Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van het People Program (Marie Curie Actions) in het kader van REA-subsidieovereenkomst nummer 302170 van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013); het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Universiteit Erlangen-Neurenberg; het Collaborative Research Center TRR241 en de Clinical Research Group KFO257 van de Duitse Onderzoeksraad (DFG); en de DFG.

Het volgende protocol is goedgekeurd door de bevoegde lokale autoriteiten in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland). Muizen werden ondergebracht onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden.
OPMERKING: Remming van GGTase-gemedieerde prenylation binnen IECs veroorzaakt een ernstige verandering van darmomvang bij Pggt1biΔIEC muizen24. Daarom werd dit muismodel gebruikt om aan te tonen hoe het protocol nuttig kan zijn om da...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Hoewel technisch uitdagend, intravital microscopie-gebaseerde methodologie vertegenwoordigt een unieke experimentele aanpak om zeer dynamisch cellulair proces visualiseren in real time, zoals cel vergieten prestaties. Tot nu toe is er geen alternatieve experimentele benadering om celextrusie in vivo te visualiseren. Wij geloven dat dit protocol kan bijdragen aan de beschrijving van diverse cellulaire processen die een rol spelen bij het behoud van darmhomeostase.
Gebruikmakend van intravitale ...

De darm is een zeer gespecialiseerd orgaan met een strak gereguleerde functie die conflicterende processen mogelijk maakt, namelijk voeding en bescherming tegen schadelijke luminale stoffen. Voering tussen het menselijk lichaam en het milieu, het darmeptheel fungeert als een fysieke en immunologische barrière en draagt bij aan het behoud van mucosale homeostase in de darm1,2. Verlies van epitheliale integriteit en verhoogde nauwe verbindingdoorlaatbaarheid is bekend te worden geassocieerd met inflammatoire darmziekte (IBD)3,4,5,6. Epitheelveranderingen worden vervolgens beschouwd als oorzaken en secundaire versterkers voor chronische darmontsteking in IBD. Zo zou een beter begrip van vroege epitheliale veranderingen in de darm van IBD-patiënten van onschatbare waarde zijn voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om epitheelintegriteit te herstellen voor betrouwbare voorspelling en latere preventie van IBD-terugval.
Darmeptheel volgt een complex en strak gereguleerd omzetproces. Vanaf de cryptebodem migreren terminaal gedifferentieerde darmeptropepitheelcellen (IECs) afkomstig van pluripotente stamcellen naar boven naar de villuspunt, waar verouderde/beschadigde cellen in het lumen7worden vergoten. Het evenwicht tussen deling en celextrusie maakt het behoud van darmeppitheelcelnummers mogelijk, waardoor de vorming van hiaten en lekkage wordt vermeden, evenals de accumulatie van epitheliale cellen die mogelijk leiden tot celmassa's en tumorigenese8,9,10. Ondanks de sleutelrol van epitheelcelvergieten in de fysiologische vernieuwing van het darmeptheel, is de kennis over de moleculaire mechanismen die de extrusie van cellen op de villus-tip stimuleren beperkt. Zo is er behoefte aan fundamenteel onderzoek dat een nauwkeurige beschrijving geeft van de volgorde van moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij epitheliale celvergieten.
Complexe interacties tussen verschillende celtypen binnen het darmslijmvlies zijn essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die epitheliale omzet en darmhomeostase reguleren. In vivo studies bieden in deze context dus hoge voordelen ten opzichte van in vitro- en ex vivo-benaderingen. Bovendien maken real-time beeldvormingstechnieken de beschrijving mogelijk van de volgorde van gebeurtenissen die specifieke verschijnselen beheersen. In deze context vereist de studie van zeer dynamische processen het gebruik van geoptimaliseerde hogeresolutietechnieken voor de directe observatie van het weefsel. Intravital imaging technieken verschijnen als unieke geschikte instrumenten voor de studie van epitheelcel vergieten in de darm.
