Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מהתוכנית "פעולות מארי קירי" במסגרת הסכם מענק REA מספר 302170 של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013); המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג; מרכז המחקר השיתופי TRR241 ו-KFO257 של מועצת המחקר הגרמנית (DFG); וה-די.אף.ג'י.

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיות בארלאנגן (רג'ירונג פון אונטרפרנקן, וירצבורג, גרמניה). עכברים היו אוחסנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן.
הערה: עיכוב של prenylation בתיווך GGTase בתוך IECs גורם לשינוי חמור של חחללות מעיים בעכברים iPc24 Pggt1biPc . לכן, מ?...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

למרות שמבחינה טכנית מאתגרת, מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצגת גישה ניסיונית ייחודית כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד בזמן אמת, כגון ביצועי שפיכת תאים. עד כה, אין גישה ניסיונית חלופית כדי לדמיין את הבלטת התא ב vivo. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לתרום לתיאור של תהליכים סלולרי?...

המעי הוא איבר מיוחד מאוד עם פונקציה מוסדרת היטב המאפשרת תהליכים סותרים, כלומר תזונה והגנה מפני חומרים זוהרים מזיקים. רירית בין גוף האדם לסביבה, אפיתל המעי פועל כמחסום פיזי ואימונולוגי ותורם לתחזוקה של הומאוסטאזיס רירית בבטן1,,2. אובדן שלמות אפיתל וחחלת צומת הדוקה מוגברת ידוע להיות קשור עם מחלות מעי דלקתיות (IBD)3,,4,,5,,6. שינויים אפיתל נחשבים לאחר מכן כגורמים ומדלקים משניים לדלקת מעיים כרונית בIBD. לכן, הבנה משופרת של שינויים אפיתל מוקדם בבטן של חולי IBD יהיה בעל ערך עצום לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי לשחזר את שלמות האפיתל לחיזוי אמין ומניעה שלאחר מכן של נסיגה IBD.
אפיתל מעיים עוקב אחר תהליך תחלופה מורכב ומוסדר היטב. מתחתית הקריפטה, תאי אפיתל מעיים מובחן סופני (IECs) המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים נודדים כלפי מעלה אל קצה הווילוס, שם נשפכים תאיםבגילאים/פגומים לתוךהלומן 7 . שיווי המשקל בין החלוקה לבין שברי התא מאפשר תחזוקה של מספרי תאי אפיתל מעיים, הימנעות היווצרות של פערים ודליפה, כמוגם הצטברותשל תאי אפיתל שעלולים להוביל להסימת תאיםותאי גידולים 8,9,10 . למרות התפקיד המרכזי של שפיכת תאי אפיתל בחידוש הפיזיולוגי של אפיתל הבטן, הידע על המנגנונים המולקולריים המניעים את ההבלטה של תאים בקצה villus מוגבל. לכן, יש צורך במחקר בסיסי המספק תיאור מדויק של רצף האירועים המולקולריים המעורבים בהזלת תאים אפיתל.
אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים שונים בתוך ררית המעיים הם המפתח כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ויסות תחלופת אפיתל והונוסטרזיס מעיים. כך, במחקרי vivo מציעים יתרונות גבוהים על פני גישות vio ex ו-ex בהקשר זה. יתר על כן, טכניקות הדמיה בזמן אמת מאפשרות את התיאור של רצף האירועים השולטים בתופעות ספציפיות. בהקשר זה, המחקר של תהליכים דינמיים מאוד דורש את השימוש בטכניקות ברזולוציה גבוהה אופטימיזציה להתבוננות ישירה של הרקמה. טכניקות הדמיה תוך-ויטאליות מופיעות ככלים מתאימים ייחודיים לחקר שפיכת תאי האפיתל בבטן.
