Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
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私たちは、優れた動物のケアのためにティモフリッチに感謝しています。私たちは、Kösterとシュタイナートの研究室のメンバーがサポートと有益な議論に感謝します。原稿を批判的に読んでくださったダンダン・ハン博士に感謝します。我々は、ニーダーザクセン州ニーダーザクセン州、ニーデルザクシッシェス・ヴォラブ(VWZN2889)による資金提供に感謝します。

ここで説明したすべての動物の作業は、法的規制に従って行われました(EU指令2010/63、ライセンスAZ 325.1.53/56.1-TUBS、ライセンスAZ 33.9-42502-04-14/1418)。
1. 低融解アガロース、ゲルプレート、マイクロインジェクション/マイクロガバジ針の調製
<ol><li>0.08 gの低融解アガロース(材料表、アガロースA2576)を30%ダニオー培地(0.12 mM MgSO 4,0.18 mM Ca [NO3]2)の1...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. 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M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

提示された方法は、注射およびマイクロガベージ10、14の両方を行うことによってゼブラフィッシュ幼虫に感染する既存のアプローチを改変および拡張する。また、ゼブラフィッシュ幼虫22で嫌気性病原体を研究するアプローチを示しています。さらに、このプロトコルは、CDIおよびゼブラフィッシュにおけるC.ディフィシル...

C.ディフィシルは、グラム陽性、胞子形成、嫌気性、および胃腸管1における重篤な感染症の主な原因である毒素産生菌である。CDIの典型的な症状は、下痢、腹痛、および致命的な偽膜性大腸炎を含み、死に至ることがある1,2.証拠は、ホスト免疫応答がこの疾患の進行と結果の両方で重要な役割を果たしていることを示しています3.免疫応答に加えて、 CDI4の発症および病因のためには、固有の腸内微生物叢が重要である。過去10年間で、C.ディフィシル(BI/NAP1/027)5、6の超低温株の出現により、CDIの症例数と死亡率の両方が有意に増加した。CDI中の基礎となる免疫メカニズムと微生物叢の役割をよりよく理解することは、新しい治療の発展と進歩につながり、この流行のより良い制御を可能にします。
ハムスターやマウスなどのいくつかの動物モデルは、C.ディフィシル7、8に対する免疫防御への洞察を提供するために開発されています。しかし、自然免疫細胞の役割は、特に自然免疫細胞の挙動が主に組織学的分析または培養細胞に由来するので、まだまだ十分に理解されていない。従って、生きている脊椎動物の内部のC.ディフィシルに対する自然免疫応答を明らかにする透明ゼブラフィッシュモデルを確立することは、そのような研究を促進する。ゼブラフィッシュ幼虫は機能的な自然免疫系を有するが、受精後4〜6週間まで適応免疫系を欠いている 9 .このユニークな特徴により、ゼブラフィッシュ幼虫はCDIの自然免疫細胞の単離された応答と機能を研究するための優れたモデルになります。
このレポートでは、ゼブラフィッシュ幼虫を用いて、マクロファージや好中球などのC.ディフィシル細胞と自然免疫細胞との相互作用を研究する新しい方法について説明します。まず、C.ディフィシル接種と染色を含む局在マイクロインジェクションプロトコルが提示される。in vivo共焦点タイムラプスイメージングを用いて、感染部位に対する好中球およびマクロファージの応答が記録され、好中球およびマクロファージによる細菌の貪食が観察される。しかし、注射自体が組織損傷を引き起こし、細菌10とは無関係に白血球の募集につながることが報告されている。したがって、ゼブラフィッシュ幼虫の腸内にC.ディフィシルを送達する非侵襲的なマイクロガベージプロトコルが続いて記載されている。これまでの研究では、先住民族の胃腸微生物叢がC.ディフィシル11の植民地化に対して宿主を保護することが実証されている。したがって、グノトビオティックゼブラフィッシュ幼虫はまた、感染しているゼブラフィッシュを素因にするために使用される12。その後、腸切除術が行われ、生存可能なC.ディフィシルを回復し、ゼブラフィッシュ腸管内での存在期間を検証する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

