Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
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これらの結果に至る研究は、欧州連合(EU)第7回枠組みプログラム(FP7/2007-2013)のREA交付契約番号302170の下でピープルプログラム(マリー・キュリー・アクションズ)から資金を受け取っています。エアランゲン・ニュルンベルク大学の臨床研究のための学際的なセンター (IZKF) ;ドイツ研究評議会(DFG)の共同研究センターTRR241および臨床研究グループKFO257;とDFG.

次の議定書は、エルランゲン(ドイツ、ヴュルツブルク、レジエルン・フォン・ウンターフランケン)の関連する地方自治体によって承認されています。マウスは、特定の病原体を含まない状態で収容された。
注:ICs内でGGTase媒介性プレニルの阻害は 、Pggt1biΔIEC マウス24における腸透過性の深刻な変化を引き起こす。したがって、このマウ?...

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	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

技術的には困難ですが、生体内顕微鏡ベースの方法論は、細胞流動性能など、動的な細胞プロセスをリアルタイムで可視化する独自の実験的アプローチを表しています。これまでのところ、生体内で細胞押出を可視化する代替実験的アプローチはない。このプロトコルは、腸内恒常性の維持に役割を果たす多様な細胞プロセスの記述に寄与できると考えています。
生体?...

腸は、競合するプロセス、すなわち栄養と有害な発光物質に対する保護を可能にする厳しく調節された機能を持つ高度に専門化された器官です。腸上皮は、人体と環境の間に内層であり、物理的および免疫学的障壁として作用し、腸内の粘膜恒常性の維持に寄与する。上皮完全性の喪失および緊密な接合透過性の増加は、炎症性腸疾患(IBD)3、4、5、6に関連することがよく知られている。3,4,5,6上皮変化は、IBDにおける慢性腸炎の原因および二次増幅器と考えられる。したがって、IBD患者の腸内の初期上皮変化に対する理解の向上は、信頼性の高い予測とその後のIBD再発の予防のために上皮の完全性を回復するための新しい戦略の開発にとって非常に価値があるだろう。
腸上皮は複雑で厳しく調節されたターンオーバープロセスに従う。陰窩下から、多能性幹細胞に由来する末期分化された腸上皮細胞(IEC)が、上方に移動して、老化/損傷した細胞が内腔7に流される。分裂と細胞押出との間の平衡は、腸の上皮細胞数の維持を可能にし、ギャップおよび漏出の形成を回避し、また細胞塊および腫瘍化をもたらす可能性のある上皮細胞の蓄積を88、9、109,10に導く。腸上皮の生理的再生における上皮細胞脱落の重要な役割にもかかわらず、ビロス先端で細胞の押出を駆動する分子メカニズムに関する知識は限られている。したがって、上皮細胞の脱落に関与する分子事象の配列を正確に記述する基礎研究が必要である。
腸粘膜内の異なる細胞型間の複雑な相互作用は、上皮のターンオーバーと腸内恒常性を調節する分子メカニズムを理解する鍵となる。したがって、in vivo研究は、この文脈におけるin vitroおよびex vivoアプローチよりも高い利点を提供する。さらに、リアルタイムイメージング技術により、特定の現象を制御する一連のイベントの記述が可能になります。この文脈では、高度に動的なプロセスの研究は、組織の直接観察のための最適化された高解像度技術の使用を要求する。生体内イメージング技術は、腸内の上皮細胞脱落の研究に適したユニークなツールとして現れます。
「生体内顕微鏡」という用語は、高解像イメージング技術(多光子または共焦点顕微鏡)を利用して、生きている動物11内の自在の環境内の細胞および組織を直接可視化する実験的アプローチを指す。それは単一細胞の決断にin vivo情報の実時間獲得を可能にし、静的か低い決断方法より明確な利点を伴う。生体内顕微鏡は補完的な情報を提供し、組織処理による人工物など、古典的な技術やハイエンド技術からいくつかの制限を克服します。対照的に、生体内顕微鏡の主な制限は、組織が顕微鏡に直接さらされるべきであり、ほとんどの場合、手術が必要です。高度なアプローチは、生力性を維持し、画像化された組織(皮膚の外向室およびイメージング窓)12、13の影響を最小限に抑えるが、ほとんどの場合、13組織(皮膚フラップ)14の外的化のために単純な皮膚切開が行われる。過去10年間で、これらのアプローチは、以前は不可解であった非常にダイナミックなプロセスに関する重要な証拠を貢献してきました。翻訳的には、リアルタイムイメージングは、幹細胞および白血球ホーミング15、ならびに癌播種および転移形成13、16に関する新たな生物学的洞察を提供した。13臨床文脈では、内視鏡検査は現在、癌17および胃腸疾患の診断ツールとして利用されている、例えばIBD18、19;,19共焦点モザイク顕微鏡は手術中に急速な病理学ツールとなった間 20.一緒に、生体内顕微鏡は最近、バイオメディカル研究とクリニックでの将来の応用のための貴重で汎用性の高いツールとして浮上しています。
腸上皮漏れのリアルタイム可視化と上皮細胞脱落事象の観察のために、インビタル顕微鏡が実施されています。腸透過性の漏出は、血清21における蛍光トレーサーの経口投与の定量化などの生体内非侵襲的技術によって同定することができる。しかし、この技術は、流れ性能の直接的な観察や、パラセルラーとトランスセルラー透過性の間の分離を直接観察することはできません。標準的なトレーサー実験と生体内顕微鏡の組み合わせは、i)腸透過性の障害を同定し、ii)パラ細胞とトランス細胞上皮透過性の間で分離する適切なアプローチを表す。細胞流動以外にも、生体内蛍光標識と組み合わせた生体内顕微鏡検査は、他の細胞および分子機構の研究を可能にする(例えば、蛍光レポーターマウス22 を用いた細胞脱落時の緊密な接合点の再分配または腸粘膜23内のIECと他の細胞との相互作用)。
ここで提示した方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて腸粘膜をリアルタイムに観察できるように、生体内顕微鏡の適応を表しています。したがって、GGTAS(ゲラニルゲラニルトランスビセ酵素)の条件付きノックアウトマウスを腸管上皮細胞(Pggt1biΔIEC マウス)において用い、重度の腸疾患および上皮透過性の増加に苦しんでおります。マウスの外科的調製および腸粘膜の染色、ならびにイメージング獲得および取得後分析に使用される適切な設定が記載されている。このプロトコルは、腸上皮細胞脱落のダイナミクスと運動学に関する現在の知識に寄与する将来の研究を可能にする可能性がある。さらに、このプロトコルは、腸粘膜の表面、さらには他の組織で起こる他の現象を研究するための様々な適応の基礎として役立つ可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

