Name: an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı'nın (FP7/2007-2013) 302170 sayılı REA hibe anlaşması kapsamında İnsan Programı'ndan (Marie Curie Eylemleri) fon almıştır; Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (İZKF); Ortak Araştırma Merkezi TRR241 ve Alman Araştırma Konseyi'nin (DFG) KFO257 Klinik Araştırma Grubu; ve DFG.

Aşağıdaki protokol Erlangen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya). Fareler belirli patojeniçermeyen koşullar altında barındırıldı.
NOT: IEC'lerde GGTase aracılı prenilasyonin inhibisyonu Pggt1biΔIEC farelerde bağırsak geçirgenliğinin ciddi bir değişimine neden olur24. Bu nedenle, bu fare modeli protokolün bağırsak bariyeri defektlerini incelemek için nasıl yara...

<ol>
	<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn's+disease:+role+of+CARD15+3020insC+mutation?.">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?.</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li><li>Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Role+of+the+Gut+Epithelial+Barrier+in+the+Pathogenesis+of+Chronic+Intestinal+Inflammation:+Lessons+Learned+from+Animal+Models+and+Human+Genetics.">Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics.</a> Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+barrier+dysfunction+identified+by+confocal+laser+endomicroscopy+predicts+relapse+in+inflammatory+bowel+disease.">Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).</li><li>Dourmashkin, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+patchy+necrosis+in+Crohn's+disease.">Epithelial patchy necrosis in Crohn's disease.</a> Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).</li><li>Soderholm, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+increase+in+tight+junction+permeability+by+luminal+stimuli+in+the+non-inflamed+ileum+of+Crohn's+disease.">Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's disease.</a> Gut. 50 (3), 307-313 (2002).</li><li>Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-epithelial+crosstalk+at+the+intestinal+surface.">Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface.</a> American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).</li><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+self-renewal,+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium.">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).</li><li>Fan, Y., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+compensatory+proliferation.+The+Cell+is+dead.+Long+live+the+Cell!.">Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!.</a> Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).</li><li>Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+can+induce+compensatory+cell+proliferation+through+the+JNK+and+the+Wingless+signaling+pathways.">Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways.</a> Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).</li><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).</li><li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+Techniques+for+Biomedical+and+Clinical+Research.">Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research.</a> Cytometry A. , (2019).</li><li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber.">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li><li>Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy+(CEM)+improves+efficiency+of+Barrett+surveillance.">Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance.</a> Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).</li><li>Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+gastrointestinal+diseases.">Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases.</a> Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).</li><li>Kiesslich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromoscopy-guided+endomicroscopy+increases+the+diagnostic+yield+of+intraepithelial+neoplasia+in+ulcerative+colitis.">Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Fluorescence+Microscopy+Platform+Suitable+for+Rapid+Evaluation+of+Small+Fragments+of+Tissue+in+Surgical+Pathology+Practice.">Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+In+vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li><li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding.">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).</li><li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection.">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-A+prenylation+and+signaling+link+epithelial+homeostasis+to+intestinal+inflammation.">Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).</li><li>Duckworth, C. A., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epithelial+cell+shedding+and+gaps+in+the+intestinal+epithelium.">Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium.</a> Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>Haep, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Gamma+Counteracts+the+Angiogenic+Switch+and+Induces+Vascular+Permeability+in+Dextran+Sulfate+Sodium+Colitis+in+Mice.">Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).</li><li>Lopez-Posadas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+PGGT1B+Disrupts+Function+of+RHOA,+Resulting+in+T-cell+Expression+of+Integrin+alpha4beta7+and+Development+of+Colitis+in+Mice.">Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice.</a> Gastroenterology. , (2019).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li></ol>

Teknik olarak zorlu olsa da, intravital mikroskopi tabanlı metodoloji, hücre dökülme performansı gibi son derece dinamik hücresel süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için benzersiz bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Şimdiye kadar hücre ekstrüzyonunu in vivo görselleştirmek için alternatif bir deneysel yaklaşım yoktur. Bu protokolün bağırsak homeostazının korunmasında rol oynayan çeşitli hücresel süreçlerin tanımlanmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.
<p class="j...

