælp af konfokale billeddannelse giver realtid observation af epitelcelle udgydelse og barriere lækage i levende dyr. Derfor er tarmslimhinden af bedøvede mus topisk plettet med uspecifik farvning (acriflavine) og en fluorescerende sporstof (rhodamine-B dextran), monteret på en saltvandsopløsning-skyllet plade og direkte afbildet ved hjælp af et konfokal mikroskop. Denne teknik kan supplere andre ikke-invasive teknikker til at identificere lækage af intestinal permeabilitet, såsom transmucosal passage af oralt administrerede tracer... Ud over dette, den tilgang, der præsenteres her giver mulighed for direkte observation af celle kaste begivenheder i realtid. I kombination med passende fluorescerende reporter mus, denne fremgangsmåde er velegnet til at kaste lys i cellulære og molekylære mekanismer, der styrer intestinal epitelcelle ekstrudering, samt til andre biologiske processer. I de sidste årtier har interessante undersøgelser ved hjælp af intravital mikroskopi bidraget til viden om endotelperabilitet, immuncelle gut homing, immun-epitel kommunikation og invasion af luminal komponenter, blandt andre. Sammen vil den protokol, der præsenteres her, ikke blot bidrage til at øge forståelsen af mekanismer, der styrer epitelcelleudtrudering, men også kunne danne grundlag for udvikling af andre tilgange, der skal anvendes som instrumenter til at visualisere andre meget dynamiske cellulære proces, selv i andre væv. Blandt de tekniske begrænsninger, optiske egenskaber af det specifikke væv, samt den valgte billeddannelse teknologi og mikroskop konfiguration, ville igen, bestemme billeddannelse arbejdsafstand, og opløsning af erhvervede billeder.

Protokollen præsenteres her beskriver en intravital mikroskopi-baseret tilgang til at visualisere intestinal epitellækager og observere celle kaste ydeevne i tarmen i realtid. Kort, mus er bedøvet og underkastes kirurgisk forberedelse for at udsætte overfladen af tyndtarmen slimhinden. IECs er derefter farves via lokal anvendelse af acriflavine; mens luminal rhodamin B-dextran bruges som sporstoffer til at detektere transmucosal passage fra lumen til sub-epitel rummet. Således er det...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Drage fordel af intravital mikroskopi, den metode, der præsenteres her gør det muligt real-time visualisering af intestinal epitelcelle udgydelse i levende dyr. Derfor, topisk plettet tarmslimhinden (acriflavine og rhodamineB-dextran) af bedøvede mus er afbildet op til encellet opløsning ved hjælp af konfokal mikroskopi.

