Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

אנו אסירי תודה לטימו פריטש. לטיפול מעולה בחיות אנו מודים לחברי מעבדות הקוסטר והסטירטי לתמיכה ולדיונים מועילים. אנו מודים לד ר דנדאן האן על כך. שקריטי לקרוא את כתב היד אנו מודים בהכרת תודה על ידי המדינה הפדרלית של סקסוניה התחתונה, נינידזצ ווראב (VWZN2889).

כל העבודה בעלי חיים המתואר כאן בוצעה בהתאם לתקנות משפטיות (EU-הוראה 2010/63, רישיון AZ 325.1.53/56.1-אמבטיות ורישיון AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. הכנת ההיתוך נמוך, צלחת ג'ל, ו מיקרוהזרקה/Microgavage מחטים
<ol><li>התמוססות 0.08 גרם של התכה נמוכה (טבלת חומרים, Agarose A2576) ב-10 mL של 30% בינוני של Danieau (0.12 Mm MgSO4...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile.">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li><li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance.">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li><li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain,+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078.">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li><li>P&#233;pin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea:+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec.">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li><li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

השיטות המוצגות לשנות ולהרחיב גישה קיימת כדי להדביק את הזחלים דג זברה על ידי ביצוע שתי הזרקה ו microgavage10,14. זה גם מדגים גישה לחקור פתוגנים אנאירובית עם הזחלים דג זברה22. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ניתוח של תגובות תא החיסון הטבוע בvivo על CDI ועל הקולוניזציה...

ג. הקושי הוא גרם-חיובי, נבג-יוצר, אנאירובי, ו-הרעלן מייצר באקלוס כי הוא הגורם המוביל של זיהומים חמורים במערכת העיכול1. תסמינים טיפוסיים של cdi כוללים שלשול, כאבי בטן, קוליטיס הפסבדו מכרעת, וזה יכול לפעמים להוביל למוות1,2. ראיות הראו כי מארח התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי הן התקדמות ותוצאה של מחלה זו3. בנוסף לתגובה החיסונית, מיקרוביוטה הבטן הילידית היא חיונית לתחילתה ופתוגנזה של CDI4. בעשור האחרון, הן מספר המקרים ואת שיעור התמותה של cdi גדלו באופן משמעותי בשל הופעתה של זן היפרשני של C. הקושי (BI/NAP1/027)5,6. הבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון הבסיסיים ואת התפקיד של microbiota במהלך CDI יסייע להוביל התפתחויות טיפוליות חדשות והתקדמות, המאפשר שליטה טובה יותר של מגיפה זו.
כמה מודלים בעלי חיים, כגון אוגר ועכבר, פותחו כדי לספק תובנה ההגנה החיסונית נגד C. הקושי7,8. עם זאת, התפקיד של תאים חיסוניים מולדים עדיין מובנת בצורה גרועה, במיוחד מאז התנהגות מולדת התא החיסונית נגזרת בעיקר מניתוח היסטולוגית או מתאים בתרבית מבחנה. לכן, הקמת מודל שקוף דג זברה כדי לחשוף את התגובה החיסונית מולדת C. הקושי בתוך האורגניזם בעלי חוליות חיים יקל על מחקרים כאלה. הזחלים zebrafish יש מערכת חיסונית תפקודית מולדת, אבל הם חסרים את המערכת החיסונית אדפטיבית עד 4 – 6 שבועות לאחר הפריה9. תכונה ייחודית זו עושה הזחלים דג זברה מודל מעולה ללמוד את התגובה המבודדת ותפקוד של תאים חיסוניים מולדים ב-cdi.
דו ח זה מתאר שיטות חדשות באמצעות הזחלים דג זברה ללמוד את האינטראקציות בין C. הקושי ואת התאים החיסוניים הטבועה, כגון מקרופאגים ו נויטרופילים. תחילה, מוצג פרוטוקול מיקרוהזרקת מקומי הכולל C. הקשיים וההכתמים. שימוש vivo קונפוקלית וקד זמן לשגות הדמיה, התגובה של נויטרופילים ו מקרופאגים לקראת האתר זיהום מוקלט, ואת phagocyציטוזה של חיידקים על ידי נויטרופילים מקרופאגים הוא נצפתה. עם זאת, דווח כי ההזרקה עצמה גורמת נזק לרקמות מוביל גיוס של לוקיציטים עצמאית של חיידקים10. לכן, פרוטוקול microgavage לא פולשני לספק C. הקושי לתוך המעיים של הזחלים דג זברה מתואר לאחר מכן. מחקרים קודמים הוכיחו כי מיקרוביוטה מערכת העיכול הילידים להגן על מארח נגד הקולוניזציה של C. הקושי11. לכן, הזחלים גנוטוביוטיים משמשים גם כדי להיפטר הדגים הנגועים 12. לאחר מכן, ניתוח מעיים מבוצע כדי לשחזר את קיימא C. הקושי ולאמת את משך הנוכחות שלהם בתוך מעיים של דגים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides קושי זיהום (cdi) נחשב לאחד מזיהומים במערכת העיכול הנפוצים ביותר הקשורים לבריאות בארצות הברית. התגובה החיסונית מולדת נגד הקושי המתואר כבר תוארה, אבל התפקידים המדויקים של נויטרופילים ו מקרופאגים ב-cdi הם פחות מובנים. במחקר הנוכחי, הזחלים danio rerio (zebrafish) משמשים כדי להקים C. בקושי מודל זיהום לדימות התנהגות ושיתוף פעולה של תאים אלה מולדים החיסונית ב vivo. כדי לפקח על C. הקושי, פרוטוקול תיוג באמצעות צבע פלורסנט הוקמה. זיהום המותאם לשפות אחרות מושגת על ידי מיקרוהזרקת מתויג C. הקשיים, אשר באופן פעיל גדל במערכת העיכול דג זברה ומחקה את הנזק האפיתל המעי cdi. עם זאת, פרוטוקול זה זיהום ישיר הוא פולשני וגורם פצעים מיקרוסקופיים, אשר יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוני. מכאן, פרוטוקול microgavage שאינו פולשני יותר מתואר כאן. השיטה כרוכה במסירה של C. הקושי תאים ישירות לתוך המעיים של הזחלים דג זברה ידי צנרור דרך הפה הפתוח. זו שיטת הדלקת מחקה היטב את תוואי זיהום טבעי של C. הקושי.