De term "intravitale microscopie" verwijst naar experimentele benaderingen die gebruik maken van beeldvormingstechnieken met hoge resolutie (multifoton of confocale microscopie) om cellen en weefsels in hun eigen omgeving direct te visualiseren binnen een levend dier11. Het maakt real-time verwerving van in vivo informatie tot single-cell resolutie, en brengt duidelijke voordelen ten opzichte van statische of lage resolutie methoden. Intravital microscopie biedt aanvullende informatie en overwin enkele beperkingen van klassieke en/of high-end technieken, zoals artefacten als gevolg van weefselverwerking. De belangrijkste beperking van intravitale microscopie daarentegen is dat het weefsel direct aan de microscoop moet worden blootgesteld, wat in de meeste gevallen een operatie vereist. Hoewel geavanceerde benaderingen de vitaliteit behouden en de impact van het afgebeelde weefsel minimaliseren (huidplooikamers en beeldvensters)12,13, wordt in de meeste gevallen een eenvoudige huidincisie uitgevoerd voor de externalisatie van het weefsel (huidflappen)14. In de afgelopen tien jaar hebben deze benaderingen belangrijke bewijzen geleverd over zeer dynamische processen, die voorheen ondoorgrondelijk waren. Translationally, real-time imaging leverde nieuwe biologische inzichten op over stamcel en leukocyten homing15, evenals kanker verspreiding en metastase vorming13,16. In de klinische context wordt endomicroscopie momenteel gebruikt als diagnostisch instrument voor kanker17 en maag- en darmziekten, zoals IBD18,19; terwijl confocale mozaïeken microscopie een snelle pathologie tool werd tijdens de operatie20. Intravital microscopie is de laatste tijd samen uitgegroeid tot een waardevol en veelzijdig hulpmiddel voor biomedisch onderzoek en toekomstige toepassing in de kliniek.
Intravital microscopie wordt hier geïmplementeerd voor real-time visualisatie van darmeppitheellekkage en observatie van epitheliale celvergietende gebeurtenissen. Lekkage van darmpermeabiliteit kan worden geïdentificeerd door andere in vivo niet-invasieve technieken, zoals kwantificering van orale toediening van fluorescerende tracers in serum21. Deze techniek staat echter niet toe dat de prestaties direct worden waargenomen, noch de segregatie tussen para- en transcellulaire doorlaatbaarheid. De combinatie van standaard tracerexperimenten en intravitale microscopie is een geschikte benadering van: i) het identificeren van verstoringen in darmdoorlatendheid, en ii) scheiden tussen para- en transcellulaire epitheelpermeabiliteit. Naast celvergieten maakt intravitale microscopie in combinatie met in vivo fluorescentie-etikettering de studie van andere cellulaire en moleculaire mechanismen mogelijk (bijvoorbeeld een strikte verbindingsherverdeling tijdens celvergieten met tl-reportermuizen22 of interacties tussen IDC's en andere cellen binnen het darmslijmvlies23).
De hier gepresenteerde methode vertegenwoordigt een aanpassing van intravitale microscopie om real-time observatie van darmslijmvlies mogelijk te maken, met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM). Daarom gebruiken we voorwaardelijke knock-out muizen van GGTase (Geranylgeranyltransferase) in darmeppitheelcellen (IECs) in (Pggt1biΔIEC muizen), omdat ze lijden aan een ernstige darmziekte en verhoogde epitheliale permeabiliteit24. Chirurgische voorbereiding van de muis en kleuring van het darmslijmvlies, evenals de juiste instellingen die worden gebruikt voor het verwerven van beeldvorming en analyse na de overname worden beschreven. Dit protocol zou toekomstige studies mogelijk kunnen maken die bijdragen aan de huidige kennis over dynamiek en kinetiek van darmepitheelcelvergieten. Bovendien zou het protocol kunnen dienen als basis voor verschillende aanpassingen om andere verschijnselen te bestuderen die zich voordoen aan het oppervlak van het darmslijmvlies, en zelfs bij andere weefsels.