共焦点イメージングを用いた腸内顕微鏡検査により、生きている動物における上皮細胞脱落やバリア漏れのリアルタイム観察が可能です。したがって、麻酔化マウスの腸管粘膜は、非特異的染色(アクリフラビン)および蛍光トレーサー(rhodamine-Bデキストラン)で局所染色され、生理食い溶液リンスプレートに取り付けられ、共焦点顕微鏡を用いて直接画像化される。この技術は、経口投与トレーサーの経粘膜通過のような腸透過性の漏れを同定する他の非侵襲的な技術を補完することができる。この他に、ここで紹介するアプローチでは、リアルタイムで細胞脱落イベントを直接観察することができます。適切な蛍光レポーターマウスと組み合わせて、このアプローチは、腸上皮細胞の押出を制御する細胞および分子機構、ならびに他の生物学的プロセスに光を流すのに適しています。過去数十年の間に、生体内顕微鏡を用いた興味深い研究は、内皮透過性、免疫細胞腸管ホーミング、免疫上皮通信、および発光成分の侵入に関する知識に寄与してきた。ここで紹介するプロトコルは、上皮細胞押出を制御するメカニズムの理解を深めるだけでなく、他の組織であっても他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化する手段として使用される他のアプローチの発達の基礎となる可能性もある。技術的な制限の中で、特定の組織の光学特性、ならびに選択されたイメージング技術および顕微鏡構成は、順番に、撮像作業距離、および取得画像の分解能を決定するであろう。

ここで示すプロトコルは、腸内上皮漏れを可視化し、腸内の細胞脱落性能をリアルタイムで観察するための生体内顕微鏡ベースのアプローチを説明しています。簡単に言えば、マウスは麻酔を受け、小腸粘膜の表面を露出させるために外科用調製物に提出される。IPCは、アクリフラビンの局所適用によって染色されます。一方、ルダミンB-dextranは、内腔から上皮下空?...

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An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