המונח "מיקרוסקופ תוך ויטאל" מתייחס גישות ניסיוניות ניצול של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה (multiphoton או מיקרוסקופית confocal) כדי לדמיין ישירות תאים ורקמות בסביבה המקומית שלהם בתוך בעל חייםחי 11. הוא מאפשר רכישה בזמן אמת של מידע vivo עד רזולוציה של תא יחיד, וכרוך יתרונות ברורים על פני שיטות סטטיות או ברזולוציה נמוכה. מיקרוסקופ תוך-ויטאל מספק מידע משלים ומתגבר על כמה מגבלות מטכניקות קלאסיות ו/או מתקדמות, כגון חפצים עקב עיבוד רקמות. לעומת זאת, המגבלה העיקרית של מיקרוסקופ תוך וינטלי היא כי הרקמה צריכה להיות חשופה ישירות למיקרוסקופ, אשר ברוב המקרים דורש ניתוח. למרות גישות מתוחכמות לשמר את החיוניות ולמזער את ההשפעה של הרקמה הדמיית (תאי skinfold וחלונות הדמיה)12,,13, ברוב המקרים חתך עור פשוט מבוצע עבור החיצוניזציה של הרקמה (מגני העור)14. בעשור האחרון, גישות אלה תרמו ראיות מפתח על תהליכים דינמיים מאוד, שהיו בעבר בלתי מובנים. תרגום, הדמיה בזמן אמת סיפקה תובנות ביולוגיות חדשות על תאי גזע וleukocytesביות 15, כמו גםסרטן הפצת גרורות היווצרות 13,16. בהקשר הקליני, אנדומיקרוסקופיה מנוצלת כיום ככלי אבחוןשל סרטן 17 ומחלות במערכת העיכול, כגון IBD18,19; בעוד מיקרוסקופים confocal הפך כלי פתולוגי מהיר במהלך ניתוח20. יחד, מיקרוסקופ תוך ויטאל התגלה לאחרונה ככלי רב ערך ורב-תכליתי למחקר ביו-רפואי ויישום עתידי במרפאה.
מיקרוסקופ תוך ויטאל מיושם כאן להדמיה בזמן אמת של דליפת אפיתל מעיים והתבוננות של אירועי שפיכת תאים אפיתל. דליפה של חרנטיות מעיים ניתן לזהות על ידי אחרים בטכניקות vivo פולשניות, כגון כימות של ניהול דרך האלי של מעקבי פלורסנט בסרום21. עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת תצפית ישירה של ביצועים שפיכה או את ההפרדה בין חירנות para-ו trans-תאי. השילוב של ניסויי מעקב סטנדרטיים ומיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצג גישה מתאימה: i) לזהות הפרעות חחלל מעיים, ו- ii) לבודד בין חירנות אפיתל para-ו טרנס-תאי. מלבד שפיכת תאים, מיקרוסקופ תוך-וייטל בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי vivo מאפשר מחקר של מנגנונים תאיים ומולקולריים אחרים (למשל, צומת הדוק הפצה מחדש במהלך שפיכת תאיםבאמצעות עכברים כתב פלורסנט 22 או אינטראקציות בין IECs ותאים אחרים בתוך רירית העיכול23).
השיטה המוצגת כאן מייצגת התאמה של מיקרוסקופ תוך-ויטאלי כדי לאפשר תצפית בזמן אמת על רירית מעיים, באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודלי (CLSM). לכן, אנו משתמשים בעכברים מותנה נוק-אאוט של GGTase (Geranylgeranyltransferase) בתאי אפיתל מעיים (IECs) ב (Pggt1bi大IEC עכברים), מאז הם סובלים ממחלת מעיים חמורה וחדירות אפיתלמוגברת 24. הכנה כירורגית של העכבר והכתמים של ררית המעיים, כמו גם הגדרות מתאימות המשמשות לרכישת הדמיה וניתוח לאחר הרכישה מתוארים. פרוטוקול זה יכול לאפשר מחקרים עתידיים התורמים לידע הנוכחי על דינמיקה וקינטיים של שפיכת תאי אפיתל מעיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש בסיס לתאמות שונות כדי ללמוד תופעות אחרות המתרחשות על פני השטח של ררית המעיים, ואפילו ברקמות אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

