Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Programmet för människor (Marie Curie Actions) inom ramen för REA:s bidragsavtal nummer 302170 i Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013); det tvärvetenskapliga centret för klinisk forskning (IZKF) vid universitetet Erlangen-Nürnberg; Forskningscentret för samarbete TRR241 och den kliniska forskningsgruppen KFO257 vid det tyska forskningsrådet (DFG); och DFG.

Följande protokoll har godkänts av de berörda lokala myndigheterna i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Möss var inrymt under specifika patogenfria förhållanden.
OBS: Hämning av GGTase-medierad prenylation inom IECs orsakar en allvarlig förändring av tarmpermeabilitet i Pggt1biΔIEC möss24. Därför användes denna musmodell för att demonstrera hur protokollet kan vara användbart för att studera tarmbarriärdefek...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Även om den är tekniskt utmanande, representerar intravital mikroskopibaserad metodologi en unik experimentell metod för att visualisera mycket dynamisk cellulär process i realtid, till exempel cellsutgjutelseprestanda. Hittills finns det ingen alternativ experimentell metod för att visualisera cell extrudering in vivo. Vi anser att detta protokoll kan bidra till beskrivningen av olika cellulära processer spelar en roll i underhåll av intestinal homeostas.
Med fördel av intravital mikr...

Tarmen är ett högspecialiserad orgel med en hårt reglerad funktion som möjliggör motstridiga processer, nämligen näring och skydd mot skadliga luminal ämnen. Foder mellan människokroppen och miljön, tarmepitelet fungerar som en fysisk och immunologisk barriär och bidrar till upprätthållandet av slemhinnans homeostas itarmen 1,2. Förlust av epitelial integritet och ökad snäva korsningen permeabilitet är väl känt för att vara associerad med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)3,4,5,6. Epitelial ändringar är därefter ansett som orsakar och sekundära förstärkare för kronisk inälvs- inflammation i IBD. Således skulle en förbättrad förståelse av tidiga epitelial ändringar i tarmen av IBD patienter vara av enormt värde för utvecklingen av nya strategier för att återställa epitelial integritet för tillförlitlig förutsägelse och efterföljande förebyggande av IBD-återfall.
Tarmepitelet följer en komplex och hårt reglerad omsättningsprocess. Från kryptbotten migrerar terminalt differentierade tarmepitelceller (IECs) som härrör från pluripotenta stamceller uppåt till villusspetsen, där åldrad/skadade celler kastas in i lumen7. Jämvikten mellan delning och cellextrudering möjliggör underhåll av intestinala epitelcellnummer, undvikande av uppkomst av luckor och läckage, samt ansamling av epitelceller potentiellt leder till cellmassor och tumorigenesis8,9,10. Trots den nyckelroll som epitelcellsspillet i den fysiologiska förnyelsen av tarmepitelet, begränsas kunskapen om de molekylära mekanismer som driver extrudering av celler vid villus-spetsen. Således finns det ett behov av grundforskning som ger en exakt beskrivning av sekvensen av molekylära händelser som är inblandade i epitelcellssutgjutelse.
Komplexa interaktioner mellan olika celltyper inom tarmslemhinnan är nyckeln för att förstå de molekylära mekanismer som reglerar epitelomsättning och intestinal homeostas. Således erbjuder in vivo-studier höga fördelar jämfört med in vitro- och ex vivo-tillvägagångssätt i detta sammanhang. Dessutom tillåter bildteknik i realtid beskrivningen av händelseförloppet som styr specifika fenomen. I detta sammanhang kräver studiet av mycket dynamiska processer användning av optimerade högupplösningstekniker för direkt observation av vävnaden. Intravital avbildningstekniker visas som unika lämpliga verktyg för studier av epitelcellsspjut i tarmen.
