Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

Исследования, ведущие к этим результатам, получили финансирование от Программы «Действия людей» (Marie Curie Actions) в соответствии с грантовым соглашением REA No 302170 Седьмой рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013); Междисциплинарный центр клинических исследований (ИЗКФ) Университета Эрлангена-Нюрнберга; Совместный исследовательский центр TRR241 и Группа клинических исследований KFO257 Немецкого исследовательского совета (DFG); и DFG.

Следующий протокол был одобрен соответствующими местными органами власти в Эрлангене (Regierung von Unterfranken, Вюрцбург, Германия). Мыши размещались в особых условиях, свободных от патогенов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибирование GGTase-опосредованного прениляции в IECs вызывает серьезное измен...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Хотя технически сложной, интравитальной микроскопии на основе методологии представляет собой уникальный экспериментальный подход к визуализации высокодинаминого клеточного процесса в режиме реального времени, таких, как производительность клеток пролить. До сих пор нет альтернати?...

Кишечник является высокоспециализированным органом с жестко регулируемой функцией, позволяющей конфликтующие процессы, а именно питание и защита от вредных светящихся веществ. Подкладка между человеческим телом и окружающей средой, кишечный эпителий действует как физический и иммунологический барьер и способствует поддержанию слизистой гомеостаза вкишечнике 1,2. Потеря эпителиальной целостности и повышенная проницаемость плотного соединения, как известно, связаны с воспалительными заболеваниями кишечника (IBD)3,,4,,5,,6. Эпителиальные изменения затем рассматриваются в качестве причин и вторичных усилителей для хронического воспаления кишечника в IBD. Таким образом, улучшение понимания ранних эпителиальных изменений в кишечнике пациентов IBD будет иметь огромное значение для разработки новых стратегий по восстановлению эпителиальной целостности для надежного прогнозирования и последующей профилактики рецидивов IBD.
Кишечный эпителий следует за сложным и жестко регулируемым процессом оборота. Из склепа дно, неизлечимо дифференцированных кишечных эпителиальных клеток (IECs), полученных из плюрипотентных стволовых клеток мигрируют вверх к кончику виллуса, где в возрасте / поврежденных клеток пролить в люмен7. Равновесие между делением и экструзией клеток позволяет поддерживать кишечные эпителиальные числа клеток, избегая образования зазоров и протечек, а также накопление эпителиальных клеток, потенциально ведущих к клеточным массам и опухолевомугенезу 8,,9,,10. Несмотря на ключевую роль эпителиального пролития клеток в физиологическом обновлении эпителия кишечника, знания о молекулярных механизмах, вождения экструзии клеток на кончике вилюля ограничены. Таким образом, необходимо продать фундаментальные исследования, обеспечивающие точное описание последовательности молекулярных событий, связанных с эпителиальным пролитием клеток.
Сложные взаимодействия между различными типами клеток в слизистой оболочке кишечника являются ключевыми для понимания молекулярных механизмов, регулирующих эпителиальный оборот и кишечный гомеостаз. Таким образом, исследования in vivo предлагают высокие преимущества перед подходами in vitro и ex vivo в этом контексте. Кроме того, методы визуализации в режиме реального времени позволяют описание последовательности событий, контролирующих конкретные явления. В этом контексте изучение высокодинаминых процессов требует использования оптимизированных методов высокого разрешения для прямого наблюдения за тканями. Интравитальные методы визуализации появляются в качестве уникальных подходящих инструментов для изучения эпителиальных клеток пролить в кишечнике.
Термин "интравитальная микроскопия" относится к экспериментальным подходам, воспользовавшись методами визуализации высокого разрешения (мультифотонная или конфокальная микроскопия) для непосредственной визуализации клеток и тканей в их родных окрестностях в пределах живогоживотного 11. Это позволяет в режиме реального времени приобретение информации in vivo до разрешения одной ячейки, и влечет за собой явные преимущества по сравнению со статичными или низкими методами разрешения. Интравитальная микроскопия предоставляет дополнительную информацию и преодолевает некоторые ограничения от классических и/или высококачественных методов, таких как артефакты из-за обработки тканей. В отличие от этого, основным ограничением интравитальной микроскопии является то, что ткань должна быть непосредственно подвержена микроскопу, который в большинстве случаев требует хирургического вмешательства. Хотя сложные подходы сохраняют жизнеспособность и минимизируют воздействие изображенной ткани (камеры кожи и окна длявизуализации) 12,,13,в большинстве случаев выполняется