Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

Forskningen som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra People Program (Marie Curie Actions) under REA tilskuddsavtale nummer 302170 av EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013); Tverrfaglig senter for klinisk forskning (IZKF) ved Universitetet Erlangen-Nürnberg; Collaborative Research Center TRR241 og den kliniske forskningsgruppen KFO257 i det tyske forskningsrådet (DFG); og DFG.

Følgende protokoll er godkjent av relevante lokale myndigheter i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus ble plassert under spesifikke patogenfrie forhold.
MERK: Hemming av GGTase-mediert prenylation i IECer forårsaker en alvorlig endring av intestinal permeabilitet hos Pggt1biΔIEC-mus 24. Derfor ble denne musemodellen brukt til å demonstrere hvordan protokollen kan være nyttig for å studere tarmbarrieredefekter. Denne p...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Selv om teknisk utfordrende, intravital mikroskopibasert metodikk representerer en unik eksperimentell tilnærming for å visualisere svært dynamisk cellulær prosess i sanntid, for eksempel cellesheddingytelse. Så langt er det ingen alternativ eksperimentell tilnærming for å visualisere celleprofil in vivo. Vi tror at denne protokollen kan bidra til beskrivelsen av ulike cellulære prosesser som spiller en rolle i vedlikehold av intestinal homeostase.
Ved å dra nytte av intravital mikros...