En intravital mikroskopi-baseret tilgang til vurdering af intestinal permeabilitet og epitelcelle shedding performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Ved hjælp af intravital mikroskopi muliggør denne protokol real-time visualisering af tarmvæv op til en enkeltcelleopløsning og studiet af meget dynamiske processer såsom celleudgydelse. I kombination med standardsporingsforsøgene gør denne protokol det muligt at identificere både tarmpermeabilitetsforstyrrelser in vivo og sondringen mellem para og transcellulær permeabilitet. Denne protokol kan bruges som grundlag for udvikling af yderligere intravital mikroskopi tilgange til visualisering af andre meget dynamiske cellulære processer af interesser inden for forskellige væv.Visuel demonstration af denne metode er afgørende for at forstå de kirurgiske forberedelsestrin og for at placere det levende dyr på en måde, der letter billedoplevelsen på tarmhinden. Før proceduren påbegyndes, skal du tænde for basen og scannerboksen på et konfokalt laserscanningsmikroskop, og tryk på start for at tænde computeren. Start billedopkøbssoftwaren, og vælg den relevante konfiguration.Hvis du vil angive den relevante billedopløsning, skal du vælge konfiguration, hardware, opløsning, bitdybde og 12. Vælg XYZT for billedopkøbstilstanden under anskaffelsesmenuen, og sæt målet til 20 eller 40X. Hvis du vil konfigurere indstillingen for sekventiel anskaffelse, skal du klikke på Søg og tilføj og vælg mellem rammer.Hvis du vil konfigurere sekvens et, skal du aktivere den synlige laserboks. Indstil fotomultiplier rør en til på og definere emission bølgelængde. Hvis du vil konfigurere sekvens to, skal du aktivere den synlige laserboks.Indstil fotomultiplier rør to til på og definere emission bølgelængde. Aktiver derefter de relevante lasere. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, bruge en vatpind til at anvende salve til øjnene af bedøvet mus og gøre en en centimeter snit i venstre ventrikel region af maven.Brug scepper til at eksteriere en tre til fem centimeter segment af tarmen. Lav to små snit øverst og nederst i tarmsegmentet og indfør et glasmikropipette i tarmlummen. Brug derefter elektrocauterization til at åbne det eksteriøriserede tarmsegment i længderetningen langs den anti-mesenteriske side og eksponere slimhinden.Skyl vævsvævet kortvarigt med saltvandsopløsning for at fjerne fækalindholdet. Til farvning af tarmslimhinden påføres 100 mikroliter af en milligram pr. milliliter acriflavinopløsning i dråber på den eksponerede slimhindeoverflade, og pletten kan udvikles i tre minutter, før den resterende opløsning vaskes ud med PBS. Derefter anvendes 100 mikroliter af en to milligram pr. milliliterrrrucamin dextranopløsning i dråber til slimhinden i tre minutters inkubation før vask med PBS.Derefter placeres bedøvet mus liggende på et dæksel monteret på kammeret skyllet med 37 grader Celsius saltvand, justere positionen, hvis det er nødvendigt, og placere præparatet på den omvendte mikroskop fase. Umiddelbart efter at musen er placeret på scenen, skal du tænde for lyskilden og justere XY-positionen, indtil belysningsaksen er fokuseret på vævspræparatet. Vælg den relevante filterkube for at vælge synsfeltet.Åbn lukkeren og bruge makro og mikro hjul til at fokusere på overfladen af tarmslimhinden. Juster XY-positionen for at finde et område, hvor flere villi kan visualiseres i synsfeltet, og skift filterkuben for at kontrollere, at rhodamine dextran-farvningen også er synlig i det pågældende område. Når et interesseområde er blevet identificeret, skal du starte billedoperækkelsen og vælge sekvens et for at justere lasereffekten, forstærkningen og forskydningen for sekvens et.Vælg derefter sekvens to, og juster lasereffekten, forstærkning og forskydning for sekvens to. Hvis du vil definere Z-stack-området, skal du åbne drop-off-menuen Z-stack. Brug Z-adgangskontrol til at fokusere på overfladen af slimhinden og klik begynde.Fokuser på den nederste grænse for, hvor signalet stadig kan registreres, og klik på ende. Definer antallet af Z-stakke, undgå tidsforfald længere end to minutter for to på hinanden følgende tidspunkter og åbne tidsmenuen for at vælge minimere og erhverve indtil stop. Hvis du vil definere linjegennemsnittet, skal du vælge Søg efter et, linjegennemsnit to, søg to og linjegennemsnit to.Derefter at erhverve billeder, skal du indstille formatet til 1024 x 1024 pixels og hastigheden til 400 og klik start. Intestinal epitelcelle-specifikke GGTase mangelfuld betingede mus udviklet svær intestinal patologi som påvist ved en stigning i histologiske skader score af tyndtarmen og øget intestinal epitelperabilitet kan også påvises via sporstof i in-vivo eksperimenter ved hjælp af oralt administreret FITC-dextran. Celle kaste begivenheder kunne identificeres som celler bevæger sig ud af epitelmonolayer i lumen, fører til midlertidige huller i loftet af epitel, der er endeligt lukket af kontakten mellem de omkringliggende celler, en såkaldt lynlås effekt.Disse huller er observeret i både kontrol og GGTase mangelfuld mus, selv om hyppigheden af disse fænomen er højere i sidstnævnte. Interessant, andre celler synes også at optagelse dextran. Disse såkaldte gennemtrængelige cellehændelser forekommer også hovedsageligt i betingede knockoutmus.Immunostaining af cytoskelet-relaterede og stramme kryds proteiner af interesse kan udføres for at identificere specifikke mål, der bidrager til potentielle epitelperibilitet forstyrrelser bestemmes via intravital mikroskopi. Denne metode kan anvendes til analyse af andre fænomener på overfladen af tarmslimhinden, såsom endotellækage eller immun epitelkommunikation i forbindelse med tarminfektion.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP som en ny metode til at forhindre infektion: Forberedelse og<em&gt; In vitro</em&gt; Antimikrobielle egenskaber af PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplade Assay til vurdering af kemiske Virkninger på RBL-2H3 mastcelledegranulering: Effekter af Triclosan uden brug af et organisk opløsningsmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Udvikling af en IFN-γ ELISpot Assay til Vurdere varicellazostervirus-specifik cellemedieret immunitet Efter navlestrengsblod transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

En Robust Lungebetændelse Model i immunkompetente Gnavere at evaluere Antibakteriel Effekt mod<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; eller<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Ved hjælp af human induceret pluripotente stamceller-afledte tarm Organoider til at studere og ændre epitelial cellebeskyttelse mod salmonella og andre patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...