Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Programma Persone (Azioni Marie Curie) nell'ambito della sovvenzione REA numero 302170 del Settimo Programma Quadro dell'Unione Europea (7PQ/2007-2013); il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) dell'Università Erlangen-Norimberga; il Centro di Ricerca Collaborativa TRR241 e il Gruppo di Ricerca Clinica KFO257 del German Research Council (DFG); e il DFG.

Il seguente protocollo è stato approvato dalle autorità locali competenti di Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). I topi erano alloggiati in specifiche condizioni esenti da agenti patogeni.
NOTA: L'inibizione della prenilazione mediata da GGTasi all'interno degli IEC provoca una grave alterazione della permeabilità intestinale nei topi Pggt1biΔIEC 24. Pertanto, questo modello di mouse è stato utilizzato per dimostrare come...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Sebbene tecnicamente impegnativa, la metodologia basata sulla microscopia intravitale rappresenta un approccio sperimentale unico per visualizzare il processo cellulare altamente dinamico in tempo reale, come le prestazioni di spargimento di cellule. Finora, non esiste un approccio sperimentale alternativo per visualizzare l'estrusione cellulare in vivo. Crediamo che questo protocollo possa contribuire alla descrizione di diversi processi cellulari che svolgono un ruolo nel mantenimento dell'omeostasi intestinale.
<p...

L'intestino è un organo altamente specializzato con una funzione strettamente regolata che consente processi contrastanti, vale a dire nutrizione e protezione contro le sostanze luminali nocive. Foderando tra il corpo umano e l'ambiente, l'epitelio intestinale agisce come barriera fisica e immunologica e contribuisce al mantenimento dell'omeostasi mucosanell'intestino 1,,2. La perdita di integrità epiteliale e l'aumento della permeabilità alla giunzione stretta sono ben noti per essere associati alla malattia infiammatoria intestinale (IBD)3,,4,,5,,6. Le alterazioni epiteliali sono quindi considerate cause e amplificatori secondari per l'infiammazione intestinale cronica nell'IBD. Pertanto, una migliore comprensione delle prime alterazioni epiteliali nell'intestino dei pazienti affetti da IBD sarebbe di immenso valore per lo sviluppo di nuove strategie per ripristinare l'integrità epiteliale per una previsione affidabile e la successiva prevenzione delle ricadute dell'IBD.
L'epitelio intestinale segue un processo di turnover complesso e strettamente regolato. Dal fondo della cripta, le cellule epiteliali intestinali differenziate terminale (IEC) derivate da cellule staminali pluripotenti migrano verso l'alto verso la punta del villus, dove le cellule invecchiate / danneggiate vengono versate nel lume7. L'equilibrio tra divisione ed estrusione cellulare consente il mantenimento del numero di cellule epiteliali intestinali, evitando la formazione di spazi vuoti e perdite, nonché l'accumulo di cellule epiteliali che potenzialmente portano a masse cellulari e tumorigenesi8,,9,,10. Nonostante il ruolo chiave dello spargimento di cellule epiteliali nel fisiologico rinnovamento dell'epitelio intestinale, la conoscenza dei meccanismi molecolari che guidano l'estrusione delle cellule sulla punta del villus è limitata. Pertanto, è necessaria una ricerca di base che fornisca una descrizione precisa della sequenza di eventi molecolari coinvolti nello spargimento di cellule epiteliali.
Interazioni complesse tra diversi tipi di cellule all'interno della mucosa intestinale sono fondamentali per comprendere i meccanismi molecolari che regolano il turnover epiteliale e l'omeostasi intestinale. Pertanto, gli studi in vivo offrono alti vantaggi rispetto agli approcci in vitro ed ex vivo in questo contesto. Inoltre, le tecniche di imaging in tempo reale consentono la descrizione della sequenza di eventi che controllano fenomeni specifici. In questo contesto, lo studio di processi altamente dinamici richiede l'utilizzo di tecniche ottimizzate ad alta risoluzione per l'osservazione diretta del tessuto. Le tecniche di imaging intravitale appaiono come strumenti adatti unici per lo studio dello spargimento di cellule epiteliali nell'intestino.