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Intravitale microscopie van de darm met behulp van confocale beeldvorming maakt real-time observatie van epitheelcelvergieten en barrièrelekkage bij levende dieren mogelijk. Daarom is het darmslijmvlies van verdoofde muizen geigreerd met niet-specifieke vlekken (acriflavine) en een fluorescerende tracer (rhodamine-B dextran), gemonteerd op een zoute oplossingsspoelplaat en direct afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Deze techniek kan een aanvulling vormen op andere niet-invasieve technieken om lekkage van darmdoorlatendheid te identificeren, zoals transmucosale passage van oraal toegediende tracers. Daarnaast maakt de hier gepresenteerde aanpak het mogelijk om de gebeurtenissen in celvergieten in real-time te observeren. In combinatie met geschikte fluorescerende reportermuizen is deze aanpak geschikt om licht af te werpen in cellulaire en moleculaire mechanismen die darmeppitheelcelextrusie controleren, evenals aan andere biologische processen. In de afgelopen decennia hebben interessante studies met behulp van intravitale microscopie bijgedragen aan kennis over endotheeldoorlatendheid, immuuncelearm homing, immuun-epitheliale communicatie en invasie van luminale componenten, onder anderen. Samen zou het hier gepresenteerde protocol niet alleen bijdragen tot een groter begrip van mechanismen die epitheliale celextrusie controleren, maar ook de basis kunnen vormen voor de ontwikkeling van andere benaderingen die moeten worden gebruikt als instrumenten om andere zeer dynamische cellulaire processen te visualiseren, zelfs in andere weefsels. Onder technische beperkingen zouden de optische eigenschappen van het specifieke weefsel, evenals de geselecteerde beeldvormingstechnologie en microscoopconfiguratie, op zijn beurt de beeldafstand en de resolutie van verworven beelden bepalen.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een intravitale microscopiegebaseerde benadering om darmepelende lekkage te visualiseren en de prestaties van celafstoten in de darm in real-time te observeren. Kortom, muizen worden verdoofd en voorgelegd aan chirurgische voorbereiding om het oppervlak van het dunne darmslijmvlies bloot te stellen. IECs worden vervolgens gekleurd via actuele toepassing van acriflavine; terwijl luminale rhodamine B-dextran wordt gebruikt als tracers om transmuco...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Met behulp van intravitale microscopie maakt dit protocol de real-time visualisatie van darmweefsel mogelijk tot een eencellige resolutie en de studie van zeer dynamische processen zoals celafstoten. In combinatie met de standaard tracer experimenten, dit protocol maakt het mogelijk de identificatie van zowel darmdoorlaatbaarheid verstoringen in vivo en het onderscheid tussen para en transcellulaire doorlaatbaarheid. Dit protocol kan worden gebruikt als basis voor de ontwikkeling van aanvullende intravitale microscopie benaderingen voor het visualiseren van andere zeer dynamische cellulaire processen van belangen binnen verschillende weefsels.Visuele demonstratie van deze methode is essentieel om de chirurgische voorbereidingsstappen te begrijpen en het levende dier zo te positioneren dat beeldverwerving op het darmslijmvlies mogelijk maakt. Schakel voor het begin van de procedure de basis- en scannerbox van een confocale laserscanmicroscoop in en druk op start om de computer in te schakelen. Start de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en selecteer de juiste configuratie.Als u de juiste afbeeldingsresolutie wilt instellen, selecteert u configuratie, hardware, resolutie, bitdiepte en 12. Selecteer onder het acquisitiemenu XYZT voor de beeldacquisitiemodus en stel de doelstelling in op 20 of 40X. Als u de sequentiële acquisitie-instelling wilt instellen, klikt u op zoeken en toevoegen en selecteren tussen frames.Als u reeks één wilt configureren, schakelt u de zichtbare laserbox in. Stel fotomultiplier buis een op en definieer de emissie golflengte. Als u reeks twee wilt configureren, schakelt u de zichtbare laserbox in.Stel fotomultiplier buis twee aan op en definieer de emissiegolflengte. Activeer vervolgens de juiste lasers. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teenknijpen, gebruik een wattenstaaf om zalf toe te passen op de ogen van de verdoofde muis en een incisie van één centimeter te maken in het linker ventrikelgebied van de buik.Gebruik tangen om een drie tot vijf centimeter segment van de darm te exterioriseren. Maak twee kleine insnijdingen aan de boven- en onderkant van het darmsegment en introduceer een glazen micropipet in het darmlumen. Gebruik vervolgens elektrocauterisatie om het buitengeïnteriseerde darmsegment langs de anti-mesenterische kant te openen en het slijmvlies bloot te leggen.Spoel het weefsel kort af met een zoutoplossing om het fecale gehalte te verwijderen. Voor het bevlekken van het darmslijmvlies oppervlak, van toepassing 100 microliter van een een milligram per milliliter van acriflavine oplossing in druppels op het blootgestelde slijmvlies oppervlak en laat de vlek te ontwikkelen gedurende drie minuten voor het uitwassen van de resterende oplossing met PBS. Breng vervolgens 100 microliters van een twee milligram per milliliter rhodamine dextran-oplossing in druppels aan op het slijmvlies voor incubatie van drie minuten voordat u met PBS wast.Plaats vervolgens de verdoofde muis supine op een cover slide gemonteerd op de kamer gespoeld met 37 graden Celsius zoutoplossing, het aanpassen van de positie indien nodig, en plaats het preparaat op de omgekeerde microscoop stadium. Onmiddellijk na het plaatsen van de muis op het podium, zet de lichtbron en pas de XY positie totdat de verlichting as is gericht op het weefsel voorbereiding. Selecteer de juiste filterkubus om het gezichtsveld te selecteren.Open de sluiter en gebruik de macro- en microwielen om zich te concentreren op het oppervlak van het darmslijmvlies. Pas de XY-positie aan om een gebied te vinden waarin meerdere villi kan worden gevisualiseerd in het gezichtsveld en wijzig de filterkubus om te controleren of de rhodamine dextran-kleuring ook zichtbaar is in dat gebied. Wanneer een interessegebied is geïdentificeerd, start u de beeldverwerving en selecteert u sequentie één om de laserkracht, versterking en compensatie voor reeks één aan te passen.Selecteer vervolgens volgeop twee en pas de laserkracht, versterking en verschuiving voor serie twee aan. Als u het Z-stack-bereik wilt definiëren, opent u het inlevermenu met Z-stack. Gebruik het Z-access-besturingselement om je te concentreren op het oppervlak van het slijmvlies en klik op beginnen.Focus op de onderste limiet van waar het signaal nog detecteerbaar is en klik op einde. Definieer het aantal Z-stacks, vermijd time-lapses langer dan twee minuten voor twee opeenvolgende tijdstippen en open het tijdmenu om minimaliseren te selecteren en te verwerven tot stoppen. Als u het regelgemiddelde wilt definiëren, selecteert u zoeken naar één, regelgemiddelde twee, zoekt twee en regelgemiddelde twee.Stel vervolgens het formaat in op 1024 x 1024 pixels en de snelheid op 400 en klik op start. Darmeptheelcelspecifieke GGTase-tekort voorwaardelijke muizen ontwikkelden ernstige darmpathologie, zoals blijkt uit een toename van de histologische schadescore van de dunne darm en verhoogde darmeppilelbaarheid kan ook worden gedetecteerd via tracer in in-vivo experimenten met oraal toegediende FITC-dextran. Celvergieten gebeurtenissen kunnen worden geïdentificeerd als cellen bewegen uit de epitheliale monolaag in het lumen, wat leidt tot tijdelijke hiaten in het plafond van het epitheel die uiteindelijk worden gesloten door het contact tussen naburige cellen, een zogenaamde rits effect.Deze hiaten worden waargenomen in zowel controle als GGTase tekort muizen, hoewel de frequentie van dit fenomeen hoger is in de laatste. Interessant is dat andere cellen ook lijken te nemen dextran. Deze zogenaamde doorlatende celgebeurtenissen komen ook vooral voor bij voorwaardelijke knock-outmuizen.De immunosmet betrekking tot cytoskelet-gerelateerde en strakke knooppunteiwitten van belang kunnen worden uitgevoerd om specifieke doelen te identificeren die bijdragen aan potentiële epitheliale permeabiliteitsverstoringen die worden bepaald via intravitale microscopie. Deze methode kan worden gebruikt voor de analyse van andere verschijnselen op het oppervlak van het darmslijmvlies, zoals endotheliale lekkage of immuuneptheelcommunicatie in de context van darminfectie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP als een nieuwe aanpak om infectie te voorkomen: Voorbereiding en<em&gt; In vitro</em&gt; Antimicrobiële eigenschappen van PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

Een robuuste Longontsteking Model in Immunocompetente Knaagdieren om Antibacteriële Werkzaamheid Evalueer tegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; of<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...