Tarmen er et høyt spesialisert organ med en tett regulert funksjon som muliggjør motstridende prosesser, nemlig ernæring og beskyttelse mot skadelige luminale stoffer. Fôr mellom menneskekroppen og miljøet, fungerer tarmepitelet som en fysisk og immunologisk barriere og bidrar til vedlikehold av slimhinnehjemostase i tarmen1,2. Tap av epitelintegritet og økt tett knutepunktpermeabilitet er kjent for å være forbundet med inflammatorisk tarmsykdom (IBD)3,,4,,5,,6. Epitelendringer anses da som årsaker og sekundære forsterkere for kronisk tarmbetennelse i IBD. Dermed vil en forbedret forståelse av tidlige epitelendringer i tarmen til IBD-pasienter være av enorm verdi for utviklingen av nye strategier for å gjenopprette epitelintegritet for pålitelig prediksjon og påfølgende forebygging av IBD-tilbakefall.
Tarmepitel følger en kompleks og tett regulert omsetningsprosess. Fra krypten bunnen, terminalt differensiert intestinal epitelceller (IECer) avledet fra pluripotente stamceller migrere oppover til villus spissen, hvor eldre / skadede celler er kastet inn i lumen7. Likevekten mellom deling og celleprofil gjør det mulig å opprettholde tarmepitelcellenumre, unngå dannelse av hull og lekkasje, samt akkumulering av epitelceller som potensielt fører til cellemasser og tumorgenese8,9,10. Til tross for nøkkelrollen til epitelcelleshedding i den fysiologiske fornyelsen av tarmepitelet, er kunnskapen om molekylære mekanismer som driver ekstrudering av celler på villusspissen begrenset. Dermed er det behov for grunnleggende forskning som gir en nøyaktig beskrivelse av sekvensen av molekylære hendelser involvert i epitelcelleshedding.
Komplekse interaksjoner mellom ulike celletyper i tarmslimhinnen er nøkkelen til å forstå molekylære mekanismer som regulerer epitelomsetning og intestinal homeostase. Dermed gir in vivo-studier høye fordeler fremfor in vitro- og ex vivo-tilnærminger i denne sammenhengen. Videre tillater sanntidsbildeteknikker beskrivelsen av hendelsesforløpet som kontrollerer spesifikke fenomener. I denne sammenheng krever studien av svært dynamiske prosesser bruk av optimaliserte høyoppløselige teknikker for direkte observasjon av vevet. Intravital bildeteknikker vises som unike egnede verktøy for studiet av epitelcelleshedding i tarmen.
Begrepet "intravital mikroskopi" refererer til eksperimentelle tilnærminger som drar nytte av høyoppløselige bildeteknikker (multiphoton eller konfokal mikroskopi) for å visualisere celler og vev direkte i sine innfødte omgivelser i et levende dyr11. Det muliggjør sanntidsinnhenting av in vivo-informasjon opp til encellede oppløsning, og medfører klare fordeler ved statiske eller lave oppløsningsmetoder. Intravital mikroskopi gir komplementær informasjon og overvinner noen begrensninger fra klassiske og / eller high-end teknikker, for eksempel gjenstander på grunn av vevbehandling. I motsetning er den viktigste begrensningen av intravital mikroskopi at vevet skal være direkte utsatt for mikroskopet, som i de fleste tilfeller krever kirurgi. Selv om sofistikerte tilnærminger bevare vitalitet og minimere virkningen av avbildet vev (skinfold kamre og bildevinduer)12,13, i de fleste tilfeller en enkel hud snitt utføres for eksternisering av vevet (hudklaffer)14. I det siste tiåret har disse tilnærmingene bidratt med viktige bevis om svært dynamiske prosesser, som tidligere var ugjennomtrengelige. Translasjonelt ga sanntidsavbildning ny biologisk innsikt om stamcelle og leukocytter homing15, samt kreftformidling og metastasedannelse13,16. I klinisk sammenheng utnyttes endomikoskopi for tiden som et diagnostisk verktøy for kreft17 og gastrointestinale sykdommer, som IBD18,19; mens konfokal mosaikkmikroskopi ble et raskt patologiverktøy under operasjonen20. Sammen har intravital mikroskopi i det siste dukket opp som et verdifullt og allsidig verktøy for biomedisinsk forskning og fremtidig anvendelse i klinikken.