простой разрез кожи для экстернализации тканей (кожных лоскутов)14. В последнее десятилетие эти подходы стали ключевыми свидетельствами о высокодинамих процессах, которые ранее были непостижимыми. Переводно, в режиме реального времени изображения предоставили новые биологические идеи о стволовых клетках и лейкоцитовсамонаведения 15, а также распространениерака и образование метастазов 13,16. В клиническом контексте эндомикроскопия в настоящее время используется в качестве диагностическогоинструмента рака 17 и желудочно-кишечных заболеваний, таких как IBD18,19; в то время как конфокальная мозаичная микроскопия стала инструментом быстрой патологии во времяоперации 20. В совокупности интравитальная микроскопия в последнее время стала ценным и универсальным инструментом для биомедицинских исследований и будущего применения в клинике.
Интравитальная микроскопия здесь реализована для визуализации эпителиальной утечки кишечника в режиме реального времени и наблюдения за эпителиальными явлениями пролития клеток. Утечка кишечной проницаемости может быть идентифицирована другими неинвазивными методами in vivo, такими как количественная оценка перорального введения флуоресцентных трассировщиков всыворотке 21. Тем не менее, этот метод не позволяет прямого наблюдения пролить производительность, ни сегрегации между пара- и транс-клеточной проницаемости. Сочетание стандартных экспериментов трассировщика и интравитальной микроскопии представляет собой подходящий подход к: i) выявлению нарушений в проницаемости кишечника и ii) сегрегации между пара- и трансклеточной эпителиальной проницаемостью. Помимо пролития клеток, интравитальная микроскопия в сочетании с маркировкой флуоресценции in vivo позволяет изучать другие клеточные и молекулярные механизмы (например, жесткое перераспределение соединения во время пролития клеток с использованиемфлуоресцентных мышей-репортеров 22 или взаимодействия между IECs и другими клетками внутри слизистойоболочки кишечника 23).
Представленный здесь метод представляет собой адаптацию интравитальной микроскопии для наблюдения слизистой оболочки кишечника в режиме реального времени с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Таким образом, мы используем условные нокаут мышей GGTase (Geranylgeranyltransferase) в кишечных эпителиальных клеток (IECs) в (Pggt1bi qIEC мышей), так как они страдают от тяжелой кишечной болезни и увеличение эпителиальной проницаемости24. Описана хирургическая подготовка мыши и окрашивание слизистой оболочки кишечника, а также соответствующие настройки, используемые для получения изображений и анализа после приобретения. Этот протокол мог бы позволить будущим исследованиям, способствующим современным знаниям о динамике и кинетике кишечного эпителиального пролития клеток. Кроме того, протокол может послужить основой для различных адаптаций для изучения других явлений, происходящих на поверхности слизистой оболочки кишечника, и даже в других тканях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Интравитальная микроскопия кишечника с помощью конфокальной визуализации позволяет в режиме реального времени осуществлять наблюдение за эпителиальным пролитием клеток и утечкой барьеров у живых животных. Таким образом, слизистая оболочка кишечника анестезированных мышей местно окрашены неспецифическим окрашивания (акрифлавин) и флуоресцентный трассировщик (родамин-B декстран), установленный на солевой раствор промыть пластины и непосредственно изображения с помощью конфокального микроскопа. Этот метод может дополнять другие неинвазивные методы для выявления утечки кишечной проницаемости, такие как трансмукозальный проход устно управляемых трассировщиков. Кроме того, представленный здесь подход позволяет осуществлять прямое наблюдение за событиями, которые проливают клетки в режиме реального времени. В сочетании с соответствующими флуоресцентными мышами-репортерами этот подход подходит для пролития света в клеточные и молекулярные механизмы, контролирующие экструзию кишечных эпителиальных клеток, а также на другие биологические процессы. В последние десятилетия, интересные исследования с использованием интравитальной микроскопии способствовали знания по эндотелиальной проницаемости, иммунной клетки кишечника самонаведения, иммунно-эпителиальной связи и вторжения светящихся компонентов, среди других. Вместе представленный здесь протокол не только поможет повысить понимание механизмов контроля экструзии эпителиальных клеток, но и может стать основой для развития других подходов, которые будут использоваться в качестве инструментов для визуализации других высокодинамитических клеточных процессов, даже в других тканях. Среди технических ограничений оптические свойства конкретной ткани, а также выбранная технология визуализации и конфигурация микроскопа, в свою очередь, определяют расстояние работы изображения и разрешение полученных изображений.

