Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
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이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합 (FP7/2007-2013)의 REA 보조금 계약 번호 302170에 따라 사람들 프로그램 (마리 퀴리 액션)에서 자금을 받았다; 임상 연구를 위한 학제 간 센터 (IZKF) 대학 에를랑겐 뉘른베르크; 독일 연구위원회(DFG)의 공동 연구 센터 TRR241 및 임상 연구 그룹 KFO257; 그리고 DFG.

다음 의정서는 에를랑겐(독일 뷔르츠부르크 레게룽 폰 운테르프랑켄)의 관련 지방 당국의 승인을 받았습니다. 마우스는 특정 병원균 없는 조건하에서 보관하였다.
참고: IEC 내GGTase 매개 조형물의 억제는 Pggt1biΔIEC 마우스24에서장 투과성의 심각한 변경을 일으킨다. 따라서, 이 마우스 모델은 프로토콜이 장 장벽 결함을 연구하는 데 어떻게 유?...

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	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

기술적으로 도전적이지만, 인트라바이탈 현미경 기반 방법론은 세포 발산 성능과 같은 매우 역동적인 세포 공정을 실시간으로 시각화하는 독특한 실험 적 접근 방식을 나타냅니다. 지금까지 생체 내에서 세포 압출을 시각화하는 대체 실험 적 접근법은 없습니다. 우리는 이 프로토콜이 장 집상성의 유지에 있는 역할을 하는 다양한 세포 프로세스의 설명에 기여할 수 있다고 믿습니다.
<p class="jo...

