Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
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Siamo grati a Timo Fritsch per un'eccellente cura degli animali. Ringraziamo i membri dei laboratori di K'ster e Steinert per il supporto e le discussioni utili. Ringraziamo il dottor Dandan Han per aver letto criticamente il manoscritto. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento dello Stato federale della Bassa Sassonia, Nieders-chsisches Vorab (VW-N2889).

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato svolto in conformità con le normative giuridiche (EU-direttiva 2010/63, licenza A 325.1.53/56.1-TUBS e licenza A 33.9-42502-04-14/1418).
1. Preparazione di agarose a bassa fusione, piastra di gel e aghi microiniezione/Microgavage
<ol><li>Sciogliere 0,08 g di agarose a bassa fusione (Table of Materials, agarose A2576) in 10 mL del 30% medio di Danieau (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,2...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. 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M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

I metodi presentati modificano ed estendono un approccio esistente per infettare le larve di pesce zebra eseguendo sia iniezione che microgavage10,14. Dimostra anche un approccio per studiare gli agenti patogeni anaerobici con le larve di pesce zebra22. Inoltre, il protocollo facilita l'analisi delle risposte delle cellule immunitarie innate in vivo su CDI e sulla colonizzazione di C. difficile nel pesce zebra. Il metodo è riprod...

C. difficile è un bacillo gram-positivo, spore-forming, anaerobico, e tossina che produce la tossina che è la causa principale di gravi infezioni nel tratto gastrointestinale1. I sintomi tipici della CDI includono diarrea, dolore addominale e colite pseudomembranosa fatale, e a volte può portare alla morte1,2. Le prove hanno dimostrato che le risposte immunitarie dell'ospite svolgono un ruolo fondamentale sia nella progressione che nell'esito di questa malattia3. Oltre alla risposta immunitaria, il microbiota intestinale indigeno è fondamentale per l'insorgenza e la patogenesi del CDI4. Nell'ultimo decennio, sia il numero di casi che il tasso di mortalità di CDI sono aumentati in modo significativo a causa dell'emergere di un ceppo ipervirulento di C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una migliore comprensione dei meccanismi immunitari sottostanti e del ruolo del microbiota durante il CDI contribuirà a portare a nuovi sviluppi e progressi terapeutici, consentendo un migliore controllo di questa epidemia.
Diversi modelli animali, come il criceto e il topo, sono stati sviluppati per fornire informazioni sulla difesa immunitaria contro C. difficile7,8. Tuttavia, il ruolo delle cellule immunitarie innate è ancora poco compreso, soprattutto perché il comportamento delle cellule immunitarie innate è derivato principalmente dall'analisi istologica o dalle cellule coltivate in vitro. Pertanto, stabilire un modello trasparente di pesce zebra per rivelare la risposta immunitaria innata a C. difficile all'interno di un organismo vertebrato vivente faciliterà tali studi. Le larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato funzionale, ma non hanno il sistema immunitario adattivo fino alle 4-6 settimane dopo la fecondazione9. Questa caratteristica unica rende le larve di pesce zebra un modello eccellente per studiare la risposta isolata e la funzione delle cellule immunitarie innate in CDI.
Questo rapporto descrive nuovi metodi che utilizzano larve di pesce zebra per studiare le interazioni tra C. difficile e cellule immunitarie innate, come macrofagi e neutrofili. In primo luogo, viene presentato un protocollo di microiniezione localizzato che include C. difficile inoculum e colorazione. Utilizzando l'imaging confocaltime in vivo, si registra la risposta dei neutrofili e dei macrofagi verso il sito di infezione e si osserva la fagocitosi dei batteri da neutrofili e macrofagi. Tuttavia, è stato riferito che l'iniezione stessa provoca danni ai tessuti e porta al reclutamento di leucociti indipendentemente dai batteri10. Pertanto, viene descritto successivamente un protocollo di microgavage non invasivo per fornire C. difficile nell'intestino delle larve di pesce zebra. Studi precedenti hanno dimostrato che il microbiota gastrointestinale indigeno protegge un ospite dalla colonizzazione di C. difficile11. Pertanto, le larve di pesce zebra gnotobiotiche sono utilizzate anche per predisporre il pesce zebra che sono infettati 12. Successivamente, viene eseguita la dissezione intestinale per recuperare C. difficile praticabile e convalidare la durata della loro presenza nei tratti intestinali del pesce zebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides difficile infezione (CDI) è considerato una delle infezioni gastrointestinali più comuni associate all'assistenza sanitaria negli Stati Uniti. È stata descritta la risposta immunitaria innata contro C. difficile, ma i ruoli esatti dei neutrofili e dei macrofagi nel CDI sono meno compresi. Nello studio attuale, le larve di Danio rerio (pesce zebra) vengono utilizzate per stabilire un modello di infezione da C. difficile per l'imaging del comportamento e della cooperazione di queste cellule immunitarie innate in vivo. Per monitorare C. difficile, è stato stabilito un protocollo di etichettatura utilizzando un tintura fluorescente. Un'infezione localizzata è ottenuta microiniettando etichettato C. difficile, che cresce attivamente nel tratto intestinale del pesce zebra e imita il danno epiteliale intestinale in CDI. Tuttavia, questo protocollo di infezione diretta è invasivo e provoca ferite microscopiche, che possono influenzare i risultati sperimentali. Di conseguenza, un protocollo di microgavazione più non invasivo è descritto qui. Il metodo prevede la consegna di cellule C. difficile direttamente nell'intestino delle larve di pesce zebra per intubazione attraverso la bocca aperta. Questo metodo di infezione imita da vicino il percorso di infezione naturale di C. difficile.

