Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

We zijn Timo Fritsch dankbaar voor uitstekende dierenverzorging. Wij danken de leden van de Köster en Steinert labs voor steun en nuttige discussies. We danken Dr. Dandan Han voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de financiering van de deelstaat Nedersaksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Alle hier beschreven dierwerkzaamheden werden uitgevoerd in overeenstemming met de wettelijke voorschriften (EU-Richtlijn 2010/63, licentie AZ 325.1.53/56.1-TUBS en licentie AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Bereiding van laagsmeltende Agarose, Gel Plate en Microinjection/Microgavage Naalden
<ol><li>Los 0,08 g laagsmeltende agarose op (Tabel met materialen, agarose A2576) in 10 mL van 30% Danieau's medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 ...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile.">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li><li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance.">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li><li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain,+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078.">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li><li>P&#233;pin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea:+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec.">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li><li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

De gepresenteerde methoden wijzigen en breiden een bestaande aanpak uit om zebravissenlarven te infecteren door zowel injectie als microgavage10,14uit te voeren. Het toont ook een benadering aan om anaërobe ziekteverwekkers met zebravissenlarven te bestuderen22. Bovendien vergemakkelijkt het protocol de analyse van aangeboren immuuncelreacties in vivo op CDI en bij kolonisatie van C. difficile bij zebravissen. De methode is repro...

C. difficile is een gram-positieve, spore-vormende, anaërobe en toxine-producerende bacillus dat is de belangrijkste oorzaak van ernstige infecties in het maag-darmkanaal1. Typische symptomen van CDI zijn diarree, buikpijn en fatale pseudomembranous colitis, en het kan soms leiden tot de dood1,2. Bewijs heeft aangetoond dat gastheer immuunreacties een cruciale rol spelen in zowel de progressie als de uitkomst van deze ziekte3. Naast de immuunrespons is de inheemse darmmicrobiota cruciaal voor het begin en de pathogenese van CDI4. In het afgelopen decennium zijn zowel het aantal gevallen als het sterftecijfer van CDI aanzienlijk toegenomen als gevolg van de opkomst van een hypervirulente stam van C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Een beter begrip van onderliggende immuunmechanismen en de rol van microbiota tijdens CDI zal helpen leiden tot nieuwe therapeutische ontwikkelingen en vooruitgang, waardoor deze epidemie beter kan worden onder controle.
Verschillende diermodellen, zoals de hamster en de muis, zijn ontwikkeld om inzicht te geven in de immuunverdediging tegen C. difficile7,8. Echter, de rol van aangeboren immuuncellen is nog steeds slecht begrepen, vooral omdat aangeboren immuuncel gedrag is voornamelijk afgeleid van histologische analyse of gekweekte cellen in vitro. Daarom zal het vaststellen van een transparant zebravismodel om de aangeboren immuunrespons op C. difficile binnenkant van een levend gewerveld organisme aan het licht te brengen, dergelijke studies vergemakkelijken. Zebravissen larven hebben een functioneel aangeboren immuunsysteem, maar ze missen het adaptieve immuunsysteem tot 4-6 weken na de bevruchting9. Deze unieke functie maakt zebravissenlarven een uitstekend model om de geïsoleerde respons en functie van aangeboren immuuncellen in CDI te bestuderen.
Dit rapport beschrijft nieuwe methoden met behulp van zebravissen larven om de interacties tussen C. difficile en aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen te bestuderen. Ten eerste wordt een gelokaliseerd micro-injectieprotocol gepresenteerd dat C. difficile inoculum en kleuring omvat. Met behulp van in vivo confocale time-lapse beeldvorming wordt de respons van neutrofielen en macrofagen op de infectieplaats geregistreerd en wordt de fagocytose van bacteriën door neutrofielen en macrofagen waargenomen. Er is echter gemeld dat de injectie zelf weefselschade veroorzaakt en leidt tot de aanwerving van leukocyten onafhankelijk van de bacterie10. Daarom wordt vervolgens een niet-invasief microgavageprotocol beschreven om C. difficile in de darm van zebravissenlarven te leveren. Eerdere studies hebben aangetoond dat inheemse gastro-intestinale microbiota een gastheer te beschermen tegen de kolonisatie van C. difficile11. Daarom worden gnotoötische zebravissenlarven ook gebruikt om de zebravis die besmet zijn 12vatbaar te maken. Daarna wordt darmdissectie uitgevoerd om levensvatbare C. difficile te herstellen en de duur van hun aanwezigheid in zebravissen darmkanaal te valideren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides difficile infectie (CDI) wordt beschouwd als een van de meest voorkomende gezondheidszorg-geassocieerde gastro-intestinale infecties in de Verenigde Staten. De aangeboren immuunrespons tegen C. difficile is beschreven, maar de exacte rollen van neutrofielen en macrofagen in CDI zijn minder begrepen. In de huidige studie worden Danio rerio (zebravissen) larven gebruikt om een C. difficile infectiemodel vast te stellen voor beeldvorming van het gedrag en de samenwerking van deze aangeboren immuuncellen in vivo. Om C. difficilete controleren, is een etiketteringsprotocol met behulp van een fluorescerende kleurstof ingesteld. Een gelokaliseerde infectie wordt bereikt door micro-injecting gelabeld C. difficile, die actief groeit in de zebravissen darmkanaal en bootst de darmepitheel schade in CDI. Echter, dit directe infectie protocol is invasief en veroorzaakt microscopische wonden, die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Daarom wordt hier een meer niet-invasief microgavageprotocol beschreven. De methode omvat de levering van C. difficile cellen rechtstreeks in de darm van zebravissen larven door intubatie via de open mond. Deze infectie methode bootst nauw de natuurlijke infectie route van C. difficile.