Bağırsak, çatışan süreçleri sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir işlevi olan son derece uzmanlaşmış bir organdır, yani beslenme ve zararlı luminal maddelere karşı koruma. Insan vücudu ve çevre arasında astar, bağırsak epitel fiziksel ve immünolojik bariyer olarak davranır ve bağırsakta mukozal homeostaz bakımına katkıda bulunur1,2. Epitel bütünlüğü kaybı ve artan sıkı kavşak geçirgenliği iyi Inflamatuar Barsak Hastalığı ile ilişkili olduğu bilinmektedir (IBD)3,4,5,6. Epitel değişiklikler daha sonra NEDEN ve İBH kronik bağırsak iltihabı için ikincil amplifikatör olarak kabul edilir. Böylece, IBD hastalarının bağırsaklarında erken epitel değişikliklerin geliştirilmiş bir anlayış güvenilir tahmin ve IBD relaps sonraki önlenmesi için epitel bütünlüğünü geri yüklemek için yeni stratejiler geliştirilmesi için büyük bir değer olacaktır.
Bağırsak epitelkarmaşık ve sıkı düzenlenmiş ciro süreci izler. Crypt alttan, ölümcül farklılaşmış bağırsak epitel hücreleri (IECs) pluripotent kök hücrelerden elde edilen villus ucu, yaşlı / hasarlı hücreler lümen içine dökülür yukarı doğru göç7. Bölünme ve hücre ekstrüzyonu arasındaki denge bağırsak epitel hücre sayılarının sürdürülmesini sağlar, boşluk ve sızıntı oluşumunu kaçınarak, yanı sıra potansiyel hücre kitleleri ve tümörigenez 8 yol açan epitel hücrelerinin birikimi8,9,10. Bağırsak epitelinin fizyolojik yenilenmesinde epitel hücrelerinin dökülmesinin kilit rolüne rağmen, villus ucundaki hücrelerin ekstrüzyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgi sınırlıdır. Bu nedenle, epitel hücre dökülme dahil moleküler olayların dizisinin kesin bir açıklamasını sağlayan temel araştırma için bir ihtiyaç vardır.
Bağırsak mukozası içinde farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler epitel ciro ve intestinal homeostaz düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak için anahtardır. Bu bağlamda in vivo çalışmaları in vitro ve ex vivo yaklaşımlara göre yüksek avantajlar sunmaktadır. Ayrıca, gerçek zamanlı görüntüleme teknikleri belirli olayları kontrol olayların dizisinin açıklamasını sağlar. Bu bağlamda, son derece dinamik süreçlerin incelenmesi, dokunun doğrudan gözlemlenmesi için optimize edilmiş yüksek çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını gerektirir. İntravital görüntüleme teknikleri bağırsakta epitel hücre dökülmesi çalışma için benzersiz uygun araçlar olarak görünür.
"İntravital mikroskopi" terimi, canlı bir hayvan ın içindeki hücre ve dokuları doğrudan görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinden (multifoton veya konfokal mikroskopi) yararlanan deneysel yaklaşımları ifade eder11. In vivo bilgilerin in vivo çözünürlüğe kadar gerçek zamanlı olarak elde edilmesini sağlar ve statik veya düşük çözünürlüklü yöntemlere göre net avantajlar sağlar. İntravital mikroskopi tamamlayıcı bilgi sağlar ve klasik ve / veya high-end teknikleri bazı sınırlamalar aşmak, doku işleme nedeniyle eserler gibi. Buna karşılık, intravital mikroskopi nin ana sınırlama doku doğrudan mikroskopa maruz olması gerektiğini, hangi çoğu durumda cerrahi gerektirir. Sofistike yaklaşımlar canlılığı korumak ve görüntülenmiş doku etkisini en aza indirmek rağmen (skinfold odaları ve görüntüleme pencereleri)12,13, çoğu durumda basit bir deri kesi doku (deri flepleri) dışsallaştırma için yapılır14. Son on yılda, bu yaklaşımlar daha önce anlaşılmaz olan son derece dinamik süreçler hakkında önemli kanıtlar alabildi. Çeviri, gerçek zamanlı görüntüleme kök hücre ve lökositler homing yeni biyolojik anlayışlar sağlanan15, yanı sıra kanser yayma ve metastaz oluşumu13,16. Klinik bağlamda, endomikroskopi şu anda kanser tanı aracı olarak istismar17 ve gastrointestinal hastalıklar, IBD gibi18,19; konfokal mozaik mikroskopi cerrahi sırasında hızlı bir patoloji aracı haline geldiiken 20. Birlikte, intravital mikroskopi son zamanlarda klinikte biyomedikal araştırma ve gelecekteki uygulama için değerli ve çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır.
İntravital mikroskopi burada intestinal epitel kaçağının gerçek zamanlı görüntülenmesi ve epitel hücre dökülme olaylarının gözlemlenmesi için uygulanmaktadır. Bağırsak geçirgenliğinin kaçağı, serum21'dekifloresan izleyicilerin sözlü olarak uygulanması gibi diğer in vivo noninvaziv teknikler ile tespit edilebilir. Ancak, bu teknik dökülme performansı nın doğrudan gözlemine veya para-ve hücre içi geçirgenlik arasındaki ayrımına izin vermez. Standart izleyici deneyleri ve intravital mikroskopi kombinasyonu uygun bir yaklaşımı temsil eder: i) bağırsak geçirgenliği bozuklukları tanımlamak, ve ii) para arasında ayırmak- ve trans-hücre içi geçirgenlik. Hücre dökülmesinin yanı sıra, in vivo floresan etiketleme ile birlikte intravital mikroskopi diğer hücresel ve moleküler mekanizmaların çalışmasını sağlar (örneğin, floresan muhabir fareler kullanarak hücre dökülmesi sırasında sıkı kavşak yeniden dağılımı22 veya bağırsak mukozası içindeki IEC'ler ve diğer hücreler arasındaki etkileşimler23).
Burada sunulan yöntem, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak bağırsak mukozasının gerçek zamanlı gözlemini sağlamak için intravital mikroskopinin bir adaptasyonunu temsil etmektedir. Bu nedenle, ggtase koşullu knock-out fareler kullanın (Geranylgeranyltransferaze) bağırsak epitel hücrelerinde(IECs)iΔIEC içinde, onlar ciddi bir bağırsak hastalığı muzdarip ve artmış epitel geçirgenliği muzdarip beri24. Farenin cerrahi olarak hazırlanması ve bağırsak mukozasının boyanışı, görüntüleme kazanımı ve kazanım sonrası analiziçin kullanılan uygun ayarlar anlatılmaktadır. Bu protokol, bağırsak epitel hücresi dökülmesinin dinamiği ve kinetikleri hakkında güncel bilgilere katkıda bulunan gelecekteki çalışmalara olanak sağlayabilir. Ayrıca, protokol bağırsak mukozası yüzeyinde meydana gelen diğer olayları incelemek için çeşitli adaptasyonlar için bir temel olarak hizmet verebilir, ve hatta diğer dokularda.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acriflavine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8251</td>
			<td>1 mg/mL solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltaphase isothermal pad</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-DP-PAD</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>BrainTree</td>
			<td>B-GEM-5917</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>WDT</td>
			<td>9089.01.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1824</td>
			<td>10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps (Dumont SS)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T5648</td>
			<td>50 mg/mL in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intravital microscopy-based approach to assess intestinal permeability and epithelial cell shedding performance

