Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
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Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People Program (Marie-Curie-Maßnahmen) im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung Nr. 302170 des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7/2007-2013) finanziert. das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Universität Erlangen-Nürnberg; das Sonderforschungsbereich TRR241 und die Klinische Forschungsgruppe KFO257 des Deutschen Forschungsrates (DFG); und der DFG.

Das folgende Protokoll wurde von den zuständigen Gemeinden in Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Deutschland) genehmigt. Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht.
HINWEIS: Die Hemmung der GGTase-vermittelten Pränylierung innerhalb der IECs führt zu einer starken Veränderung der24Darmdurchlässigkeit bei Pggt1b-I-IEC-Mäusen 24 . Pggt1biΔIEC Daher wurde dieses Mausmodell verwendet, um zu demonstriere...

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	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Obwohl die intravitale Mikroskopie-basierte Methodik technisch anspruchsvoll ist, stellt sie einen einzigartigen experimentellen Ansatz dar, um hochdynamische zelluläre Prozesse in Echtzeit zu visualisieren, wie z. B. die Zellabwurfleistung. Bisher gibt es keinen alternativen experimentellen Ansatz zur Visualisierung der Zellextrusion in vivo. Wir glauben, dass dieses Protokoll zur Beschreibung verschiedener zellulärer Prozesse beitragen kann, die eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase spielen.
<p...

Der Darm ist ein hochspezialisiertes Organ mit einer streng regulierten Funktion, die widersprüchliche Prozesse ermöglicht, nämlich Ernährung und Schutz vor schädlichen Leuchtstoffen. Das Darmepithel wirkt als physikalische und immunologische Barriere und trägt zur Aufrechterhaltung der Schleimhautostase im Darm1,2bei. Verlust der epitheliale Integrität und erhöhte enge Knotendurchlässigkeit ist bekannt, mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) verbunden sein3,4,5,6. Epithelveränderungen werden dann als Ursachen und Sekundärverstärker für chronische Darmentzündungen bei IBD betrachtet. Somit wäre ein verbessertes Verständnis der frühen epitheliale Veränderungen im Darm von IBD-Patienten von immensem Wert für die Entwicklung neuer Strategien zur Wiederherstellung der Epithelintegrität für eine zuverlässige Vorhersage und anschließende Prävention von IBD-Rückfällen.
Das Darmepithel folgt einem komplexen und streng regulierten Umsatzprozess. Vom Kryptaboden wandern endlos differenzierte Darmepithelzellen (IECs), die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitet sind, nach oben zur Villusspitze, wo gealterte/geschädigte Zellen in das Lumen7vergossen werden. Das Gleichgewicht zwischen Teilung und Zellextrusion ermöglicht die Aufrechterhaltung von Darmepithelzellzahlen, wodurch die Bildung von Lücken und Leckagen vermieden wird, sowie die Ansammlung von Epithelzellen, die potenziell zu Zellmassen und Tumorgenese8,9,10führen. Trotz der Schlüsselrolle des Epithelzellvergießens bei der physiologischen Erneuerung des Darmepithels ist das Wissen über die molekularen Mechanismen, die die Extrusion von Zellen an der Villusspitze vorantreiben, begrenzt. Daher ist eine Grundlagenforschung erforderlich, die eine genaue Beschreibung der Abfolge molekularer Ereignisse liefert, die an der Epithelzellvergießen beteiligt sind.
Komplexe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der Darmschleimhaut sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die den Epithelumsatz und die Darmhomöostase regulieren. In-vivo-Studien bieten in diesem Zusammenhang hohe Vorteile gegenüber In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Darüber hinaus ermöglichen Echtzeit-Bildgebungstechniken die Beschreibung der Abfolge von Ereignissen, die bestimmte Phänomene steuern. In diesem Zusammenhang erfordert die Untersuchung hochdynamischer Prozesse den Einsatz optimierter hochauflösender Techniken zur direkten Beobachtung des Gewebes. Intravitale bildgebende Verfahren erscheinen als einzigartige geeignete Werkzeuge für die Untersuchung von Epithelzellvergießen im Darm.