Протокол, представленный здесь описывает интравитальной микроскопии на основе подхода к визуализации кишечной эпителиальной утечки и наблюдать производительность клеток пролить в кишечнике в режиме реального времени. Короче говоря, мышей анестезировали и подались...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Воспользовавшись интравитальной микроскопией, представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать пролитие кишечных эпителиальных клеток у живых животных. Поэтому местно окрашенные слизистые оболочки кишечника (акрифлавин и родаминБ-декстран) эстетизированных мышей изобразованы до одноклеточного разрешения с помощью конфокаленной микроскопии.

Подход, основанный на интравитальной микроскопии для оценки проницаемости кишечника и эпителиальной пролития клеток

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Используя интравитарновую микроскопию, этот протокол позволяет в режиме реального времени визуализировать кишечную ткань до разрешения одной клетки и изучать высокодинамительные процессы, такие как пролитие клеток. В сочетании со стандартными экспериментами трассировщика, этот протокол позволяет идентифицировать как кишечные нарушения проницаемости в vivo и различие между пара и трансцеллюлярной проницаемости. Этот протокол можно было бы использовать в качестве основы для разработки дополнительных подходов к интравитальной микроскопии для визуализации других высокодинамизирующих клеточных процессов интересов в различных тканях.Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение для понимания хирургических шагов подготовки и позиционирования живого животного таким образом, что облегчает получение изображения на поверхности слизистой оболочки кишечника. Перед началом процедуры включите основание и сканер коробки конфокального лазерного сканирующего микроскопа и нажмите, начните включить компьютер. Запустите программное обеспечение для получения изображений и выберите соответствующую конфигурацию.Чтобы установить соответствующее разрешение изображения, выберите конфигурацию, аппаратное обеспечение, разрешение, глубину бита и 12. В меню приобретения выберите XY'T для режима приобретения изображения и установите цель до 20 или 40X. Чтобы настроить последовательных параметров приобретения, нажмите искать и добавлять и выбирать между кадрами.Чтобы настроить последовательность один, включите видимую лазерную коробку. Установите фотомультипельную трубку, чтобы она была на ней, и определила длину волны выбросов. Чтобы настроить последовательность два, включите видимую лазерную коробку.Установите фотомультипельную трубку два, чтобы на и определить длину волны выброса. Затем активируйте соответствующие лазеры. После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша, используйте ватный тампон, чтобы применить мазь к глазам обезболивающей мыши и сделать один сантиметр разреза в области левого желудочка живота.Используйте типсы для экстерьера трех-пяти сантиметрового сегмента кишечника. Сделайте два небольших разреза в верхней и нижней части сегмента кишечника и ввещайте стеклянный микропипетт в кишечный люмен. Затем используйте электрокаутеризацию, чтобы открыть экстерьеризованный кишечный сегмент продольно вдоль анти-мезентерической стороны и разоблачить слизистую оболочку.Промыть ткань кратко солевым раствором, чтобы удалить фекальное содержание. Для окрашивания поверхности слизистой оболочки кишечника нанесите 100 микролитров по миллиграмму на миллилитр акрифлавного раствора в каплях на облещенную слизистую поверхность и дайте пятно развиваться в течение трех минут, прежде чем промыть оставшийся раствор с помощью PBS. Затем нанесите 100 микролитров по два миллиграмма на миллилитр раствора декстрана в каплях к слизистой оболочке в течение трех минут инкубации перед стиркой с помощью PBS.