Konfokal görüntüleme ile bağırsağın intravital mikroskobu, canlı hayvanlarda epitel hücre dökülmesi ve bariyer kaçağının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, anestezik farelerin bağırsak mukozası topikal olarak spesifik olmayan boyama (acriflavine) ve floresan izleyici (rhodamine-B dextran), tuzlu çözelti-durulanmış plaka üzerine monte ve doğrudan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bu teknik, ağızdan uygulanan izleyicilerin transmukozal geçişi gibi bağırsak geçirgenliğinin sızıntısını belirlemek için diğer non-invaziv teknikleri tamamlayabilir. Bunun yanı sıra, burada sunulan yaklaşım gerçek zamanlı olarak hücre dökülme olayları doğrudan gözlem sağlar. Uygun floresan muhabir fareler ile birlikte, bu yaklaşım hücresel ve moleküler mekanizmalar bağırsak epitel hücre ekstrüzyon kontrol içine ışık dökülmesi için uygundur, yanı sıra diğer biyolojik süreçler. Son yıllarda, intravital mikroskopi kullanarak ilginç çalışmalar endotel geçirgenliği hakkında bilgi katkıda bulunmuştur, bağışıklık hücresi bağırsak homing, bağışıklık-epitel iletişim ve luminal bileşenlerin invazyonu, diğerleri arasında. Burada sunulan protokol, sadece epitel hücre ekstrüzyonunu kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olmakla kalmıyor, aynı zamanda diğer dokularda bile diğer son derece dinamik hücresel süreci görselleştirmek için araç olarak kullanılacak diğer yaklaşımların gelişimsel temelini de oluşturacaktır. Teknik sınırlamalar arasında, belirli dokunun optik özelliklerinin yanı sıra seçilen görüntüleme teknolojisi ve mikroskop yapılandırması da görüntüleme çalışma mesafesini ve edinilmiş görüntülerin çözünürlüğünü belirleyecektir.