מיקרוסקופ תוך-ויטאל של המעיים באמצעות הדמיה קונפוקלית מאפשרת תצפית בזמן אמת על שפיכת תאים אפיתל ודליפת מחסום בבעלי חיים חיים. לכן, רירית המעיים של עכברים מרדימים מוכתמת באופן מקומי בכתמים לא ספציפיים (acriflavine) ומעקב פלורסנט (rhodamine-B dextran), המותקן על צלחת שטופת תמיסת מלח ותמונה ישירה באמצעות מיקרוסקופ confocal. טכניקה זו יכולה להשלים טכניקות לא פולשניות אחרות כדי לזהות דליפה של חמלה מעיים, כגון מעבר transmucosal של מעקבים דרך הדם. חוץ מזה, הגישה המוצגת כאן מאפשרת התבוננות ישירה של אירועים שפיכת תאים בזמן אמת. בשילוב עם עכברים כתב פלורסנט מתאים, גישה זו מתאימה שפיכת אור לתוך מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים בהבלטת תאי אפיתל מעיים, כמו גם תהליכים ביולוגיים אחרים. בעשורים האחרונים, מחקרים מעניינים באמצעות מיקרוסקופ תוך ויטלי תרמו לידע על חמלה אנדותל, תאי מערכת החיסון המעיים ביות, תקשורת חיסונית-אפיתל ופלישה של רכיבים זוהרים, בין היתר. יחד, הפרוטוקול המוצג כאן לא רק יעזור להגביר את ההבנה של מנגנונים השולטים בהבלטת תאים אפיתל, אלא גם יכול להיות הבסיס להתפתחות של גישות אחרות לשמש ככלים כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד אחרים, אפילו ברקמות אחרות. בין מגבלות טכניות, מאפיינים אופטיים של הרקמה הספציפית, כמו גם טכנולוגיית ההדמיה שנבחרה ותצורת מיקרוסקופ, בתורו, לקבוע את מרחק העבודה הדמיה, ורזולוציה של תמונות שנרכשו.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר גישה תוך-ויטאלית מבוססת מיקרוסקופיה כדי לדמיין דליפת אפיתל מעיים ולצפות בביצועי שפיכת תאים בבטן בזמן אמת. בקצרה, עכברים מנופים ומוגשים להכנה כירורגית על מנת לחשוף את פני השטח של ררית המעי הדק. IECs מוכתמים לאחר מכן באמצעות יישום אקטואלי של acriflavine; ב...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

באמצעות מיקרוסקופ תוך-ויטמינים, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה בזמן אמת של רקמת המעי עד לרזולוציה של תא יחיד וחקר תהליכים דינמיים ביותר כגון שפיכת תאים. בשילוב עם ניסויי מעקב סטנדרטיים, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של הפרעות חדרות מעיים ב vivo ואת ההבחנה בין פרה וחדרות transcellular. פרוטוקול זה יכול לשמש כבסיס לפיתוח גישות מיקרוסקופיות תוך-ויטמינים נוספות להדמיית תהליכים תאיים דינמיים אחרים של תחומי עניין ברקמות שונות.הדגמה חזותית של שיטה זו חיונית להבנת שלבי ההכנה הכירורגית ולמיקום החיה החיה באופן המאפשר רכישת תמונה על פני הריר במעיים. לפני תחילת ההליך, הפעל את הבסיס ואת תיבת הסורק של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל ולחץ להתחיל להפעיל את המחשב. הפעל את התוכנה לרכישת תמונה ובחר את התצורה המתאימה.כדי להגדיר את רזולוציית התמונה המתאימה, בחר תצורה, חומרה, רזולוציה, עומק סיביות ו- 12. תחת תפריט הרכישה, בחר XYZT עבור מצב רכישת התמונה והגדר את המטרה לפי 20 או 40. כדי להגדיר את הגדרת הרכישה הרציף, לחץ על חפש והוסף ובחר בין מסגרות.כדי לקבוע את התצורה של רצף 1, הפעל את תיבת הלייזר הגלויה. הגדר צינור photomultiplier אחד על ולהגדיר את אורך גל הפליטה. כדי לקבוע את התצורה של רצף 2, הפעל את תיבת הלייזר הגלויה.הגדר את צינור photomultiplier 2 כדי להגדיר את אורך גל הפליטה. לאחר מכן הפעל את הלייזרים המתאימים. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ הבוהן, להשתמש ניצן כותנה להחיל משחה על העיניים של העכבר הרדמה ולעשות חתך סנטימטר אחד באזור החדר השמאלי של הבטן.השתמש במקלפים כדי לחלק חיצוני קטע של שלושה עד חמישה סנטימטרים של המעי. בצע שני חתכים קטנים בחלק העליון והתחתון של קטע המעיים ולהכניס micropipette זכוכית לתוך לומן המעי. לאחר מכן השתמש אלקטרוקוטריזציה כדי לפתוח את קטע המעי החיצוני אורך לאורך הצד האנטי-mesenteric ולחשוף את רירית.