장은 유해한 발광 물질에 대한 영양과 보호와 상충하는 프로세스, 즉 영양과 보호를 가능하게 하는 엄격하게 조절된 기능을 가진 고도로 전문화된 기관입니다. 인체와 환경 사이의 안감, 장 상피는 물리적 및 면역 장벽역할을 하며 창자1,,2에서점막 항상성의 유지에 기여한다. 상피 무결성의 상실및 팽팽한 접합 투과성 증가는 염증성 장질환(IBD)3,,4,,5,,6과연관되는 것으로 잘 알려져 있다. 상피 변경은 IBD에 있는 만성 장 염증을 위한 원인 그리고 이차 증폭기로 그 때 고려됩니다. 따라서, IBD 환자의 창자에 있는 초기 상피 변경의 향상한 이해는 IBD 재발의 믿을 수 있는 예측 및 후속 예방을 위한 상피 무결성을 회복하기 위하여 새로운 전략의 발달을 위한 엄청난 가치가 일 것입니다.
장 상피는 복잡하고 엄격하게 규제된 회전율 프로세스를 따릅니다. 토굴 바닥에서, 다능성 줄기 세포에서 유래한 말단 분화장 상피 세포(IeC)는 고루 팁으로 위쪽으로 이동하여 노인/손상된 세포가 루멘7로흘려집니다. 분열과 세포 압출 사이의 평형은 장 상피 세포 수의 유지를 가능하게 하고, 틈새 및 누설의 형성을 피하고, 잠재적으로 세포 질량 및 종양발생으로이어지는 상피 세포의 축적을 피할 수 있다8,9,,10. 창자 상피의 생리적 갱신에서 발산하는 상피 세포의 핵심 역할에도 불구하고, 빌루스 팁에서 세포의 압출을 구동하는 분자 메커니즘에 대한 지식은 제한적이다. 따라서 상피 세포 흘리기와 관련된 분자 이벤트의 서열에 대한 정확한 설명을 제공하는 기본 연구가 필요합니다.
장 점막 내의 다른 세포 모형 사이 복잡한 상호 작용은 상피 회전율 및 장 항상성을 조절하는 분자 기계장치를 이해하는 열쇠입니다. 따라서 생체 내 연구는 이 맥락에서 시험관 내 및 전 생체 접근법보다 높은 이점을 제공합니다. 더욱이, 실시간 이미징 기술은 특정 현상을 통제하는 사건의 순서의 설명을 허용합니다. 이러한 맥락에서, 고동적인 프로세스의 연구는 조직의 직접 관찰을 위한 최적화된 고해상도 기술의 사용을 요구합니다. 인트라바이탈 이미징 기술은 창자에 있는 상피 세포 흘리기의 연구 결과에 대한 유일한 적합한 공구로 나타납니다.
용어 "인트라바이탈 현미경 검사법"은 살아있는동물(11)내의 토착 환경에서 세포와 조직을 직접 시각화하기 위해 고해상도 이미징 기술(multiphoton 또는 공초점 현미경 검사법)을 활용한 실험적 접근법을 말한다. 최대 단일 셀 해상도까지 생체 내 정보를 실시간으로 수집할 수 있으며 정적 또는 저해상도 방법에 비해 명확한 이점을 수반합니다. 인트라바이탈 현미경 검사는 상호 보완적인 정보를 제공하고 조직 처리로 인한 유물과 같은 고전 및/또는 고급 기술의 일부 한계를 극복합니다. 대조적으로, 인트라베이티 현미경 검사법의 주요 한계는 조직이 대부분의 경우에 수술을 요구하는 현미경에 직접 노출되어야 한다는 것입니다. 정교한 접근법은 활력을 보존하고 이미지 조직(스킨폴드 챔버 및 이미징 윈도우)의 영향을 최소화하지만( 스킨폴드 챔버 및 이미징 윈도우)12,,13,대부분의 경우 조직(skin flaps)의 외부화를 위해 간단한 피부 절개가 수행된다.14 지난 10 년 동안, 이러한 접근 방식은 이전에 는 불가결했던 매우 역동적 인 프로세스에 대한 주요 증거를 기여했습니다. 번역적으로, 실시간 화상 진찰은 줄기 세포및 백혈구 homing15,뿐만 아니라 암 보급 및 전이 형성에 새로운 생물학 통찰력을 제공13,,16. 임상 적 맥락에서, 내시경 검사는 현재 IBD18,,19와같은 암17 및 위장 질환의 진단 도구로 이용된다. 공초점 모자이크 현미경 검사는 수술 중 빠른 병리학 도구가되었다20. 함께, 인트라바이탈 현미경 검사는 최근 병원에서 생물 의학 연구 및 미래 응용을위한 귀중하고 다재 다능한 도구로 부상했습니다.
인트라바이탈 현미경 검사는 장 상피 누설의 실시간 시각화및 상피 세포 흘리기 사건의 관찰을 위해 구현된다. 장 투과성의 누설은혈청(21)에서형광 추적기의 경수화와 같은 다른 생체 내 비침습적 기술에 의해 식별될 수 있다. 그러나, 이 기술은 파기 성능의 직접적인 관찰이나 파라 세포 와 트랜스 세포 투과성 사이의 분리를 허용하지 않습니다. 표준 추적 실험과 인트라베이티 현미경 검사법의 조합은 적절한 접근법을 나타냅니다: i) 장 투과성 에서 교란을 식별하고, ii) 파라-세포 상피 투과성 사이의 분리. 세포 흘리기 이외에 생체 내 형광 라벨링과 함께 중요한 현미경 검사법은 다른 세포 및 분자 메커니즘(예를 들어, 형광 기자마우스(22)을 이용한 세포 흘리기 중 팽팽한 접합 재분배 또는 장 점막 내의 IeCs 및 기타 세포 간의 상호작용)의연구를 가능하게 한다.
여기에 제시된 방법은 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)를 사용하여 장 점막의 실시간 관찰을 가능하게 하는 인트라바이탈 현미경 검사법의 적응을 나타낸다. 따라서, 우리는 장 상피 세포(IGt1biΔIEC 마우스)에서 GGTase (Geranylgeranyltransferase)의 조건부 녹아웃 마우스를 사용하며, 이는 심각한 장 질환과 상피 투과성(24)으로 고통받기 때문에.24 마우스의 외과 적 준비 및 장 점막의 염색뿐만 아니라 이미징 획득 및 후 분석에 사용되는 적절한 설정이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 장 상피 세포 흘리기의 역학 및 운동학에 대한 현재 지식에 기여하는 미래 연구를 가능하게 할 수 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 장 점막의 표면에서 발생하는 다른 현상을 연구하기 위한 각종 적응을 위한 기초가 될 수 있고, 심지어 그밖 조직에서.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