C. difficile è strettamente anaerobica, ma il cromoforo delle proteine fluorescenti di solito richiede ossigeno per maturare. Per ovviare a questo problema, è stato utilizzato un coloranti fluorescente per macchiare le cellule C. difficile vive che stavano attivamente crescendo (R20291, un ceppo di ribotype 027; Figura 1A). Utilizzando il sistema Gal4/UAS, sono state generate linee di pesce zebra transgenici stabili per l'imaging dal vivo, in cui i promot...

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Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presentato qui è un metodo sicuro ed efficace per infettare le larve di pesce zebra con C. difficile anaerobica etichettato fluorescentmente per microiniezione e microgavage non invasivo.

Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Questo metodo può rispondere alla domanda chiave sul ruolo del sistema immunitario innato nell'infezione da Clostridium, come se e come i macrofagi riconoscono o fagocitosi questo agente patogeno. Il vantaggio principale di questo metodo è che può essere applicato a molti batteri anaerobici diversi, che il tempo di infezione può essere manipolato e che la somministrazione orale rappresenta la normale infezione umana molto più vicina. Dopo la coltivazione, trasferire un millilitro della coltura in una cuvetta spettrofotometrica e misurare l'OD600.Trasferire la quantità richiesta in un tubo fresco da 1,5 millilitri per raggiungere un OD finale da uno a 1,2 in un millilitro di volume finale. Lavare una volta con un millilitro di 1X PBS e centrifugare a 5.000 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Resuspend in un millilitro di 1X PBS.Aggiungere tre microlitri di soluzione di lavoro del colorante fluorescente preparato nella sospensione batterica da un millilitro. Incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, lavare i Clostridioidi difficili macchiati una volta con 1X PBS per rimuovere il colorante residuo e rimorsi in un millilitro di 1X PBS per ottenere un OD600 di 1,0.Per prima cosa, posiziona una goccia di agarosio a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di zebrafish in una piastra di Petri da coprire. Regolare delicatamente le larve in posizione laterale. Posizionare la piastra di Petri sul ghiaccio per 30-60 secondi per consentire all'agarosio a bassa fusione di solidificarsi.Aggiungere il supporto del 30%Danieau contenente da 0,02% a 0,04%tricaina per coprire l'agarosio. Per preparare la soluzione di iniezione, aggiungere un microlitro dello 0,5% rosso fenolo in soluzione PBS in nove microlitri dei Clostridioides difficile inoculum macchiati di colorante. Caricare un ago di microiniezione calibrato con la soluzione di iniezione utilizzando un microloader.Montare l'ago caricato in un micromanipolatore e posizionarlo al microscopio stereo. Regolare la pressione di iniezione tra 600 e 900 ettopascal. Impostare il tempo di iniezione su 0,1 a 0,3 secondi per ottenere da 0,5 a 1,0 nanolitri.Impostare l'ago nel micromanipolatore con un angolo di circa 45 gradi, puntando verso le larve incorporate. Posizionare la punta dell'ago sopra il tratto gastrointestinale, vicino al poro urogenitale. Perforare l'agarosio, quindi il muscolo con la punta dell'ago.Quindi inserirlo nel lume intestinale e iniettare da 0,5 a 1,0 nanolitri di Clostridioides difficile. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare le larve iniettate e utilizzare una punta flessibile del microloader per raccogliere le larve correttamente iniettate per l'imaging confocale. In una piastra di agarosio all'1,5% con scanalature, posizionare una goccia di agarosio a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di zebrafish da coprire.Regolare delicatamente le larve con la testa rivolta verso l'alto ad angoli di 45 gradi nella scanalatura e nelle code contro la parete della scanalatura. Aziona delicatamente l'ago attraverso l'agarosio, quindi nella bocca delle larve di zebrafish, attraverso l'esofago. Una volta