לשטוף את הרקמה בקצרה עם תמיסת מלח כדי להסיר את התוכן צואה. להכתמת משטח רירית המעי, יש למרוח 100 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר של תווי אקריפלבין בטיפות על פני הריר החשופים ולאפשר לכתם להתפתח במשך שלוש דקות לפני שטיפת הפתרון הנותר עם PBS. לאחר מכן, להחיל 100 microliters של שתי מיליגרם לכל פתרון מיליליטר רודמין דקסטרן טיפות לריר עבור דגירה של שלוש דקות לפני שטיפה עם PBS.לאחר מכן מניחים את העכבר הרדמה על שקופית כיסוי רכוב על התא שטוף עם 37 מעלות צלזיוס מלוחים, התאמת המיקום במידת הצורך, ולהמקם את ההכנה על שלב מיקרוסקופ הפוך. מיד לאחר הנחת העכבר על הבמה, הפעל את מקור האור והתאם את מיקום ה- XY עד שציר התאורה יתמקד בהכנת הרקמה. כדי לבחור את שדה הראייה, בחר את קוביית המסנן המתאימה.פתח את התריס ולהשתמש במאקרו וגלגלי מיקרו להתמקד על פני השטח של רירית המעי. התאימו את מיקום ה-XY כדי לאתר אזור שבו ניתן לדמיין מספר villi בשדה הראייה ולשנות את קוביית המסנן כדי לוודא שהכתמת הרודמין דקסטרן גלויה גם באזור זה. כאשר זוהה אזור עניין, התחל את רכישת התמונה ובחר רצף אחד כדי להתאים את עוצמת הלייזר, הרווח וההיסט עבור רצף ראשון.לאחר מכן בחרו רצף 2 והתאיימו את עוצמת הלייזר, הרווח והיסט לרצף 2. להגדרת טווח מחסנית Z, פתחו את התפריט הנפתח 'מחסנית Z'. השתמש בפקד Z-Access כדי להתמקד על פני השטח של רירית ולחץ להתחיל.התמקד בגבול התחתון של המקום שבו האות עדיין ניתן לזיהוי ולחץ על סיום. הגדר את המספרים של ערימות Z, הימנעות מכשלי זמן ארוכים משתי דקות עבור שתי נקודות זמן רצופות ופתיח את תפריט הזמן כדי לבחור למזער ולרכוש עד עצירה. כדי להגדיר את ממוצע הקו, בחר באפשרות חפש ממוצע אחד, ממוצע שורה 2, חפש שניים וממוצע שורה 2.לאחר מכן, כדי לרכוש תמונות, הגדר את התבנית ל- 1024 x 1024 פיקסלים ואת המהירות ל- 400 ולחץ על התחל. עכברים מותנים GGTase ספציפיים לתאי מעיים פיתחו פתולוגיה מעיים חמורה כפי שהוכח על ידי עלייה בציון הנזק ההיסטולוגי של המעי הדק וחדירות אפיתל מעיים מוגברת ניתן לזהות גם באמצעות מעקב בניסויים in-vivo באמצעות FITC-dextran מנוהל דרך הפה. ניתן לזהות אירועי שפיכת תאים כתאים הנעים מתוך המונולר האפיתל לתוך הלומן, מה שמוביל לפערים זמניים בתקרת האפיתל שנסגרים לבסוף על ידי המגע בין התאים השכנים, מה שמכונה אפקט רוכסן.פערים אלה נצפים הן בעכברים שולטים והן בעכברים לקויים של GGTase, אם כי התדירות של תופעה זו גבוהה יותר אצל האחרונים. מעניין, תאים אחרים מופיעים גם ספיגת dextran. אירועי תא חדירים אלה מתרחשים גם בעיקר בעכברי נוקאאוט מותנים.ניתן לבצע את הכשל החיסוני של חלבוני צומת הקשורים לציטוסקלטון ולהדוק כדי לזהות מטרות ספציפיות התורמות להפרעות חסכנות אפיתל פוטנציאליות שנקבעו באמצעות מיקרוסקופיה תוך-בלתי נמנעת. שיטה זו יכולה לשמש לניתוח של תופעות אחרות על פני השטח של רירית המעי, כגון דליפה אנדותל או תקשורת אפיתל החיסון בהקשר של זיהום מעיים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP כגישה חדשה למניעת זיהום: הכנה ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מאפיינים מיקרוביאלית של PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. אינפלואנזה</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; או<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...