Burada sunulan protokol, bağırsak epitel kaçağı görselleştirmek ve gerçek zamanlı olarak bağırsakta hücre dökülme performansını gözlemlemek için intravital mikroskopi tabanlı bir yaklaşım açıklar. Kısaca, fareler anestezi ve ince bağırsak mukoza yüzeyini ortaya çıkarmak için cerrahi hazırlık teslim edilir. IEC'ler daha sonra acriflavine topikal uygulama ile boyanır; luminal rhodamine B-dextran lümenden alt epitel uzaya transmukozal geçişi tespit etmek i...

Watch this Scientific Journal Video about An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance at JoVE.com

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

İntravital mikroskopi kullanılarak, bu protokol tek hücreçözünürlüğe kadar bağırsak dokusunun gerçek zamanlı görselleştirilmesive hücre dökülmesi gibi son derece dinamik süreçlerin incelenmesini sağlar. Standart izleyici deneyleri ile birlikte, bu protokol hem in vivo intestinal geçirgenlik bozukluklarının tanımlanmasına hem de para ve hücre sellüler geçirgenlik arasındaki ayrımın belirlenmesine izin verir. Bu protokol, çeşitli dokular içinde ilgi alanlarının diğer son derece dinamik hücresel süreçlerini görselleştirmek için ek intravital mikroskopi yaklaşımlarının geliştirilmesinde temel olarak kullanılabilir.Bu yöntemin görsel gösterimi cerrahi hazırlık adımlarını anlamak ve canlı hayvanı bağırsak mukozal yüzeyinde görüntü edinimi kolaylaştıracak şekilde konumlandırmak için gereklidir. İşleme başlamadan önce, confocal lazer tarama mikroskobunun tabanını ve tarayıcı kutusunu açın ve bilgisayarı açmak için basmaya başlayın. Görüntü edinme yazılımını başlatın ve uygun yapılandırmayı seçin.Uygun görüntü çözünürlüğünü ayarlamak için yapılandırma, donanım, çözünürlük, bit derinliği ve 12'yi seçin. Edinme menüsü altında, görüntü edinme modu için XYZT'yi seçin ve hedefi 20 veya 40X olarak ayarlayın. Sıralı edinme ayarını ayarlamak için, ara ve ekle ve çerçeveler arasında seçim yapmak için tıklatın.Birinci sırayı yapılandırmak için görünür lazer kutusunu açın. Fotoçarpan tüpünü bire ayarlayın ve emisyon dalga boyunu tanımlayın. İkinci sırayı yapılandırmak için görünür lazer kutusunu açın.Fotoçarpan tüpünü iki üzerine ayarlayın ve emisyon dalga boyunu tanımlayın. Sonra uygun lazerler etkinleştirin. Parmak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, anestezili fare gözlerine merhem uygulamak ve karın sol ventrikül bölgesinde bir santimetre lik kesi yapmak için bir pamuk tomurcuk kullanın.Bağırsağın 3-5 santimetrelik bir bölümünü dışlaştırmak için çalgılar kullanın. Bağırsak segmentinin üst ve alt kısmında iki küçük kesiler olun ve bağırsak lümen içine bir cam mikropipet tanıtmak. Daha sonra anti-mezenterik tarafı boyunca dışlanmış bağırsak segmentini uzunlamasına açmak ve mukozaortaya çıkarmak için elektrokoterizasyon kullanın.Dışkı içeriğini çıkarmak için tuzlu çözelti ile kısa bir süre doku durulayın. Bağırsak mukoza yüzeyinin boyanması için, damlacıklara mililitre başına bir miligram lık bir miligram 100 mikrolitre acriflavine çözeltisi damlacıkları maruz kalan mukozal yüzeye uygulayın ve kalan çözeltiyi PBS ile yıkamadan önce lekenin üç dakika boyunca gelişmesine izin verin. Daha sonra, PBS ile yıkamadan önce üç dakika kuluçka için mukoza ya da damlacıklar için mililitre rhodamine dextran çözeltisi başına iki miligram 100 mikrolitre uygulayın.Daha sonra anestezili fare supine 37 derece santigrat tuzlu ile durulanmış oda üzerine monte edilmiş bir kapak slayt