ג. הקושי הוא אנאירובית לחלוטין, אבל כרומופור של חלבונים פלורסנט בדרך כלל דורש חמצן להבשיל. כדי להתגבר על בעיה זו, צבע פלורסנט שימש כדי להכתים לחיות C. הקשיים תאים שהיו באופן פעיל גדל (R20291, הריבוסוג 027 זן; איור 1א). באמצעות מערכת Gal4/UAS, שורות הטרנסגניים יציבה שנ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

מוצג כאן הוא שיטה יעילה ובטוחה כדי להדביק הזחלים דג זברה עם התווית fluorescently באופן אנאירובי C. הקושי על ידי הזרקת microinjection ו פולשני.

פיתוח מודל לזיהום של זחל בדג במשך שינוי קושי

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלת המפתח על התפקיד של מערכת החיסון המולדת בזיהום Clostridium, כמו אם וכיצד מקרופאגים לזהות או phagocytose פתוגן זה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על חיידקים אנאירוביים רבים ושונים, כי זמן הזיהום יכול להיות מניפולציה, כי הממשל אוראלי מייצג את הזיהום האנושי נורמלי הרבה יותר קרוב. לאחר culturing, להעביר מיליליטר אחד של התרבות לתוך cuvette ספקטרופוטומטר, ולמדוד את OD600.העבר את הסכום הנדרש לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר על מנת להגיע OD הסופי של אחד ל 1.2 במיליליטר אחד של נפח סופי. לשטוף פעם אחת עם מיליליטר אחד של 1X PBS, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. תן שימוש חוזר במיליליטר אחד של 1X PBS.הוסף שלושה microliters של פתרון עבודה של צבע פלואורסצנטי מוכן לתוך ההשעיה חיידקית מיליליטר אחד. הדגירה את המדגם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את Clostridioides מוכתם difficile פעם אחת עם 1X PBS כדי להסיר צבע שיורית, ולתלות במיליליטר אחד של 1X PBS כדי להשיג OD600 של 1.0.ראשית, מניחים ירידה של 0.8% בהמסה נמוכה על הזחלים של דגי הזברה בצלחת פטרי לכיסוי. כוונן בעדינות את הזחלים למיקום אוריגלי. מניחים את צלחת פטרי על קרח במשך 30 עד 60 שניות כדי לאפשר אגרוז נמס נמוך להתגבש.הוסיפו 30%-30% מהמדיום של דניאו המכיל 0.02%-0.04% טריקאין לכיסוי ההתעוררות. להכנת פתרון הזרקה, הוסיפו מיקרוליטר אחד של 0.5% פנול אדום בתתכונת PBS לתשעה מיקרוליטרים של קולוקולום קלוסטרידיואידים מוכתמים בצבע. לטעון מחט microinjection מכויל עם פתרון ההזרקה באמצעות Microloader.הר את המחט הטעונה לתוך מיקרומניפולטור, והצב אותה תחת מיקרוסקופ סטריאו. התאימו את לחץ ההזרקה בין 600 ל-900 hectopascals. קבע את זמן ההזרקה ל-0.1 עד 0.3 שניות כדי להשיג 0.5 עד 1.0 ננוליטר.מניחים את המחט במיקרומניפולטור בזווית של כ-45 מעלות, ומצביעים לכיוון הזחלים המוטבעים. מניחים את קצה המחט מעל מערכת העיכול, קרוב לנקבובית urogenital. פירס דרך התעוררות, אז השריר עם קצה המחט.ואז להכניס אותו לתוך לומן המעי, ולהזריק 0.5 כדי 1.0 nanoliters של Clostridioides difficile. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על הזחלים המוזרקים, ולהשתמש בקצה Microloader גמיש כדי לקלוט את הזחלים מוזרק כראוי עבור הדמיה קונפוקל. בצלחת אגרוז 1.5% עם חריצים, מניחים ירידה של 0.8% בהמסה נמוכה על זחלי הזברה כדי לכסות.כוונן בעדינות את הזחלים עם ראשים הפונים זקוף בזוויות של 45 מעלות החריץ והזנבות על קיר החריץ. בעדינות להפעיל את המחט דרך האגרוז, ולאחר מכן לתוך הפה של זחלים זברה, דרך הוושט. לאחר קצה המחט הוא בתוך הנורה במעיים לפני, לחץ על דוושת ההזרקה כדי לשחרר 0.5 כדי nanoliters אחד של תרבות החיידקים.