Termen "intravital mikroskopi" avser experimentella metoder som drar nytta av högupplösta avbildningstekniker (multifoto eller konfokalmikroskopi) för att direkt visualisera celler och vävnader i sina inhemska omgivningar inom ett levande djur11. Det möjliggör förvärv av in vivo-information i realtid upp till encellig upplösning, och medför tydliga fördelar jämfört med statiska eller lågupplösta metoder. Intravital mikroskopi ger kompletterande information och övervinna vissa begränsningar från klassisk och/eller high-end tekniker, såsom artefakter på grund av vävnad bearbetning. Den huvudsakliga begränsningen av intravital mikroskopi är däremot att vävnaden ska vara direkt exponerad för mikroskopet, vilket i de flesta fall kräver operation. Även sofistikerade metoder bevara vitalitet och minimera effekterna av den avbildade vävnaden (skinfold kammare och bildrutor)12,13, i de flesta fall en enkel hud snitt utförs för externalisering av vävnaden (hud klaffar)14. Under det senaste årtiondet har dessa metoder bidragit med viktiga bevis om mycket dynamiska processer, som tidigare var outgrundliga. Translationellt gav realtidsavbildning nya biologiska insikter om stamceller och leukocyter homing15, samt cancerspridning och metastasbildning13,16. I det kliniska sammanhanget utnyttjas för närvarande endomicroscopy som ett diagnostiskt verktyg för cancer17 och gastrointestinala sjukdomar, såsom IBD18,19; medan confocal mosaicking mikroskopi blev en snabb patologi verktyg under kirurgi20. Tillsammans har intravital mikroskopi nyligen vuxit fram som ett värdefullt och mångsidigt verktyg för biomedicinsk forskning och framtida tillämpning på kliniken.
Intravital mikroskopi är här genomförs för realtid visualisering av intestinala epitelial läckage och observation av epitelial cell sprider händelser. Läckage av tarmpermeabilitet kan identifieras genom andra in vivo noninvasive tekniker, såsom kvantifiering av oriskt administrering av fluorescerande spårämnen i serum21. Denna teknik tillåter dock inte direkt observation av shedding prestanda eller segregeringen mellan para- och trans-cellulära permeabilitet. Kombinationen av standard tracer experiment och intravital mikroskopi representerar en lämplig metod för att: i) identifiera störningar i intestinala permeabilitet, och ii) segregera mellan para- och trans-cellulära epiteliapermeabilitet. Förutom cellavgivande möjliggör intravital mikroskopi i kombination med in vivo fluorescensmärkning studiet av andra cellulära och molekylära mekanismer (t.ex. snäva korsningsomfördelning under cellavgivande med hjälp av fluorescerande reportermöss22 eller interaktioner mellan IECs och andra celler inom tarmslemhinnan23).
Den metod som presenteras här representerar en anpassning av intravital mikroskopi för att möjliggöra realtid observation av tarmslemhinnan, med hjälp av confocal laserscanning mikroskopi (CLSM). Därför använder vi villkorliga knock-out möss av GGTas (Geranylgeranyltransferase) i intestinala epitelceller (IECs) i (Pggt1biΔIEC möss), eftersom de lider av en allvarlig tarmsjukdom och ökad epitelial permeabilitet24. Kirurgiska beredning av musen och färgning av tarmslemhinnan, samt lämpliga inställningar som används för bildframställning förvärv och efter förvärv analys beskrivs. Detta protokoll skulle kunna möjliggöra framtida studier som bidrar till den nuvarande kunskapen om dynamik och kinetik av intestinala epitelcell avgivande. Dessutom skulle protokollet kunna tjäna som grund för olika anpassningar för att studera andra fenomen som förekommer vid ytan av tarmslimhinnan, och även vid andra vävnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Intravital mikroskopi av tarmen med hjälp av konfokal avbildning möjliggör realtid observation av epitelial cell avgivande och barriärläckage i levande djur. Därför är tarmslemhinnan hos sövda möss lokalt färgas med ospecifik färgning (acriflavine) och en fluorescerande spårämne (rhodamine-B dextran), monterad på en saltlösning lösningssköljd platta och direkt avbildad med hjälp av ett confocalmikroskop. Denna teknik kan komplettera andra icke-invasiva tekniker för att identifiera läckage av tarmpermeabilitet, såsom transmucosal passage av oralt administrerade spårämnen. Förutom detta, det tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör direkt observation av cell avgivande händelser i realtid. I kombination med lämpliga fluorescerande reportermöss är detta tillvägagångssätt lämpligt för att sprida ljus i cellulära och molekylära mekanismer som styr tarmepitetelcellextrudering, samt till andra biologiska processer. Under de senaste decennierna har intressanta studier med intravital mikroskopi bidragit till kunskap om endotelpermeabilitet, immuncells gut homing, immun-epitelial kommunikation och invasion av luminal komponenter, bland annat. Tillsammans skulle det protokoll som presenteras här inte bara bidra till att öka förståelsen av mekanismer som styr epitelcell extrudering, men kan också ligga till grund för utvecklingen av andra metoder som ska användas som instrument för att visualisera andra mycket dynamisk cellulär process, även i andra vävnader. Bland tekniska begränsningar, optiska egenskaper hos den specifika vävnaden, liksom den valda bildteknik och mikroskop konfiguration, skulle i sin tur, bestämma imaging arbetsavstånd, och upplösning av förvärvade bilder.