yerleştirin, gerekirse konumunu ayarlayarak, ve ters mikroskop aşamasına hazırlık yerleştirin. Fareyi sahneye yerleştirdikten hemen sonra, ışık kaynağını açın ve aydınlatma ekseni doku hazırlığına odaklanana kadar XY konumunu ayarlayın. Görme alanını seçmek için uygun filtre küpünü seçin.Deklanşörü açın ve bağırsak mukozayüzeyine odaklanmak için makro ve mikro tekerlekleri kullanın. XY konumunu, görüş alanı içinde birkaç villinin görüntülenebildiği bir alanı bulmak için ayarlayın ve o bölgede rhodamine dextran boyamanın da görülebildiğinden doğrulamak için filtre küpünü değiştirin. İlgi çekici bir alan belirlendiğinde, görüntü edinimini başlatın ve lazer gücünü ayarlamak için birinci sırayı seçin, birinci sekans için kazanç ve mahsup.Ardından ikinci sırayı seçin ve lazer gücünü, kazancını ve ikinci sırayı ofset olarak ayarlayın. Z yığını aralığını tanımlamak için Z yığını bırakma menüsünü açın. Mukozanın yüzeyine odaklanmak için Z-access denetimini kullanın ve başlat'ı tıklatın.Sinyalin hala algılabildiği alt sınıra odaklanın ve bitişe tıklayın. Art arda iki zaman noktası için iki dakikadan uzun zaman atlamalarından kaçınarak Z-yığınlarının sayısını tanımlayın ve en aza indirgenip duruncaya kadar elde etmek için zaman menüsünü açın. Satır ortalamasını tanımlamak için bir, satır ortalaması iki, iki ve satır ortalaması iki'yi arayın'ı seçin.Ardından görüntü elde etmek için formatı 1024 x 1024 piksele, hızı 400 piksele ayarlayın ve başlat'ı tıklatın. İnce bağırsağın histolojik hasar skorunda artış gösterildiği gibi bağırsak epitel hücrespesifik GGTase eksikliği olan koşullu farelerde ciddi bağırsak patolojisi gelişti ve bağırsak epitel geçirgenliği de ağızdan uygulanan FITC-dextran kullanılarak in-vivo deneylerde izleyici ile saptanabilir. Hücre dökülme olayları hücreler lümen içine epitel monolayer dışarı hareket olarak tespit edilebilir, sonunda komşu hücreler arasındaki temas tarafından kapatılır epitel tavanında geçici boşluklara yol açan, bir sözde fermuar etkisi.Bu boşluklar hem kontrol hem de GGTase eksikliği olan farelerde gözlenir, ancak bu fenomenin sıklığı ikincisinde daha yüksektir. İlginçtir, diğer hücreler de dextran alımı görünür. Bu sözde geçirbilebilir hücre olayları da şartlı nakavt fareler de esas olarak meydana gelir.İntravital mikroskopi ile belirlenen potansiyel epitelyal geçirgenlik bozulmalarına katkıda bulunan belirli hedefleri belirlemek için sitoiskeletle ilgili ve sıkı kavşak proteinlerinin immünboyama yapılabilir. Bu yöntem bağırsak mukozası yüzeyinde ki endotel kaçağı veya bağırsak enfeksiyonu bağlamında immün epitel iletişim gibi diğer fenomenlerin analizi için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Hazırlama ve: Enfeksiyon Önleme Yeni Bir Yaklaşım olarak PRP<em&gt; In vitro</emPRP&gt; Antimikrobiyal Özellikleri

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Development of an IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

Immünkompetan Kemirgenler bir Sağlam Pnömoni Modeli karşı antibakteriyel etkinliğini değerlendirmektir<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;<i&gt; H. influenza</i&gt;<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ya da<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Insan kaynaklı pluripotent kök hücresini kullanma- Salmonella ve diğer patojenlere karşı epitelyal hücre korumasını Incelemek ve değiştirmek Için bağırsak organoidleri türetilmiştir

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...