공초점 화상 진찰을 사용하여 창자의 중요한 현미경 검사는 살아있는 동물에 있는 상피 세포 흘리기 및 장벽 누설의 실시간 관찰을 허용합니다. 따라서 마취된 마우스의 장 점막은 특이하지 않은 스테인링(acriflavine)과 형광 추적자(로다민-B dextran)로 토탈로 염색되어 식염수 용액-헹구는 플레이트에 장착되어 공초점 현미경을 사용하여 직접 이미지화된다. 이 기술은 경구 투여 된 추적자의 경막 통과와 같은 장 투과성의 누설을 식별하기 위해 다른 비 침습적 기술을 보완 할 수 있습니다. 이 외에도 여기에 제시 된 접근 방식은 실시간으로 셀 흘리는 이벤트를 직접 관찰 할 수 있습니다. 적절한 형광 기자 마우스와 함께,이 방법은 장 상피 세포 압출을 제어하는 세포 및 분자 메커니즘뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에 빛을 흘리는 데 적합합니다. 지난 수십 년 동안, 내피성 현미경 검사를 이용한 흥미로운 연구는 내피 투과성, 면역 세포 창자 호밍, 면역 상피 통신 및 발광 성분의 침입에 대한 지식에 기여했습니다. 함께, 여기에 제시 된 프로토콜은 상피 세포 압출을 제어하는 메커니즘의 이해를 증가도움이 될뿐만 아니라, 다른 조직에서도 다른 매우 역동적 인 세포 과정을 시각화하는 도구로 사용되는 다른 접근 법의 발달의 기초가 될 수 있습니다. 기술적 한계 중, 특정 조직의 광학 특성뿐만 아니라 선택된 이미징 기술 및 현미경 구성은 차례로 이미징 작업 거리 및 획득 된 이미지의 해상도를 결정할 것입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 장 상피 누설을 시각화하고 실시간으로 창자에 있는 세포 흘리기 성능을 관찰하기 위하여 인트라VITAL 현미경 기지를 둔 접근법을 기술합니다. 간단히, 마우스는 소장 점막의 표면을 드러내기 위하여 마취되고 외과 준비에 제출됩니다. 그런 다음 II는 아크리플라빈의 국소 적용을 통해 염색됩니다. 발광 로다민 B-dextran은 루멘에서 하위 상피 공간?...

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An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

인트라비티 현미경 검사를 활용하여, 여기에 제시된 방법은 살아있는 동물에서 장 상피 세포 흘림의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서, 마취마우스의 국소 염색장 점막(acriflavine 및 rhodamineB-dextran)은 공초점 현미경검사를 이용하여 단일 세포 해상도까지 심화된다.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