Intravital mikroskopi er her implementert for sanntidsvisualisering av tarmepitellekkasje og observasjon av epitelcellesheddinghendelser. Lekkasje av intestinal permeabilitet kan identifiseres ved andre in vivo ikke-invasive teknikker, for eksempel kvantifisering av muntlig administrering av fluorescerende sporstoffer i serum21. Denne teknikken tillater imidlertid ikke direkte observasjon av shedding ytelse eller segregering mellom para- og transcellulær permeabilitet. Kombinasjonen av standard tracer eksperimenter og intravital mikroskopi representerer en passende tilnærming til: i) identifisere forstyrrelser i intestinal permeabilitet, og ii) segregere mellom para- og transcellulær epitelpermeabilitet. Foruten celle shedding, intravital mikroskopi i kombinasjon med in vivo fluorescens merking muliggjør studiet av andre cellulære og molekylære mekanismer (f.eks tight junction omfordeling under celle shedding ved hjelp av fluorescerende reporter mus22 eller interaksjoner mellom IECer og andre celler i tarmslimhinnen23).
Metoden som presenteres her representerer en tilpasning av intravital mikroskopi for å muliggjøre sanntidsobservasjon av tarmslimhinnen, ved hjelp av konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM). Derfor bruker vi betingede knock-out mus av GGTase (Geranylgeranyltransferase) i tarm epitelceller (IECer) i (Pggt1biΔIEC mus), siden de lider av en alvorlig tarmsykdom og økt epitelpermeabilitet24. Kirurgisk fremstilling av musen og farging av tarmslimhinnen, samt passende innstillinger som brukes til bildeanskaffelse og analyse etter oppkjøp, er beskrevet. Denne protokollen kan muliggjøre fremtidige studier som bidrar til dagens kunnskap om dynamikk og kinetikk av intestinal epitelcelleshedding. Videre kan protokollen tjene som grunnlag for ulike tilpasninger for å studere andre fenomener som forekommer på overflaten av tarmslimhinnen, og til og med ved andre vev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Intravital mikroskopi av tarmen ved hjelp av konfokal avbildning gjør det mulig å se på epitelcelleshedding og barrierelekkasje hos levende dyr. Derfor er tarmslimhinnen til bedøvede mus lokalt farget med uspesifikk farging (acriflavine) og en fluorescerende tracer (rhodamine-B dextran), montert på en saltløsningsskyllet plate og direkte avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Denne teknikken kan utfylle andre ikke-invasive teknikker for å identifisere lekkasje av intestinal permeabilitet, for eksempel transmukosal passasje av oralt administrerte tracers. Foruten dette, tilnærmingen presentert her tillater direkte observasjon av celle shedding hendelser i sanntid. I kombinasjon med passende fluorescerende reportermus er denne tilnærmingen egnet for å kaste lys inn i cellulære og molekylære mekanismer som kontrollerer tarmepitelcelleprofilering, samt til andre biologiske prosesser. I de siste tiårene har interessante studier ved hjelp av intravital mikroskopi bidratt til kunnskap om endotelpermeabilitet, immuncelleme gut homing, immunepitelkommunikasjon og invasjon av luminalkomponenter, blant andre. Sammen ville protokollen som presenteres her ikke bare bidra til å øke forståelsen av mekanismer som kontrollerer epitelcelleprofilering, men kan også være grunnlaget for utviklingen av andre tilnærminger som skal brukes som instrumenter for å visualisere andre svært dynamiske cellulære prosesser, selv i andre vev. Blant tekniske begrensninger ville optiske egenskaper av det spesifikke vevet, samt den valgte bildeteknologien og mikroskopkonfigurasjonen, i sin tur bestemme bildeavstanden og oppløsningen av oppkjøpte bilder.