Затем поместите анестезированую мышь на крышку слайда, установленного на камеру промыть 37 градусов по Цельсию солевой раствор, регулируя положение, если это необходимо, и поместите препарат на перевернутой стадии микроскопа. Сразу после размещения мыши на сцене, включите источник света и отрегулируйте положение XY до тех пор, пока ось освещения не будет сосредоточена на подготовке тканей. Для того, чтобы выбрать поле зрения, выберите соответствующий куб фильтра.Откройте затвор и используйте макро- и микрокоросла, чтобы сосредоточиться на поверхности слизистой оболочки кишечника. Отрегулируйте положение XY, чтобы найти область, в которой несколько вилли могут быть визуализированы в поле зрения и изменить куб фильтра, чтобы убедиться, что окрашивание родамина декстрана также видно в этой области. Когда область интереса была определена, начните приобретение изображения и выберите последовательность один, чтобы настроить мощность лазера, получить, и компенсировать для последовательности 1.Затем выберите последовательность два и настроить мощность лазера, получить, и компенсировать для последовательности два. Чтобы определить диапазон «К-стек», откройте меню высадки стеков. Используйте управление доступом к q, чтобы сосредоточиться на поверхности слизистой оболочки и нажмите кнопку начать.Сосредоточьтесь на нижнем пределе того, где сигнал все еще обнаруживается, и нажмите конец. Определите количество стеков, избегая промежуток времени более двух минут в течение двух последовательных временных точек и откройте меню времени, чтобы выбрать свести к минимуму и приобрести до остановки. Чтобы определить среднее значение строки, выберите один, строку в среднем два, искать два, и средняя строка два.Затем, чтобы получить изображения, установите формат до 1024 х 1024 пикселей и скорость до 400 и нажмите кнопку запуска. Кишечные эпителиальные клетки конкретных GGTase недостаточно условных мышей разработаны тяжелые кишечные патологии, как попродемонстрировано увеличением гистологического ущерба оценка тонкой кишки и увеличение кишечной эпителиальной проницаемости также могут быть обнаружены с помощью трассировщика в in-vivo экспериментов с использованием устно вводят FITC-декстран. События пролития клеток могут быть определены как клетки, движущиеся из эпителиального монослоя в люмен, что приводит к временным зазорам в потолке эпителия, которые, наконец, закрыты контактом между соседними клетками, так называемый эффект молнии.Эти пробелы наблюдаются как у контроля, так и у неудовлетворительных мышей GGTase, хотя частота этого явления выше у последних. Интересно, что другие клетки также, как представляется, поглощение dextran. Эти так называемые проницаемые клеточные события также происходят в основном у условного нокаутирующего мыша.Иммуностетинирование цитоскелетных и жестких белков соединения, представляющих интерес, может быть выполнено для определения конкретных целей, которые способствуют потенциальным нарушениям эпителиальной проницаемости, определяемым с помощью интравитальной микроскопии. Этот метод может быть использован для анализа других явлений на поверхности слизистой оболочки кишечника, таких как эндотелиальная утечка или иммунная эпителиальная связь в контексте кишечной инфекции.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP как новый подход для предотвращения инфицирования: подготовка и<em&gt; В пробирке</em&gt; Антимикробные свойства PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Микропланшет анализа для оценки химического воздействия на RBL-2H3 дегрануляцию тучных клеток: Влияние триклозан без использования органического растворителя

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay для оценки патогена индуцированной нейтрофил трансэпителиальной миграции

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

Надежный Пневмония Модель в иммунокомпетентных Грызуны для оценки антибактериальную эффективность против<i&gt; S. Пневмококк</i&gt;,<i&gt; H. гриппа</i&gt;,<i&gt; K. Пневмококк</i&gt;,<em&gt; P. палочки</em&gt; или<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток-производные кишечные органоиды для изучения и изменения эпителиальной защиты клеток против сальмонеллы и других патогенов

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...