מלא את לומן המעי. אל תיתן לו לגלוש מן הוושט או cloaca. מוציאים בעדינות את המחט מפי דג הזברה.לאחר gavage, להציל את הזחלים הזברה נגוע מן agarose עם קצה Microloader גמיש על ידי תחילה חיתוך אגרוז משם, ולאחר מכן על ידי הרמת הזחלים. מעבירים את הזחלים האלה למדיום סטרילי של דניו 30%, ושטיפת פעמיים. לאחר הרדמה של זחלי הזברה, הוסיפו 200 עד 300 מיקרוליטרים של אגרוז נמס נמוך של 1% כדי לכסות את הזחלים שעברו הרדמה.מניחים את האזור הנגוע של הזחלים על מגלשת זכוכית קרוב ככל האפשר. תן לתעורר להתגבש על קרח למשך 30 עד 60 שניות. טביעה עלתה למדיום של דניו עם 0.02%-0.04%.המשך לדמיין את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל. לאחר המתת זחלי הזברה הנגועים, הכנס מחט לתא המטען הגבי של זחלי זברה קרוב לראש כדי לשתק את דג הזברה. הסר את הראש מאחורי הזימים עם רומח.הכנס מחט שנייה לאמצע תא המטען הגבי. הכנס מחט שלישית לתוך הבטן של דג הזברה, ולמשוך את המעי מתוך חלל הגוף. השתמש מחט microinjection להעביר 10 עד 15 מעיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 200 microliters של PBS 1X סטרילי.הומוגניזציה של המעיים עם עלה כדי לשבש את הרקמה ולהכין הומוגניטים. ודא העלי מגיע לתחתית הצינור כדי לשבש את כל המעיים לחלוטין. לתוך homogenates, להוסיף Clostridioides דיפיסיל גידול בינוני המכיל D-ציקלוזרין ו cefoxitin, עם או בלי taurocholate, ודגירה בתא אנאירובי.במחקר זה, הן נויטרופילים והן מקרופאגים מגיעים לאתרי ההדבקה. הדוגמה של מקרופאג פעיל phagocytizing שני חיידקים מראה את ניקוי על ידי phagocytosis ועיכול של קלוסטרידיואידים שכותרתו difficile. המיקרו-גוויאז' כדי לספק Clostridioides שכותרתו פלואורסצנטיות difficile לתוך לומן המעי של שורות כתב מקרופאג ונויטרופילים בחמישה ימים לאחר ההפריה מחקה את הנתיב הטבעי של זיהום Difficile Clostridioides.עם זאת, נויטרופילים ומאקרופאגים לא הראה הגירה ברורה למערכת העיכול עד 12 שעות לאחר microgavage. בינתיים, פלואורסצנטיות של Difficile Clostridioides שכותרתו נעלם לאחר כחמש שעות לאחר microgavage. דגימות מעיים 24 שעות לאחר ההדבקה נותפו והראו צמיחה חיידקית.לא גדלו חיידקים בקבוצת הביקורת. בנקודות זמן מאוחרות יותר, דגימות דגירה רק גדל במדיום המכיל TCA, מה שמרמז כי סך Clostridioides difficile במעיים יצרו נבגים. 16S rDNA PCR זיהה את החיידק גדל כמו Clostridioides difficile, אשר מייצרים אמפיקנים PCR ספציפי בגודל צפוי סביב 800 זוגות בסיס.תרבות חיידקים שגדלו על צלחת כרומיד הופיעו כמושבות שחורות טיפוסיות, מה שהצביע עוד יותר על כך שחיידקים ממעי הזברה היו קלוסטרואידים שונים. עבודה עם חיידקים אנאירוביים דורשת כי הצעדים האירוביים נשמרים קצרים כי זה משפיע על הביולוגיה של החיידקים כמובן. תא חיסוני המולד בזברה-דג יכול להיות מניפולציה.לדוגמה, הם יכולים לפענח את המנגנון של תגובות תאי החיסון המולדים לזיהום. השיטה שלנו הצביעה על כך שזברה-דג יכול להיות כלי לחקר פתוגן אנאירובי ממעי האדם. עבודה עם פתוגנים עמידים רב דורשת שננקטים אמצעי בטיחות מתאימים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

הקלטת Electroretinogram דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה ספוג-טיפ בצורת חרוט הרומן A

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...