Protokollet presenteras här beskriver en intravital mikroskopi-baserade strategi för att visualisera intestinala epitelial läckage och observera cell avgivande prestanda i tarmen i realtid. Kortfattat, möss sövs och lämnas till kirurgisk beredning för att exponera ytan av tunntarmen slemhinnan. IECs färgas sedan via aktuell tillämpning av acriflavine; medan luminal rhodamin B-dextran används som spårämnen för att upptäcka transmukosal passage från lumen till sub-epitelial u...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Med fördel av intravital mikroskopi möjliggör den metod som presenteras här realtid visualisering av intestinala epitelcell avgivande i levande djur. Därför är lokalt färgade intestinala mukosa (acriflavine och rhodamineB-dextran) av sövda möss avbildas upp till encellig upplösning med hjälp av confocal mikroskopi.

En intravital mikroskopi-baserad metod för att bedöma intestinal permeabilitet och epitelial cell shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Med hjälp av intravital mikroskopi möjliggör detta protokoll realtidsvisualisering av tarmvävnad upp till en encellig upplösning och studier av mycket dynamiska processer som cellspjut. I kombination med standard tracer experimenten, detta protokoll tillåter identifiering av både intestinala permeabilitet störningar i vivo och skillnaden mellan para och transcellulära permeabilitet. Detta protokoll skulle kunna användas som grund för utvecklingen av ytterligare intravital mikroskopi metoder för visualisering av andra mycket dynamiska cellulära processer av intressen inom olika vävnader.Visuell demonstration av denna metod är avgörande för att förstå de kirurgiska förberedelse stegen och att positionera det levande djuret på ett sätt som underlättar bild förvärv på tarmen slemhinnan ytan. Innan du börjar proceduren, slå på bas och skanner låda av en confocal laserscanning mikroskop och tryck på start för att slå på datorn. Starta programvaran för bildanskaffning och välj lämplig konfiguration.Om du vill ställa in lämplig bildupplösning väljer du konfiguration, maskinvara, upplösning, bitdjup och 12. Välj XYZT för bildanskaffningsläget under förvärvsmenyn och ange målet till 20 eller 40X. Om du vill ställa in inställningen för sekventiell förvärv klickar du på Sök och lägg till och markera mellan bildrutor.Om du vill konfigurera sekvens ett aktiverar du rutan för synlig laser. Ställa in photomultiplierrör en till på och definiera utsläppsvåglängden. Om du vill konfigurera sekvens två aktiverar du den synliga laserrutan.Ställ in fotomultiplierrör två till på och definiera utsläppsvåglängden. Aktivera sedan lämpliga lasrar. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, använd en bomullsknopp för att applicera salva på ögonen på den sövda musen och göra ett en centimeter snitt i den vänstra ventrikelregionen i buken.Använd tång för att exteriöra en tre till fem centimeter segment av tarmen. Gör två små snitt i toppen och botten av tarmsegmentet och introducera en glasmikropipette i tarmlumen. Använd sedan elektrocauterisering för att öppna det exteriöra tarmsegmentet longitudinellt längs den anti-mesenteria sidan och exponera slemhinnan.Skölj vävnaden kort med saltlösning för att ta bort fekalhalten. För färgning av tarmslemhinnans yta, applicera 100 mikroliter av en ett milligram per milliliter av acriflavinelösning i droppar på den exponerade slemhinnans yta och låt fläcken utvecklas i tre minuter innan du tvättar ut den återstående lösningen med PBS. Därefter applicera 100 mikroliter av en två milligram per milliliter rhodamine dextran lösning i droppar till slemhinnan för tre minuters inkubation innan tvätt med PBS.Placera sedan den sövda musen supine på ett lock glida monterad på kammaren sköljs med 37 grader Celsius saltlösning, justera läget om det behövs, och placera beredningen på inverterade mikroskopet scenen. Omedelbart efter att du placerat upp musen på scenen, sätt på ljuskällan och justera XY-positionen tills belysningsaxeln är inriktad på vävnadspreparationen. För att kunna välja synfält väljer du lämplig filterkub.