Il termine "microscopia intravitale" si riferisce ad approcci sperimentali che sfruttano le tecniche di imaging ad alta risoluzione (microscopia multifotonale o confocale) per visualizzare direttamente cellule e tessuti nei loro dintorni nativi all'interno di un animalevivente 11. Consente l'acquisizione in tempo reale di informazioni in vivo fino alla risoluzione a cella singola e comporta chiari vantaggi rispetto ai metodi statici o a bassa risoluzione. La microscopia intravitale fornisce informazioni complementari e supera alcune limitazioni delle tecniche classiche e/o di fascia alta, come gli artefatti dovuti alla lavorazione dei tessuti. Al contrario, la principale limitazione della microscopia intravitale è che il tessuto deve essere direttamente esposto al microscopio, che nella maggior parte dei casi richiede un intervento chirurgico. Sebbene approcci sofisticati conservino la vitalità e minimizzino l'impatto del tessuto immaginato (camere scuoiate e finestre di imaging)12,,13, nella maggior parte dei casi viene eseguita una semplice incisione cutanea per l'esternalizzazione del tessuto (lembi della pelle)14. Nell'ultimo decennio, questi approcci hanno fornito prove chiave su processi altamente dinamici, che in precedenza erano imperscrutabili. Traslazione, l'imaging in tempo reale ha fornito nuove intuizioni biologiche su cellule staminali e leucociti che hannoaffinato 15, nonché la diffusione del cancro e la formazione di metastasi13,,16. Nel contesto clinico, l'endomicroscopia è attualmente sfruttata come strumento diagnostico delcancro 17 e delle malattie gastrointestinali, come l'IBD18,19; mentre la microscopia a mosaico confocale è diventata uno strumento di patologia rapida durante l'interventochirurgico 20. Insieme, la microscopia intravitale è recentemente emersa come uno strumento prezioso e versatile per la ricerca biomedica e l'applicazione futura in clinica.
La microscopia intravitale è qui implementata per la visualizzazione in tempo reale della perdita epiteliale intestinale e l'osservazione di eventi di spargimento di cellule epiteliali. La perdita di permeabilità intestinale può essere identificata da altre tecniche in vivo non invasive, come la quantificazione della somministrazione orale di traccianti fluorescenti nel siero21. Tuttavia, questa tecnica non consente l'osservazione diretta delle prestazioni di spargimento né la segregazione tra permeabilità para- e transcellulare. La combinazione di esperimenti di tracciante standard e microscopia intravitale rappresenta un approccio adeguato a: i) identificare i disturbi nella permeabilità intestinale e ii) separare tra permeabilità epiteliale para- e transcellulare. Oltre allo spargimento di cellule, la microscopia intravitale in combinazione con l'etichettatura a fluorescenza in vivo consente lo studio di altri meccanismi cellulari e molecolari (ad esempio, una stretta ridistribuzione della giunzione durante lo spargimento di cellule utilizzando topi reporter fluorescenti22 o interazioni tra IEC e altre cellule all'interno della mucosa intestinale23).