C. difficile is strikt anaeroob, maar de chromofhore van fluorescerende eiwitten vereist meestal zuurstof om te rijpen. Om dit probleem te overwinnen, werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om levende C. difficile cellen die actief groeiden vlekken (R20291, een ribotype 027 stam; Figuur 1A). Met behulp van het Gal4/UAS-systeem werden stabiele transgene zebravislijnen gegenereerd voor live beeldvorming, waarbij de mpeg1.1- of lyZ-promotors</...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Hier gepresenteerd is een veilige en effectieve methode om zebravissen larven te infecteren met fluorescerend gelabeldanaërobe C. difficile door micro-injectie en niet-invasieve microgavage.

Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Deze methode kan antwoord geven op de belangrijkste vraag over de rol van aangeboren immuunsysteem in de Clostridium-infectie, zoals of en hoe macrofagen deze ziekteverwekker herkennen of phgocytose. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het kan worden toegepast op veel verschillende anaërobe bacteriën, dat de infectie tijd kan worden gemanipuleerd, en dat orale toediening vertegenwoordigt de normale menselijke infectie veel dichterbij. Breng na het kweken een milliliter van de cultuur over in een spectrofotometer cuvette en meet de OD600.Breng het benodigde bedrag over in een verse buis van 1,5 milliliter om een laatste OD van 1 tot 1,2 in één milliliter eindvolume te bereiken. Was één keer met één milliliter 1X PBS en centrifuge drie minuten lang op kamertemperatuur op 5.000 g. Resuspend in een milliliter van 1X PBS.Voeg drie microliter werkoplossing van de voorbereide fluorescerende kleurstof toe aan de bacteriële suspensie van één milliliter. Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Daarna, was de gekleurde Clostridioides difficile eenmaal met 1X PBS om resterende kleurstof te verwijderen, en resuspend in een milliliter van 1X PBS om een OD600 van 1.0 te bereiken.Plaats eerst een druppel van 0,8%laag smeltende agarose op de zebravislarven in een petrischaaltje om te bedekken. Pas de larven voorzichtig aan een zijdelingse positie aan. Plaats de petrischaal 30 tot 60 seconden op ijs zodat de laagsmeltende agarose kan stollen.Voeg 30% Danieau's medium met 0,02% tot 0,04% tricaine toe om de agarose te dekken. Om injectieoplossing voor te bereiden, voeg een microliter van 0,5% fenolrood in PBS-oplossing toe in negen microliter van de met kleurstof bevlekte Clostridioides difficile entmateriaal. Laad een gekalibreerde microinjectienaald met de injectieoplossing met behulp van een Microloader.Monteer de geladen naald in een micromanipulator en plaats deze onder een stereomicroscoop. Pas de injectiedruk aan tussen 600 en 900 hectopascals. Stel de injectietijd in op 0,1 op 0,3 seconden om 0,5 tot 1,0 nanoliter te verkrijgen.Plaats de naald in de micromanipulator in een hoek van ongeveer 45 graden, wijzend naar de ingebedde larven. Plaats de naaldpunt boven het maag-darmkanaal, dicht bij de urogenitale porie. Doorboor door de agarose, dan is de spier met de naald tip.Steek het vervolgens in het darmlumen en injecteer 0,5 tot 1,0 nanoliter clostridioides difficile. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de geïnjecteerde larven te monitoren en gebruik een flexibele microloadertip om de goed geïnjecteerde larven op te pikken voor confocale beeldvorming. In een 1,5%agarose plaat met groeven, plaats een daling van 0,8%laag smeltende agarose op de zebravis larven te dekken.Stel de larven voorzichtig aan met koppen rechtop gericht onder hoeken van 45 graden in de groef en staarten tegen de wand van de groef. Bedien de naald voorzichtig door de agarose, vervolgens in de mond van zebravislarven, door de slokdarm. Zodra de punt van de naald is in de voorste