Der Begriff "Intravitale Mikroskopie" bezieht sich auf experimentelle Ansätze, bei denen hochauflösende bildgebende Verfahren (Multiphotonen- oder Konfokalmikroskopie) genutzt werden, um Zellen und Gewebe in ihrer heimischen Umgebung innerhalb eines lebenden Tieres direkt zu visualisieren11. Es ermöglicht die Echtzeiterfassung von In-vivo-Informationen bis hin zur Einzelzellauflösung und bringt klare Vorteile gegenüber statischen oder niedrig auflösenden Methoden mit sich. Die Intravital-Mikroskopie bietet ergänzende Informationen und überwindet einige Einschränkungen klassischer und/oder High-End-Techniken, wie z. B. Artefakte aufgrund der Gewebeverarbeitung. Im Gegensatz dazu besteht die Hauptbeschränkung der intravitalen Mikroskopie darin, dass das Gewebe direkt dem Mikroskop ausgesetzt werden sollte, was in den meisten Fällen einer Operation bedarf. Obwohl ausgeklügelte Ansätze die Vitalität bewahren und die Auswirkungen des abgebildeten Gewebes (Hautkammern und bildgebende Fenster)12,13minimieren, wird in den meisten Fällen ein einfacher Hautschnitt für die Externalisierung des Gewebes (Hautklappen) durchgeführt14. In den letzten zehn Jahren haben diese Ansätze wichtige Beweise für hochdynamische Prozesse beigesteuert, die zuvor undurchschaubar waren. Übersetzt lieferte die Echtzeit-Bildgebung neue biologische Erkenntnisse über Stammzell und Leukozyten mit15, sowie Krebsverbreitung und Metastasenbildung13,16. Im klinischen Kontext wird die Endomikroskopie derzeit als diagnostisches Instrument für Krebs17 und Magen-Darm-Erkrankungen wie IBD18,19genutzt; während konfokale Mosaikmikroskopie wurde ein schnelles Pathologie-Werkzeug während der Operation20. Gemeinsam hat sich die intravitale Mikroskopie in letzter Zeit zu einem wertvollen und vielseitigen Werkzeug für die biomedizinische Forschung und zukünftige Anwendung in der Klinik entwickelt.
Die Intravital-Mikroskopie ist hier für die Echtzeit-Visualisierung der Darmepithel-Leckage und die Beobachtung von Epithelzellabwurfereignissen implementiert. Die Leckage der Darmdurchlässigkeit kann durch andere in vivo nichtinvasive Techniken identifiziert werden, wie die Quantifizierung der oralen Verabreichung von fluoreszierenden Tracern im Serum21. Diese Technik erlaubt jedoch weder die direkte Beobachtung der Abwurfleistung noch die Segregation zwischen para- und transzellulärer Durchlässigkeit. Die Kombination von Standard-Tracer-Experimenten und intravitaler Mikroskopie stellt einen geeigneten Ansatz dar, um: i) Störungen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren und ii) zwischen para- und transzellulärer Epithelpermeabilität zu trennen. Neben dem Zellabwurf ermöglicht die intravitale Mikroskopie in Kombination mit der In-vivo-Fluoreszenzkennzeichnung die Untersuchung anderer zellulärer und molekularer Mechanismen (z. B. enge Umverteilung der Verbindung beim Zellabwurf mit fluoreszierenden Reportermäusen22 oder Wechselwirkungen zwischen IECs und anderen Zellen innerhalb der Darmschleimhaut23).
Die hier vorgestellte Methode stellt eine Anpassung der intravitalen Mikroskopie dar, um die Echtzeitbeobachtung der Darmschleimhaut mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) zu ermöglichen. Daher verwenden wir bedingte Knock-out-Mäuse von GGTase (Geranylgeranyltransferase) in Darmepithelzellen (IECs) bei (Pggt1bi-IEC-Mäusen), da sie an einer schweren Darmerkrankung und erhöhter epithelialen Permeabilität leiden24. Die chirurgische Präparation der Maus und die Färbung der Darmschleimhaut sowie geeignete Einstellungen für die bildgebende Erfassung und Nacherfassungsanalyse werden beschrieben. Dieses Protokoll könnte zukünftige Studien ermöglichen, die zum aktuellen Wissen über Dynamik und Kinetik des Darmepithelzellabwurfs beitragen. Darüber hinaus könnte das Protokoll als Grundlage für verschiedene Anpassungen dienen, um andere Phänomene zu untersuchen, die an der Oberfläche der Darmschleimhaut und sogar an anderen Geweben auftreten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Die intravitale Mikroskopie des Darms mittels konfokaler Bildgebung ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Epithelzellvergießen und Barrierelecks bei lebenden Tieren. Daher ist die Darmschleimhaut von anästhesierten Mäusen topisch mit unspezifischen Färbungen (Acriflavin) und einem fluoreszierenden Tracer (Rhodamine-B-Dextran) befleckt, auf einer kochstofffreien, vorspülenden Platte montiert und direkt mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Diese Technik kann andere nicht-invasive Techniken ergänzen, um Leckagen der Darmdurchlässigkeit zu identifizieren, wie z. B. transmukosale Passagen oral verabreichter Tracer. Darüber hinaus ermöglicht der hier vorgestellte Ansatz die direkte Beobachtung von Zellabwurfereignissen in Echtzeit. In Kombination mit geeigneten fluoreszierenden Reportermäusen eignet sich dieser Ansatz, um Licht in zelluläre und molekulare Mechanismen zur Steuerung der Darmepithelzellextrusion sowie in andere biologische Prozesse zu werfen. In den letzten Jahrzehnten haben interessante Studien mit intravitaler Mikroskopie unter anderem zu Erkenntnissen über endotheliale Permeabilität, Immunzelldarmhoming, immunepitheliale Kommunikation und Invasion von Leuchtkörperkomponenten beigetragen. Zusammen würde das hier vorgestellte Protokoll nicht nur dazu beitragen, das Verständnis von Mechanismen zur Steuerung der Epithelzellextrusion zu erhöhen, sondern könnte auch die Grundlage für die Entwicklung anderer Ansätze sein, die als Instrumente zur Visualisierung anderer hochdynamischer zellulärer Prozesse, auch in anderen Geweben, verwendet werden sollen. Unter den technischen Einschränkungen würden die optischen Eigenschaften des spezifischen Gewebes sowie die ausgewählte Bildgebungstechnologie und Mikroskopkonfiguration wiederum den bildgebenden Arbeitsabstand und die Auflösung der aufgenommenen Bilder bestimmen.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen intravitalen Mikroskopie-basierten Ansatz zur Visualisierung von Darmepithellecks und zur Beobachtung der Zellabwurfleistung im Darm in Echtzeit. Kurz gesagt, Mäuse werden anästhesiert und der chirurgischen Präparation unterzogen, um die Oberfläche der Dünndarmschleimhaut freizulegen. IECs werden dann durch topische Anwendung von Acriflavine gefärbt; während luminale Rhodalin B-Dextran als Tracer verwendet wird, um transmukosale Pass...

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An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Mit hilfe der intravitalen Mikroskopie ermöglicht dieses Protokoll die Echtzeit-Visualisierung von Darmgewebe bis zu einer einzelzelligen Auflösung und die Untersuchung hochdynamischer Prozesse wie zellabwurf. In Kombination mit den Standard-Tracer-Experimenten ermöglicht dieses Protokoll die Identifizierung sowohl von Darmpermeabilitätsstörungen in vivo als auch der Unterscheidung zwischen para- und transzellulärer Permeabilität. Dieses Protokoll könnte als Grundlage für die Entwicklung zusätzlicher intravitaler Mikroskopieansätze zur Visualisierung anderer hochdynamischer zellulärer Interessenprozesse in verschiedenen Geweben dienen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um die chirurgischen Präparationsschritte zu verstehen und das lebende Tier so zu positionieren, dass die Bildaufnahme auf der Darmschleimhautoberfläche erleichtert wird. Bevor Sie mit dem Vorgang beginnen, schalten Sie die Basis- und Scannerbox eines konfokalen Laserscanmikroskops ein und drücken Sie den Computer ein. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware, und wählen Sie die entsprechende Konfiguration aus.Um die entsprechende Bildauflösung festzulegen, wählen Sie Konfiguration, Hardware, Auflösung, Bittiefe und 12 aus. Wählen Sie im Aufnahmemenü XYZT für den Bildaufnahmemodus aus und setzen Sie das Ziel auf 20 oder 40X. Um die Einstellung für die sequenzielle Erfassung einzurichten, klicken Sie auf Suchen und Hinzufügen und Auswählen zwischen Frames.Um Sequenz eins zu konfigurieren, schalten Sie die sichtbare Laserbox ein. Stellen Sie photomultiplier Tube eins auf und definieren Sie die Emissionswellenlänge. Um Sequenz zwei zu konfigurieren, schalten Sie die sichtbare Laserbox ein.Stellen Sie photomultiplier Rohr zwei auf und definieren Sie die Emissionswellenlänge. Aktivieren Sie dann die entsprechenden Laser. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen, verwenden Sie eine Baumwollknospe, um Salbe auf die Augen der anästhesierten Maus aufzutragen und einen ein Zentimeter großen Schnitt im linken Ventrikelbereich des Bauches zu machen.Verwenden Sie Zangen, um ein drei- bis fünf Zentimeter großes Segment des Darms zu exteriorisieren. Machen Sie zwei kleine Einschnitte an der Ober- und Unterseite des Darmsegments und führen Sie eine Glasmikropipette in das Darmlumen ein. Dann verwenden Sie die Elektrokauterisierung, um das exteriorisierte Darmsegment längs entlang der anti-mesenterischen Seite zu öffnen und die Schleimhaut freizulegen.Spülen Sie das Gewebe kurz mit einer Salinelösung, um den Fäkaliengehalt zu entfernen. Zur Färbung der Darmschleimhautoberfläche 100 Mikroliter eines Milligramm pro Milliliter Acriflavine-Lösung in Tröpfchen auf die exponierte Schleimhautoberfläche auftragen und den Fleck drei Minuten lang entwickeln lassen, bevor er die restliche Lösung mit PBS auswaschen kann. Als nächstes 100 Mikroliter einer zwei Milligramm pro Milliliter Rhodamine-Dextran-Lösung in Tröpfchen auf die Schleimhaut für drei Minütige Inkubation vor dem Waschen mit PBS anwenden.Dann legen Sie die anästhesierte Maus-Supine auf eine Abdeckungsrutsche, die auf der mit 37 Grad Celsius-Saline abspülten Kammer montiert ist, wobei die Position bei Bedarf angepasst wird, und legen Sie das Präparat auf die invertierte Mikroskopstufe. Unmittelbar nach dem Platzieren der Maus auf die Bühne, schalten Sie die Lichtquelle ein und passen Sie die XY-Position an, bis die Beleuchtungsachse auf das Gewebepräparat fokussiert ist. Um das Sichtfeld auszuwählen, wählen Sie den entsprechenden Filterwürfel aus.Öffnen Sie den Verschluss und verwenden Sie die Makro- und Mikroräder, um sich auf die Oberfläche der Darmschleimhaut zu konzentrieren. Passen Sie die XY-Position an, um einen Bereich zu finden, in dem mehrere Zotten im Sichtfeld visualisiert werden können, und ändern Sie den Filterwürfel, um sicherzustellen, dass die Rhodamine dextran Färbung auch in diesem Bereich sichtbar ist. Wenn ein Interessenbereich identifiziert wurde, starten Sie die Bildaufnahme und wählen Sie Sequenz eins aus, um die Laserleistung, Verstärkung und Versatz für Sequenz 1 anzupassen.Wählen Sie dann Sequenz zwei aus und passen Sie die Laserleistung, Verstärkung und Versatz für Sequenz zwei an. Um den Z-Stack-Bereich zu definieren, öffnen Sie das Drop-off-Menü Z-Stack. Verwenden Sie die Z-Access-Steuerung, um sich auf die Oberfläche der Schleimhaut zu konzentrieren, und klicken Sie auf start.Konzentrieren Sie sich auf die untere Grenze, wo das Signal noch erkennbar ist, und klicken Sie auf Ende. Definieren Sie die Anzahl der Z-Stacks, vermeiden Sie Zeitraffer länger als zwei Minuten für zwei aufeinander folgende Zeitpunkte, und öffnen Sie das Zeitmenü, um minimieren und erfassen sie bis zum Anhalten auszuwählen. Um den Zeilendurchschnitt zu definieren, wählen Sie Suchen eins, Liniendurchschnitt zwei, Suchen zwei und Liniendurchschnitt zwei aus.Um Bilder zu erfassen, stellen Sie das Format auf 1024 x 1024 Pixel und die Geschwindigkeit auf 400 ein und klicken Sie auf Start. Intestinale Epithelzellspezifische GGTase-mangelhafte bedingte Mäuse entwickelten eine schwere Darmpathologie, wie eine Erhöhung des histologischen Schadensscores des Dünndarms und eine erhöhte Darmepithelperthelperabilität auch über Tracer in In-vivo-Experimenten mit oral verabreichtem FITC-Dextran nachgewiesen werden können. Zellabwurfereignisse konnten als Zellen identifiziert werden, die sich aus der epithelialen Monoschicht in das Lumen bewegen, was zu temporären Lücken in der Decke des Epithels führt, die schließlich durch den Kontakt zwischen benachbarten Zellen geschlossen werden, ein sogenannter Reißverschlusseffekt.Diese Lücken werden sowohl bei Kontroll- als auch bei GGTase-Mäusen beobachtet, obwohl die Häufigkeit dieser Phänomene bei letzteren höher ist. Interessanterweise scheinen auch andere Zellen Dextran aufzunehmen. Diese sogenannten durchlässigen Zellereignisse treten auch hauptsächlich bei bedingten Knockout-Mäusen auf.Die Immunostainierung von zytoskelettbedingten und engen Junction-Proteinen von Interesse kann durchgeführt werden, um spezifische Ziele zu identifizieren, die zu potenziellen Epithelpermbarkeitsstörungen beitragen, die durch intravitale Mikroskopie bestimmt werden. Diese Methode kann für die Analyse anderer Phänomene auf der Oberfläche der Darmschleimhaut verwendet werden, wie endotheliale Leckage oder Immunepithelkommunikation im Zusammenhang mit Darminfektionen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP als neuer Ansatz, um eine Infektion zu verhindern: Vorbereitung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Antimikrobielle Eigenschaften von PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Verwendung von humaninduzierten, zellabgeleiteten Intestarz-Organoiden zur Untersuchung und Modifizierung des epithelialen Zellschutzes gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...