Il metodo qui presentato rappresenta un adattamento della microscopia intravitale per consentire l'osservazione in tempo reale della mucosa intestinale, utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Pertanto, usiamo topi knock-out condizionali di GGTasi (Geranylgeraniltransferasi) nelle cellule epiteliali intestinali (IEC) in(topi Pggt1biΔIEC), poiché soffrono di una grave malattia intestinale e di una maggiore permeabilità epiteliale24. Vengono descritti la preparazione chirurgica del topo e la colorazione della mucosa intestinale, nonché le impostazioni appropriate utilizzate per l'acquisizione dell'imaging e l'analisi post-acquisizione. Questo protocollo potrebbe consentire studi futuri che contribuiscono alle attuali conoscenze sulla dinamica e cinetica dello spargimento di cellule epiteliali intestinali. Inoltre, il protocollo potrebbe servire come base per vari adattamenti per studiare altri fenomeni che si verificano sulla superficie della mucosa intestinale e persino in altri tessuti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

La microscopia intravitale dell'intestino con imaging confocale consente l'osservazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali e la perdita di barriere negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale dei topi anestetizzati è macchiata localmente con colorazione non specifica (acriflavina) e un tracciante fluorescente (rodiammina-B dextran), montato su una piastra risciacquata a soluzione salina e direttamente immaginato utilizzando un microscopio confocale. Questa tecnica può integrare altre tecniche non invasive per identificare la perdita di permeabilità intestinale, come il passaggio transmucoso di traccianti somministrati per via orale. Oltre a questo, l'approccio qui presentato consente l'osservazione diretta degli eventi di spargimento di cellule in tempo reale. In combinazione con appropriati topi reporter fluorescenti, questo approccio è adatto per far luce nei meccanismi cellulari e molecolari che controllano l'estrusione delle cellule epiteliali intestinali, nonché in altri processi biologici. Negli ultimi decenni, studi interessanti che utilizzano la microscopia intravitale hanno contribuito alla conoscenza della permeabilità endoteliale, del homing intestinale delle cellule immunitarie, della comunicazione immuno-epiteliale e dell'invasione dei componenti luminali, tra gli altri. Insieme, il protocollo qui presentato non solo aiuterebbe ad aumentare la comprensione dei meccanismi che controllano l'estrusione cellulare epiteliale, ma potrebbe anche essere la base per lo sviluppo di altri approcci da utilizzare come strumenti per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici, anche in altri tessuti. Tra le limitazioni tecniche, le proprietà ottiche del tessuto specifico, così come la tecnologia di imaging selezionata e la configurazione del microscopio, determinerebbero a loro volta la distanza di lavoro dell'imaging e la risoluzione delle immagini acquisite.

Il protocollo qui presentato descrive un approccio intravitale basato sulla microscopia per visualizzare le perdite epiteliali intestinali e osservare le prestazioni di spargimento cellulare nell'intestino in tempo reale. In breve, i topi vengono anestetizzati e sottoposti a preparazione chirurgica al fine di esporre la superficie della mucosa dell'intestino tenue. Gli IEC vengono quindi macchiati tramite l'applicazione topica dell'acriflavina; mentre la rodimina luminare B-dextran è usa...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Utilizzando la microscopia intravitale, questo protocollo consente la visualizzazione in tempo reale del tessuto intestinale fino a una risoluzione a singola cellula e lo studio di processi altamente dinamici come lo spargimento cellulare. In combinazione con gli esperimenti di tracciante standard, questo protocollo consente l'identificazione sia dei disturbi della permeabilità intestinale in vivo che della distinzione tra permeabilità para e transcellulare. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato come base per lo sviluppo di ulteriori approcci di microscopia intravitale per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici di interesse all'interno di vari tessuti.La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale per comprendere le fasi di preparazione chirurgica e posizionare l'animale vivente in modo da facilitare l'acquisizione dell'immagine sulla superficie della mucosa intestinale. Prima di iniziare la procedura, accendere la base e la scatola dello scanner di un microscopio a scansione laser confocale e premere start per accendere il computer. Avviare il software di acquisizione delle immagini e selezionare la configurazione appropriata.Per impostare la risoluzione dell'immagine appropriata, selezionare configurazione, hardware, risoluzione, profondità di bit e 12. Nel menu di acquisizione, selezionate XYZT per la modalità di acquisizione dell'immagine e impostate l'obiettivo su 20 o 40X. Per impostare l'impostazione di acquisizione sequenziale, fate clic su cerca e aggiungete e selezionate tra i fotogrammi.Per configurare la prima sequenza, attivare la scatola laser visibile. Impostare il tubo fotomoltiplicatore uno su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Per configurare la seconda sequenza, attivare la scatola laser visibile.Impostare il tubo fotomoltiplicatore due su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Quindi attivare i laser appropriati. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, utilizzare un cotton fioc per applicare un unguento agli occhi del topo anestetizzato e fare un'incisione di un centimetro nella regione ventricolare sinistra dell'addome.Utilizzare le forcep per esternarizzare un segmento da tre a cinque centimetri dell'intestino. Fare due piccole incisioni nella parte superiore e inferiore del segmento intestinale e introdurre una micropipetta di vetro nel lume intestinale. Quindi utilizzare l'elettrocauterizzazione per aprire longitudinalmente il segmento intestinale esteriore lungo il lato anti-mesenterico ed esporre la mucosa.Risciacquare brevemente il tessuto con soluzione salina per rimuovere il contenuto fecale. Per la colorazione della superficie della mucosa intestinale, applicare 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di acriflavina in goccioline sulla superficie mucosa esposta e lasciare che la macchia si sviluppi per tre minuti prima di lavare la soluzione rimanente con PBS. Successivamente, applicare 100 microlitri di una soluzione di dextran di rodimina millilitro per millilitro in goccioline alla mucosa per un'incubazione di tre minuti prima del lavaggio con PBS.Quindi posizionare la supina del mouse anestetizzata su uno scivolo di copertura montato sulla camera risciacquata con soluzione salina di 37 gradi Celsius, regolando la posizione se necessario, e posizionare la preparazione sullo stadio del microscopio invertito. Immediatamente dopo aver posizionato il mouse sul palco, accendere la sorgente luminosa e regolare la posizione XY fino a quando l'asse di illuminazione non è focalizzato sulla preparazione del tessuto. Per selezionare il campo visivo, selezionare il cubo di filtro appropriato.Aprire l'otturatore e utilizzare le ruote macro e micro per concentrarsi sulla superficie della mucosa intestinale. Regolare la posizione XY per individuare un'area in cui è possibile visualizzare diversi villi all'interno del campo visivo e modificare il cubo del filtro per verificare che la colorazione di rodimina dextran sia visibile anche in quell'area. Quando è stata identificata un'area di interesse, avviare l'acquisizione dell'immagine e selezionare la sequenza uno per regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la prima sequenza.Quindi selezionare la sequenza due e regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la seconda sequenza. Per definire l'intervallo Z-stack, aprite il menu di consegna z-stack. Utilizzare il controllo Z-access per concentrarsi sulla superficie della mucosa e fare clic su begin.Concentrati sul limite inferiore di dove il segnale è ancora rilevabile e fai clic sull'estremità. Definire il numero di Z-stack, evitando time-lapse superiori a due minuti per due punti di tempo consecutivi e aprire il menu di tempo per selezionare riduci a icona e acquisire fino all'arresto. Per definire la media della linea, selezionare cercarne uno, la media delle linee due, cercarne due e la media della linea due.Quindi, per acquisire immagini, impostare il formato su 1024 x 1024 pixel e la velocità su 400 e fare clic su Avvia. I topi condizionali carenti di GGTasi, specifici delle cellule epiteliali intestinali, hanno sviluppato una grave patologia intestinale, come dimostrato da un aumento del punteggio di danno istologico dell'intestino tenue e dall'aumento della permeabilità epiteliale intestinale può anche essere rilevato tramite tracciante in esperimenti in vivo utilizzando FITC-dextran somministrato per via orale. Gli eventi di spargimento cellulare potrebbero essere identificati come cellule che si spostano fuori dal monostrato epiteliale nel lume, portando a spazi temporanei nel soffitto dell'epitelio che vengono infine chiusi dal contatto tra le cellule vicine, un cosiddetto effetto cerniera.Queste lacune si osservano sia nei topi carenti di controllo che in quello GGTase, sebbene la frequenza di questi fenomeni sia più alta in quest'ultimo. È interessante notare che anche altre cellule sembrano assumere dextran. Questi cosiddetti eventi cellulari permeabili si verificano anche principalmente nei topi knockout condizionali.L'immunostaining di proteine di giunzione correlate al citoscheletro e strette di interesse può essere eseguita per identificare obiettivi specifici che contribuiscono a potenziali interruzioni della permeabilità epiteliale determinate tramite microscopia intravitale. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi di altri fenomeni sulla superficie della mucosa intestinale, come la perdita endoteliale o la comunicazione epiteliale immunitaria nel contesto dell'infezione intestinale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP come un nuovo approccio per prevenire l&#39;infezione: Preparazione e<em&gt; In vitro</em&gt; Proprietà antimicrobiche di PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Utilizzando organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo per studiare e modificare la protezione delle cellule epiteliali contro la Salmonella e altri patogeni

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...