darmlamp, druk op de injectie pedaal om 0,5 release tot een nanoliter van bacteriën cultuur.Vul het lumen van de darm. Laat het niet overlopen van de slokdarm of cloaca. Trek voorzichtig de naald uit de mond van de zebravis.Na gavage, red de geïnfecteerde zebravislarven uit de agarose met een flexibele Microloader-tip door eerst de agarose weg te snijden, dan door de larven op te tillen. Breng deze larven over in het medium van 30% Danieau en spoel twee keer af. Voeg na het verdoven van de zebravissenlarven 200 tot 300 microliters van 1%laag smeltende agarose toe om de verdoofde larven te bedekken.Plaats het besmette gebied van de larven zo dicht mogelijk tegen een glazen glijbaan. Laat de agarose stollen op ijs voor 30 tot 60 seconden. Dompel de agarose onder in 30%Danieau's medium met 0,02% tot 0,04%tricaine.Ga over tot het beeld van de larven met een confocale laser scanning microscoop. Na het euthanaseren van de geïnfecteerde zebravislarven, steek een naald in de rugstam van zebravislarven dicht bij het hoofd om de zebravis te immobiliseren. Verwijder het hoofd achter de kieuwen met een lancet.Steek een tweede naald in het midden van de rugboomstam. Steek een derde naald in de buik van de zebravis, en trek de darm uit de lichaamsholte. Gebruik een microinjectienaald om 10 tot 15 darmen over te brengen in een buis van 1,5 milliliter met 200 microliter steriele 1X PBS.Homogeniseer de darmen met een stamper om het weefsel te verstoren en homogenaten voor te bereiden. Zorg ervoor dat de stamper de bodem van de buis bereikt om alle darmen volledig te verstoren. Voeg in de homogenaten Clostridioides difficile opfokmedium toe dat D-cycloserine en cefoxitine bevat, met of zonder taurocholaat, en incubeer in een anaerobe kamer.In deze studie bereiken zowel neutrofielen als macrofagen de infectielocaties. Het voorbeeld van een geactiveerde macrofaag fagocytizing twee bacteriën toont de clearing door fagocytose en de spijsvertering van de gelabelde Clostridioides difficile. De microgavage om fluorescentie-gelabelde Clostridioides difficile leveren in het darmlumen van macrofaag en neutrofiele reporter lijnen op vijf dagen na de bevruchting bootst het natuurlijke pad van Clostridioides difficile infectie.Echter, neutrofielen en macrofagen niet duidelijk migratie naar het maag-darmkanaal voor maximaal 12 uur na microgavage. In de tussentijd, fluorescentie van de gelabelde Clostridioides difficile verdwenen na ongeveer vijf uur post-microgavage. Darmmonsters 24 uur na infectie werden ontleed en toonden bacteriële groei.Er groeiden geen bacteriën in de controlegroep. Op latere punten groeiden geïncubeerde monsters alleen in het medium met TCA, wat suggereert dat de totale Clostridioides difficile in de darm sporen had gevormd. 16S rDNA PCR identificeerde de gekweekte bacterie als Clostridioides difficile, die specifieke PCR amplicons van voorspelbare grootte rond 800 basisparen produceren.De culturen die van de bacteriën op een CHROMIDplaat worden gekweekt verschenen als typische zwarte kolonies, die verder wezen erop dat de bacteriën van de zebravisd darmen Clostridioides difficile waren. Werken met anaërobe bacteriën vereist dat de aërobe stappen kort worden gehouden, want dat beïnvloedt de biologie van de bacteriën natuurlijk. Aangeboren immuuncel in zebravissen kan worden gemanipuleerd.Ze kunnen bijvoorbeeld het mechanisme van de aangeboren immuuncelreacties op de infectie ontcijferen. Onze methode gaf aan dat zebravissen een hulpmiddel kunnen zijn om anaerobe pathogene uit menselijke darmen te bestuderen. Het werken met multiresistente ziekteverwekkers vereist dat passende veiligheidsmaatregelen worden genomen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo&#39;s

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...