Öppna slutaren och använd makro- och mikrohjulen för att fokusera på tarmslemhinnans yta. Justera XY-positionen för att lokalisera ett område där flera villi kan visualiseras inom synfältet och ändra filterkuben för att kontrollera att infärgningen av rhodamindextran också syns i det området. När ett område av intresse har identifierats, starta bilden förvärvet och välj sekvens ett för att justera lasereffekten, vinst och offset för sekvens ett.Välj sedan sekvens två och justera lasereffekten, förstärkningen och förskjutningen för sekvens två. Om du vill definiera Z-stack-området öppnar du menyn för Z-stack-avlämning. Använd Z-åtkomstkontrollen för att fokusera på slemhinnans yta och klicka på Begin.Fokusera på den nedre gränsen för var signalen fortfarande är detekterbar och klicka. Definiera antalet Z-stackar, undvika time-lapses längre än två minuter för två på varandra följande tidpunkter och öppna tidsmenyn för att välja minimera och förvärva tills stopp. Om du vill definiera radgenomsnittet väljer du sök ett, radgenomsnitt två, sök två och radgenomsnitt två.Sedan att skaffa bilder, ställa in formatet till 1024 x 1024 pixlar och hastigheten till 400 och klicka på start. Intestinala epitelial cell-specifika GGTase bristfällig conditional mice utvecklat allvarliga intestinala patologi som framgår av en ökning av den histologiska skador poängen för tunntarmen och ökad intestinala epitelial permeabilitet kan också detekteras via spårämne i in-vivo experiment med hjälp av oralt administreras FITC-dextran. Cellutgivande händelser kunde identifieras som celler som rör sig ut ur epitelial monolayer i lumen, vilket leder till tillfälliga luckor i taket av epitelet som slutligen stängs av kontakten mellan angränsande celler, en så kallad dragkedja effekt.Dessa luckor observeras i både kontroll och GGTase bristfälliga möss, även om frekvensen av dessa fenomen är högre i den senare. Intressant nog verkar andra celler också att ta upptag dextran. Dessa så kallade genomsläppliga cellhändelser förekommer också huvudsakligen hos villkorliga knockoutmöss.Immunfärgning av cytoskelett-relaterade och snäva knutpunkter proteiner av intresse kan utföras för att identifiera specifika mål som bidrar till potentiella epitelial permeabilitet störningar bestäms via intravital mikroskopi. Denna metod kan användas för analys av andra fenomen på ytan av tarmslemhinnan, såsom endotelläckage eller immun epitelial kommunikation i samband med tarminfektion.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP som en ny metod för att förhindra infektion: Förberedelser och<em&gt; In vitro</em&gt; Antimikrobiella egenskaper hos PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En mikroplatta analys för att bedöma Kemiska Effekter på RBL-2H3 mastcelldegranulering: Effekter av Triclosan utan användning av ett organiskt lösningsmedel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Utveckling av en IFN-γ ELISpot analys för att bedöma varicella zoster-cellmedierad immunitet virusspecifika Efter navelsträngsblod Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

En robust Lunginflammation Model Immunokompetenta Gnagare att utvärdera Antibakteriell effekt mot<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; eller<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller-derived intestinal Organoider att studera och modifiera epitelial cell skydd mot salmonella och andra patogener

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Funktionell bedömning av intestinal permeabilitet och neutrofil transepithelial migration hos möss med hjälp av en standardiserad tarmslinga modell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...