クロストリジオイド・ディフィシル感染(CDI)は、米国で最も一般的な医療関連胃腸感染症の1つと考えられている。C.ディフィシルに対する自然免疫応答は説明されているが、CDIにおける好中球およびマクロファージの正確な役割はあまり理解されていない。現在の研究では、Danio rerio(ゼブラフィッシュ)幼虫は、生体内でこれらの自然免疫細胞の行動と協力をイメージングするためのC.ディフィシル感染モデルを確立するために使用されています。C.ディフィシルを監視するために、蛍光色素を用いた標識プロトコルが確立されている。局在感染は、ゼブラフィッシュ腸管内で活発に増殖し、CDIの腸上皮損傷を模倣するC.ディフィシルとラベル付けされたマイクロインジェクトによって達成される。しかし、この直接感染プロトコルは侵襲的であり、顕微鏡的創傷を引き起こし、実験結果に影響を与える可能性がある。したがって、より非侵襲的なマイクロガブジプロトコルがここで説明される。この方法は、開口を通して挿管することによってゼブラフィッシュ幼虫の腸に直接C.ディフィシル細胞を送達することを含む。この感染方法は、C.ディフィシルの自然感染経路を密接に模倣する。

C.ディフィシルは厳密に嫌気性であるが、蛍光タンパク質の発クロモフォアは通常、成熟するために酸素を必要とする。この問題を克服するために、蛍光色素を使用して、活発に増殖していたC.ディフィシル細胞を染色した(リボタイプ027株のR20291;図 1A)。Gal4/UASシステムを使用して、mpeg1.1またはlyZプロモーターがマクロファージお?...

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Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

ここで提示された、ゼブラフィッシュ幼虫を蛍光標識された嫌気性C.ディフィシルでマイクロインジェクションおよび非侵襲的なマイクロガベージによって感染させる安全で効果的な方法です。