che la punta dell'ago si trova all'interno del bulbo intestinale anteriore, premere il pedale di iniezione per rilasciare da 0,5 a un nanolitri di coltura batterica.Riempire il lume dell'intestino. Non lasciare che trabocca dall'esofago o dalla cloaca. Ritirare delicatamente l'ago dalla bocca del pesce zebra.Dopo il gavage, salva le larve di zebrafish infette dall'agarosio con una punta flessibile del Microloader tagliando prima l'agarosio, quindi sollevando le larve. Trasferire queste larve nel mezzo sterile del 30% danieau e risciacquare due volte. Dopo aver anestetizzato le larve di zebrafish, aggiungere da 200 a 300 microlitri di agarosio a bassa fusione dell'1% per coprire le larve anestetizzate.Posizionare la regione infetta delle larve contro uno scivolo di vetro il più vicino possibile. Lasciare solidificare l'agarosio sul ghiaccio per 30-60 secondi. Immergere l'agarosio nel mezzo del 30%Danieau contenente da 0,02% a 0,04%tricaina.Procedi a imageare le larve con un microscopio a scansione laser confocale. Dopo aver eutanasiato le larve di zebrafish infette, inserire un ago nel tronco dorsale delle larve di zebrafish vicino alla testa per immobilizzare il pesce zebra. Rimuovere la testa dietro le branchie con una lancetta.Inserire un secondo ago al centro del tronco dorsale. Inserire un terzo ago nell'addome del pesce zebra e estrarre l'intestino dalla cavità corporea. Utilizzare un ago di microiniezione per trasferire da 10 a 15 intestini in un tubo da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di PBS sterile 1X.Omogeneizzare l'intestino con un pestello per interrompere il tessuto e preparare gli omogeneati. Assicurarsi che il pestello raggiunga il fondo del tubo per interrompere completamente tutto l'intestino. Negli omogeneati aggiungere clostridioidi difficile mezzo di allevamento contenente D-cicloscloserina e cefoxitina, con o senza taurocholato, e incubare in una camera anaerobica.In questo studio, sia i neutrofili che i macrofagi raggiungono i siti di infezione. L'esempio di un macrofago attivato che fagocitizzare due batteri mostra la compensazione per fagocitosi e digestione dei Clostridioidi difficili etichettati. Il microgavage per fornire clostridioidi difficili con etichetta fluorescenza nel lume intestinale delle linee di macrofagi e neutrofili reporter a cinque giorni dopo la fecondazione imita il percorso naturale dell'infezione da Clostridioides difficile.Tuttavia, neutrofili e macrofagi non hanno mostrato un'evidente migrazione al tratto gastrointestinale fino a 12 ore dopo il microgavage. Nel frattempo, la fluorescenza dei Clostridioidi difficile etichettati è scomparsa dopo circa cinque ore dopo il microgavage. Campioni intestinali 24 ore dopo l'infezione sono stati sezionati e hanno mostrato una crescita batterica.Nessun batterio è cresciuto nel gruppo di controllo. In tempi successivi, i campioni incubati crebbero solo nel mezzo contenente TCA, suggerendo che i clostridioidi difficili totali nell'intestino avevano formato spore. 16S rDNA PCR ha identificato il batterio coltivato come Clostridioides difficile, che produce ampliconi PCR specifici di dimensioni prevedibili intorno a 800 coppie di basi.Le colture batteriche coltivate su una piastra CHROMID apparivano come tipiche colonie nere, il che indicava inoltre che i batteri dell'intestino zebrafish erano Clostridioides difficile. Lavorare con i batteri anaerobici richiede che i passaggi aerobici siano mantenuti brevi perché ciò influenza la biologia dei batteri ovviamente. La cellula immunitaria innata nei pesci zebra può essere manipolata.Ad esempio, possono decifrare il meccanismo delle risposte innate delle cellule immunitarie all'infezione. Il nostro metodo ha indicato che il pesce zebra può essere uno strumento per studiare l'agente patogeno anaerobico dall'intestino umano. Lavorare con agenti patogeni multiresiste richiede l'adozione di adeguate misure di sicurezza.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...