이 프로토콜은 인트라바이탈 현미경 검사를 사용하여 장 조직의 실시간 시각화를 단일 세포 해상도까지 시각화하고 세포 흘리기와 같은 매우 역동적인 공정에 대한 연구를 가능하게 합니다. 표준 추적기 실험과 함께, 이 프로토콜은 생체 내장 투과성 장애와 파라 및 세포간 투과성 사이의 구별을 모두 식별할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 다양한 조직 내에서 관심의 다른 매우 역동적 인 세포 프로세스를 시각화하기위한 추가 내 중요한 현미경 접근법의 개발을위한 기초로 사용할 수 있습니다.이 방법의 시각적 데모는 수술 준비 단계를 이해하고 살아있는 동물을 장 점막 표면에 이미지 수집을 용이하게하는 방식으로 배치하는 데 필수적입니다. 절차를 시작하기 전에 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 베이스 및 스캐너 상자를 켜고 컴퓨터를 켜기 시작합니다. 이미지 수집 소프트웨어를 실행하고 적절한 구성을 선택합니다.적절한 이미지 해상도를 설정하려면 구성, 하드웨어, 해상도, 비트 깊이 및 12를 선택합니다. 수집 메뉴에서 이미지 수집 모드의 XYZT를 선택하고 목표를 20배 또는 40배로 설정합니다. 순차적 획득 설정을 설정하려면 프레임 간 찾아서 추가 및 선택합니다.시퀀스를 구성하려면 보이는 레이저 상자를 켭니다. 광증 튜브를 일대일로 설정하고 방출 파장을 정의합니다. 시퀀스 2를 구성하려면 보이는 레이저 상자를 켭니다.광증 튜브를 2개에 설정하고 방출 파장을 정의합니다. 그런 다음 적절한 레이저를 활성화합니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 마우스의 눈에 연고를 적용하고 복부의 왼쪽 심실 영역에서 1 센티미터 절개를 만들기 위해 면 봉오리를 사용합니다.집게를 사용하여 장의 3~5센티미터 세그먼트를 외부화합니다. 창자 세그먼트의 상단과 하단에 두 개의 작은 절개를 만들고 장 루멘에 유리 마이크로 피펫을 소개합니다. 그런 다음 전기 카우터화를 사용하여 항 막질 측을 따라 세로로 외부장 세그먼트를 열고 점막을 노출시합니다.배설물 함량을 제거하기 위해 식염수 용액으로 조직을 간단히 헹이시다. 장 점막 표면의 염색을 위해, 노출된 점막 표면에 액적에 아크리플라빈 용액의 밀리리터 당 1밀리그램의 1밀리리터를 적용하고 PBS로 남은 용액을 씻어내기 전에 3분 동안 얼룩이 개발되도록 한다. 다음으로, PBS로 세척하기 전에 3 분 배양에 대한 점막에 밀리리터 로다민 dextran 용액 당 2 밀리그램의 100 마이크로 리터를 적용합니다.그런 다음 마취 된 마우스 supine을 섭씨 37도식염수로 헹구고 필요한 경우 위치를 조정하고 반전 된 현미경 단계에 준비를 배치하여 챔버에 장착 된 커버 슬라이드에 놓습니다. 마우스를 무대에 올려놓은 직후, 광원을 켜고 조명축이 조직 제제에 초점을 맞출 때까지 XY 위치를 조정한다. 비전 필드를 선택하려면 적절한 필터 큐브를 선택합니다.셔터를 열고 매크로와 마이크로 휠을 사용하여 장 점막표면에 초점을 맞춥니다. XY 위치를 조정하여 시야 내에서 여러 개의 빌리를 시각화할 수 있는 영역을 찾고 필터 큐브를 변경하여 로다민 염색도 해당 영역에 보이는지 확인합니다. 관심 영역이 확인되면 이미지 수집을 시작하고 시퀀스 하나를 선택하여 레이저 전력, 게인 및 시퀀스 1에 대한 오프셋을 조정합니다.그런 다음 시퀀스 2를 선택하고 시퀀스 2에 대해 레이저 전력, 게인 및 오프셋을 조정합니다. Z 스택 범위를 정의하려면 Z 스택 드롭오프 메뉴를 엽니다. Z 액세스 컨트롤을 사용하여 점막 표면에 초점을 맞추고 시작을 클릭합니다.신호가 여전히 감지 가능한 위치의 하단 제한에 초점을 맞추고 끝을 클릭합니다. Z 스택 수를 정의하고, 2분 이상 경과를 방지하고, 시간 메뉴를 열어 최소화하고 중지될 때까지 획득합니다. 선 평균을 정의하려면 1회, 줄 평균 2개, 2줄 평균 을 선택, 2줄 평균 2개를 선택합니다.그런 다음 이미지를 얻으려면 형식을 1024 x 1024 픽셀로 설정하고 속도를 400으로 설정하고 시작을 클릭합니다. 장 상피 세포 특이적 GGTase 결핍 조건부 마우스는 소장의 조직학적 손상 점수의 증가와 증가된 장 상피 투과성의 증가에 의해 입증된 바와 같이 심한 장 병리를 개발했으며, 또한 경구 투여FITC-dextran을 사용하여 생체 내 의 추적자 내 의 추적자를 통해 검출될 수 있다. 세포 흘리기 이벤트는 상피 단층에서 루멘으로 이동하는 세포로 식별될 수 있으며, 이는 인접한 세포 사이의 접촉에 의해 마침내 닫혀있는 상피의 천장에 일시적인 간격으로 이어질 수 있습니다.이러한 간격은 대조군과 GGTase 결핍 마우스 모두에서 관찰되지만, 이러한 현상의 빈도는 후자에서 더 높다. 흥미롭게도, 다른 세포는 또한 dextran을 uptake 나타납니다. 이러한 소위 투과성 세포 이벤트는 주로 조건부 녹아웃 마우스에서 발생합니다.관심의 세포 골격 관련 및 단단한 접합 단백질의 면역 염색은 중요한 현미경 검사를 통해 결정된 잠재적인 상피 투과성 중단에 기여하는 특정 표적을 확인하기 위하여 능력을 발휘할 수 있습니다. 이 방법은 장 내피 누설 또는 장 감염의 맥락에서 면역 상피 통신과 같은 장 점막의 표면에 다른 현상의 분석에 사용될 수있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

연구

면역학 및 감염병학

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP<em&gt; 체외에서</emPRP의&gt; 항균 속성

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...