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

この方法は、マクロファージがこの病原体を認識または貪食する場合や食作用方法など、クロストリジウム感染における自然免疫系の役割に関する重要な質問に答えることができます。この方法の主な利点は、多くの異なる嫌気性細菌に適用できること、感染時間を操作できること、および経口投与が正常なヒト感染をはるかに近く表していることである。培養後、培養液を1ミリリットル分光光度計キュベットに移し、OD600を測定する。最終体積の1ミリリットルで1〜1.2の最終ODに到達するために、必要な量を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。1回1ミリリットルの1回PBSで洗浄し、遠心分離機を5,000倍gで室温で3分間洗浄します。1X PBSの1ミリリットルで再中断します。調製した蛍光染料の3マイクロリットルの作業溶液を1ミリリットルの細菌懸濁液に加える。暗い温度で室温で15分間サンプルをインキュベートします。その後、染色したクロストリダイドを1X PBSで1回洗浄して残留色素を除去し、1ミリリットルの1ミリリットルで再懸濁して1.0のOD600を達成した。まず、ペトリ皿のゼブラフィッシュの幼虫に0.8%低融解アガロースを置いてカバーします。幼虫を横の位置にそっと調整します。ペトリ皿を氷の上に30〜60秒間置き、低融点アガロースを固めます。アガロースを覆うために0.02%から0.04%トリケーヌを含む30%ダニアウの培地を追加します。注射液を調製するには、PBS溶液に0.5%フェノールレッドの1マイクロリットルを、色素染色クロストリジオイドジフィシル接種物の9マイクロリットルに添加します。マイクロローダーを使用して、注射液で校正されたマイクロインジェクションニードルをロードします。装填された針をマイクロマニピュレータに取り付け、ステレオ顕微鏡の下に置きます。600~900ヘクトパスカルの射出圧力を調整します。0.5 ~ 1.0 ナノリットルを得るために、射出時間を 0.1 ~ 0.3 秒に設定します。マイクロマニピュレーターの針を約45度の角度に設定し、埋め込まれた幼虫に向けます。針の先端を胃腸管の上に置き、泌尿生殖毛の近くに置きます。アガロースを突き抜け、次に針先の筋肉を突き刺す。次に腸管腔に挿入し、0.5〜1.0ナノリットルのクロストリダイオイドジフィシルを注入する。蛍光顕微鏡を使用して注入された幼虫を監視し、柔軟なマイクロローダーチップを使用して、適切に注入された幼虫を共焦点イメージングに取り上げる。溝のある1.5%のアガロースプレートに、0.8%の低融解アガロースをゼブラフィッシュの幼虫に滴下して覆います。溝の45度の角度で頭を直立して、溝の壁に尾を向けて幼虫をそっと調整します。アガロースを通して針を穏やかに操作し、ゼブラフィッシュの幼虫の口の中に、食道を通して穏やかに操作します。針の先端が前腸球根の内側に入ったら、注入ペダルを押して0.5~1ナノリットルの細菌培養液を放出します。腸の内腔を満たす。食道やクロアカからあふれないようにしてください。ゼブラフィッシュの口から針をそっと引き出します。ガベージに続いて、感染したゼブラフィッシュの幼虫を、最初にアガロースを切り取り、次に幼虫を持ち上げることによって、柔軟なマイクロローダーチップでアガロースから救出する。これらの幼虫を滅菌30%ダニアウの培地に移し、2回すすいでください。ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔した後、麻酔幼虫を覆うために1%低融解アガロースの200〜300マイクロリットルを加えます。幼虫の感染した領域をガラススライドにできるだけ近づけます。アガロースを氷の上で30〜60秒間固めます。アガロースを0.02%から0.04%トリカインを含む30%ダニアウの培地に沈水する。共焦点レーザー走査顕微鏡で幼虫の画像化に進みます。感染したゼブラフィッシュの幼虫を安楽死させた後、頭に近いゼブラフィッシュ幼虫の後部トランクに針を挿入してゼブラフィッシュを固定化する。ランセットでエラの後ろの頭を取り除きます。2本目の針を後尻の幹の中央に挿入します。ゼブラフィッシュの腹部に3本目の針を挿入し、体腔から腸を引き抜きます。マイクロインジェクションニードルを使用して、10~15個の腸を200マイクロリットルの無菌1X PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。腸を害虫で均質化して組織を破壊し、均質化を準備する。すべての腸を完全に破壊するために、害虫がチューブの底に達することを確認します。ホモジナイトに、D-シクロセリンおよびセフォキシチンを含むクロストリジオイドジフィシレを添加し、タウロコレートの有無にかかわらず、嫌気性チャンバーにインキュベートする。本研究では、好中球とマクロファージの両方が感染部位に到達する。活性化されたマクロファージ食作用の例は、2つの細菌を貪食し、標識されたクロストリジオイドジフィシルの貪食および消化による消量を示す。蛍光標識クロストリダイドをマクロファージおよび好中球レポーターラインの腸内腔に受精後5日間で拡散させるマイクロガビンジは、クロストリダイドジフィシル感染の自然経路を模倣する。しかし、好中球およびマクロファージは、微小藻後12時間まで胃腸管への明らかな移動を示さなかった。その間、標識されたクロストリダイオイドス・ディフィシルの蛍光は、マイクロガビン後約5時間後に消失した。感染後24時間の腸管サンプルを解剖し、細菌の増殖を示した。対照群に細菌は増殖しなかった。後の時点で、インキュベートされたサンプルはTCAを含む培地でのみ成長し、腸内の全クロストリダイオイドジフィシルが胞子を形成していたことを示唆した。16S rDNA PCRは、成長した細菌をクロストリダイオイド・ディフィシルと同定し、約800塩基対の予測可能なサイズの特異的PCRアンプリコンを産生する。CHROMIDプレート上に成長した細菌培養物は典型的な黒コロニーとして現れ、ゼブラフィッシュ腸からの細菌がクロストリダイオイド・ディフィシルであることをさらに示した。嫌気性細菌を扱うには、好気性のステップは、もちろん細菌の生物学に影響を与えるので、短く保たれている必要があります。ゼブラフィッシュの自然免疫細胞を操作することができます。例えば、感染に対する自然免疫細胞応答のメカニズムを解読することができる。我々の方法は、ゼブラフィッシュがヒト腸から嫌気病原体を研究するためのツールであり得ることを示した。多耐性病原体を使用するには、適切な安全対策が必要です。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...