このプロトコルは、生体内顕微鏡を用いて、腸組織を単一細胞分解能までリアルタイムに可視化し、細胞脱落などの非常に動的なプロセスの研究を可能にします。標準的なトレーサー実験と組み合わせて、このプロトコルは、生体内の腸透過性障害とパラおよびトランス細胞透過性の区別の両方の同定を可能にする。このプロトコルは、様々な組織内の関心のある他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化するための追加のインビタルな顕微鏡法の開発の基礎として使用することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、外科的準備ステップを理解し、腸粘膜表面上の画像取得を容易にする方法で生きている動物を配置するために不可欠である。手順を開始する前に、共焦点レーザー顕微鏡のベースとスキャナボックスをオンにし、コンピュータの電源を入れるには、スタートを押します。イメージ取得ソフトウェアを起動し、適切な構成を選択します。適切なイメージ解像度を設定するには、構成、ハードウェア、解像度、ビット深度、および 12 を選択します。取得メニューで、画像取得モードとして [XYZT] を選択し、目的を 20 または 40X に設定します。シーク集録設定を設定するには、[シーク] をクリックして、フレーム間で追加および選択します。シーケンス 1 を構成するには、可視のレーザー ボックスをオンにします。フォトマルチプライヤチューブを1個に設定し、発光波長を定義します。シーケンス 2 を構成するには、可視レーザー ボックスをオンにします。フォトマルチプライヤチューブを2本オンに設定し、発光波長を定義します。次に、適切なレーザーをアクティブにします。足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、綿棒を使用して麻酔をかけ、腹部の左心室領域に1センチメートルの切開を行います。鉗子を使用して、腸の3〜5センチメートルのセグメントを外装します。腸管の上部と下部に2つの小さな切開を行い、腸管腔にガラスマイクロピペットを導入します。次に電気カエタライゼーションを使用して、抗腸間膜側に沿って縦方向に外形化された腸管セグメントを開き、粘膜を露出させます。食前液でティッシュを短時間すすいで、便の内容を取り除きます。腸粘膜表面の染色のために、1ミリリットルのアクリフラビン溶液を1ミリリットルの1ミリリットルの液滴を露出した粘膜表面に塗布し、残りの溶液をPBSで洗い流す前に3分間染色を可能にする。次に、PBSで洗浄する前に、3分間のインキュベーションのために、液滴中の1ミリリットルローダミンデキストラン溶液あたり2ミリグラムの100マイクロリットルを粘膜に塗布する。次に、麻酔したマウスの上に、37°Cの生理食音をすすいでチャンバーに取り付けたカバースライドに置き、必要に応じて位置を調整し、逆顕微鏡ステージに準備を置きます。マウスをステージに置いた直後に、光源をオンにして、照明軸が組織の準備に焦点を合わせるまでXY位置を調整します。視野を選択するには、適切なフィルタ キューブを選択します。シャッターを開け、マクロとマイクロホイールを使用して腸粘膜の表面に焦点を当てます。XY 位置を調整して、ビューのフィールド内で複数の絨毛を視覚化できる領域を見つけ、フィルターキューブを変更して、ローダミンデキストラン染色がその領域にも見えることを確認します。対象領域が特定されたら、画像取得を開始し、シーケンス 1 を選択して、シーケンス 1 のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。次に、シーケンス2を選択し、シーケンス2のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。Z スタックの範囲を定義するには、Z スタックのドロップオフ メニューを開きます。Z-access コントロールを使用して粘膜の表面に焦点を合わせ、[開始]をクリックします。信号がまだ検出可能な場所の下限に焦点を当てて、終了をクリックします。2 つの連続したタイム ポイントの 2 分より長いタイムラプスを避ける Z スタックの数を定義し、時間メニューを開いて最小化を選択し、停止するまで取得します。行平均を定義するには、シーク 1、行平均 2、シーク 2、および行平均 2 を選択します。次に、画像を取得するには、フォーマットを1024 x 1024ピクセルに設定し、速度を400に設定して[開始]をクリックします。腸上皮細胞特異的GGTase欠損条件マウスは、小腸の組織学的損傷スコアの増加および腸上皮透過性の増加によって示されるように重度の腸病理を発症し、経口投与FITC-dextranを用いたインビボ実験においてトレーサーを介して検出することもできる。細胞脱落事象は、上皮単層から内腔に移動する細胞として同定することができ、上皮の天井の一時的なギャップを引き起こし、最終的に隣接する細胞間の接触によって閉じられる、いわゆるジッパー効果である。これらのギャップは、コントロールマウスとGGTase欠損マウスの両方で観察されるが、後者ではこれらの現象の頻度が高い。興味深いことに、他の細胞もデキストランを取るように見えます。これらのいわゆる透過性細胞事象は、主に条件付きノックアウトマウスでも発生する。目的の細胞骨格関連およびタイトな接合タンパク質の免疫染色を行い、生体内顕微鏡検査によって決定される潜在的な上皮透過性破壊に寄与する特定の標的を同定することができる。この方法は、腸内皮漏れや腸内感染の文脈における免疫上皮通信などの腸粘膜の表面上の他の現象の分析に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

感染を防ぐための新しいアプローチとして、PRP：準備と<em&gt;インビトロ</emPRPの&gt;抗菌特性

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

臍帯血移植後の水痘帯状疱疹ウイルス特異的細胞性免疫を評価するために、IFN-γELISPOTアッセイの開発

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために<i&gt; S。ニューモニエ</i&gt;、<i&gt; H。インフルエンザ</i&gt;、<i&gt; K。ニューモニエ</i&gt;、<em&gt; P。緑膿菌</em&gt;または<em&gt; A。バウマニ</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...