Protokollen som presenteres her beskriver en intravital mikroskopibasert tilnærming for å visualisere tarmepitellekkasje og observere cellesheddingytelse i tarmen i sanntid. Kort sagt blir mus bedøvet og sendt til kirurgisk forberedelse for å avsløre overflaten av tynntarmenslimhinnen. IECer blir deretter farget via aktuell anvendelse av acriflavine; mens luminal rhodamine B-dextran brukes som tracers for å oppdage transmukosal passasje fra lumen til sub-epitelrommet. Dermed er det ...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Ved å dra nytte av intravital mikroskopi, gjør metoden som presenteres her, sanntidsvisualisering av tarmepitelcelleshedding hos levende dyr. Derfor er lokalt farget tarmslimhinne (acriflavine og rhodamineB-dextran) av bedøvet mus avbildet opp til encelleoppløsning ved hjelp av konfokal mikroskopi.

En intravital mikroskopibasert tilnærming for å vurdere intestinal permeabilitet og epitelcellesheddingytelse

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Ved hjelp av intravital mikroskopi muliggjør denne protokollen sanntidsvisualisering av tarmvev opp til en enkeltcelleoppløsning og studiet av svært dynamiske prosesser som celleshedding. I kombinasjon med standard tracer eksperimenter, tillater denne protokollen identifisering av både intestinal permeabilitet forstyrrelser in vivo og skillet mellom para og transcellulær permeabilitet. Denne protokollen kan brukes som grunnlag for utvikling av ytterligere intravitale mikroskopi tilnærminger for visualisering av andre svært dynamiske cellulære prosesser av interesser i ulike vev.Visuell demonstrasjon av denne metoden er avgjørende for å forstå de kirurgiske forberedelsestrinnene og å plassere det levende dyret på en måte som letter bildeoppkjøp på tarmslimhinneoverflaten. Før du begynner prosedyren, slå på basen og skannerboksen til et konfokal laserskanningsmikroskop og trykk på start for å slå på datamaskinen. Start bildeanskaffelsesprogramvaren og velg riktig konfigurasjon.Hvis du vil angi riktig bildeoppløsning, velger du konfigurasjon, maskinvare, oppløsning, bitdybde og 12. Under anskaffelsesmenyen velger du XYZT for bildeanskaffelsesmodus og setter målet til 20 eller 40X. Hvis du vil konfigurere innstillingen for sekvensiell anskaffelse, klikker du søk og legg til og velger mellom rammer.Hvis du vil konfigurere sekvens én, slår du på den synlige laserboksen. Sett photomultiplier tube en til på og definere utslipp bølgelengde. Hvis du vil konfigurere sekvens to, slår du på den synlige laserboksen.Sett photomultiplier tube to til på og definere utslipp bølgelengde. Aktiver deretter de riktige laserne. Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme, bruk en bomullspinne til å bruke salve på øynene til den bedøvede musen og gjøre et en centimeter snitt i venstre ventrikkelregion av magen.Bruk tang til å eksteriere et tre til fem centimeter segment av tarmen. Lag to små snitt på toppen og bunnen av tarmsegmentet og introdusere en glassmikropipe i tarmlumen. Bruk deretter elektrocauterization for å åpne det eksterierte tarmsegmentet langs den antimesenteriske siden og eksponere slimhinnen.Skyll vevet kort med saltoppløsning for å fjerne fekalt innhold. For farging av tarmslimhinnen overflaten, påfør 100 mikroliter av en ett mg per milliliter acriflavine løsning i dråper på den eksponerte slimhinneoverflaten og la flekken utvikle seg i tre minutter før du vasker ut den gjenværende løsningen med PBS. Deretter påfør 100 mikroliter av en to milligram per milliliter rhodamin dextran løsning i dråper til slimhinnen for tre minutters inkubasjon før vask med PBS.Plasser deretter den bedøvede musen liggende på et deksel lysbilde montert på kammeret skyllet med 37 grader Celsius saltvann, justere posisjonen om nødvendig, og plasser preparatet på invertert mikroskop scenen. Umiddelbart etter at du har plassert musen på scenen, slår du på lyskilden og justerer XY-posisjonen til belysningsaksen er fokusert på vevspreparatet. Hvis du vil velge synsfeltet, velger du riktig filterkube.Åpne lukkeren og bruk makro- og mikrohjulene til å fokusere på overflaten av tarmslimhinnen. Juster XY-posisjonen for å finne et område der flere villi kan visualiseres innenfor synsfeltet og endre filterkuben for å kontrollere at rhodamindextranfarging også er synlig i dette området. Når et interesseområde er identifisert, starter du bildeanskaffelsen og velger sekvens én for å justere laserkraften, gevinsten og offsetn for sekvens én.Velg deretter rekkefølge to og juster laserkraften, forsterk og offset for rekkefølge to. Hvis du vil definere Z-stakkområdet, åpner du rullegardinmenyen Z-stakk. Bruk Z-tilgangskontrollen til å fokusere på overflaten av slimhinnen og klikk begynne.Fokuser på den nederste grensen for hvor signalet fortsatt kan oppdages, og klikk slutten. Definer antall Z-stabler, unngå tidsforløp lenger enn to minutter for to påfølgende tidspunkter og åpne tidsmenyen for å velge minimer og anskaffe til stopp. Hvis du vil definere linjegjennomsnittet, velger du Søk etter én, gjennomsnittlig linje to, søker to og linjegjennomsnitt to.Deretter for å hente bilder, sett formatet til 1024 x 1024 piksler og hastigheten til 400 og klikk start. Intestinal epitelcellespesifikke GGTase mangelfulle betingede mus utviklet alvorlig tarmpatologi som demonstrert av en økning i tynntarmens histologiske skadescore og økt intestinal epitelpermeabilitet kan også oppdages via tracer i in-vivo-eksperimenter ved hjelp av oralt administrert FITC-dextran. Celle shedding hendelser kan identifiseres som celler som beveger seg ut av epitelet monolayer inn i lumen, fører til midlertidige hull i taket av epitelet som er endelig lukket av kontakten mellom nærliggende celler, en såkalt glidelås effekt.Disse hullene observeres i både kontroll og GGTase mangelfulle mus, selv om frekvensen av dette fenomenet er høyere i sistnevnte. Interessant, andre celler ser også ut til å ta opp dextran. Disse såkalte gjennomtrengelige cellehendelsene forekommer også hovedsakelig i betingede knockoutmus.Immunstaining av cytoskeleton-relaterte og tette koblingsproteiner av interesse kan utføres for å identifisere spesifikke mål som bidrar til potensielle epitelmessige permeabilitetsforstyrrelser bestemt via intravital mikroskopi. Denne metoden kan brukes til analyse av andre fenomener på overflaten av tarmslimhinnen, for eksempel endotellekkasje eller immunepitelkommunikasjon i sammenheng med tarminfeksjon.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PrP som en ny tilnærming for å hindre smitte: Forberedelse og<em&gt; In vitro</em&gt; Antimikrobielle egenskaper av PrP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Introduksjon Kokulturanalyse for å vurdere patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Utvikling av en IFN-γ ELISPOT analysen å vurdere varicella-zoster virus-spesifikke Cell-mediert immunitet Etter Umbilical Cord Blood Transplantasjon

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

En robust Lungebetennelse Modell hos immunkompetente Gnagere å evaluere Antibakteriell effekt mot<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; eller<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Benytter Human indusert pluripotent stilk cellen-avledet intestinal Organoids å studere og endre epitel cellen sikringen imot Salmonella og annet patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funksjonell vurdering av intestinal permeabilitet og nøytrofil transepithelial migrasjon hos mus ved hjelp av en standardisert tarmsløyfemodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...