Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
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우리는 훌륭한 동물 관리를 위한 티모 프리치에게 감사드립니다. 우리는 Köster와 Steinert 연구소의 회원들에게 지원과 도움이 되는 토론에 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 한단 박사께 감사드립니다. 우리는 감사하 중 낮은 작센의 연방 국가에 의해 자금 을 인정, 니더샤치쉬 보랍 (VWZN2889).

여기에 설명된 모든 동물 작업은 법적 규정(EU-지침 2010/63, 라이센스 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 및 라이센스 AZ 33.9-42502-04-14/1418)에 따라 수행되었습니다.
1. 저융액 아가로즈, 젤 플레이트 및 미세 주입 /미세 가게이 지 바늘의 준비
<ol><li>용해 0.08 g의 저용융 아가로즈(재료표,아가로즈 A2576) 10 mL의 30% 다니요 배지 (0.12 mM MgSO4,0.18 mM Ca [NO3]2),0.21 mM KCl, 1....

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile.">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li><li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance.">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li><li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain,+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078.">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li><li>P&#233;pin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea:+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec.">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li><li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

제시된 방법은 주사 및 마이크로게이지10,14를모두 수행함으로써 제브라피시 유충을 감염시키기 위한 기존의 접근법을 수정하고 확장한다. 또한 제브라피시 유충22를사용하여 혐기성 병원체를 연구하는 접근법을 입증한다. 또한, 이 프로토콜은 CDI시 및 제브라피시에서 C. 디피실의 식민지화 시 생체 내 선천성 면역 세포 반응의 ...

C. difficile는 그람 양성, 포자 형성, 혐기성 및 위장관에서 의 심한 감염의 주요 원인인 독소 생성 간균1. CDI의 전형적인 현상은 설사, 복부 고통 및 치명적인 pseudomembranous 대장염을 포함하고, 때때로 죽음으로 이끌어 낼 수 있습니다1,2. 증거는 호스트 면역 반응이 이 질병의 진행 그리고 결과 둘 다에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다3. 면역 반응 이외에, 토착 창자 microbiota는 CDI4의개시 그리고 병인을 위해 결정적이다. 지난 10 년 동안, CDI의 케이스의 수와 사망률은 C. difficile (BI/NAP1/027)의 hypervirulent 긴장의 출현 때문에 현저하게 증가했습니다5,6. 근본적인 면역 기계장치의 더 나은 이해 및 CDI 도중 microbiota의 역할은 이 전염병의 더 나은 통제를 가능하게 하는 새로운 치료 발달 및 어드밴스로 이끌어 낼 것입니다.
햄스터 및 마우스와 같은 몇몇 동물 모델은 C. difficile7,8에대하여 면역 방어에 대한 통찰력을 제공하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 선천성 면역 세포의 역할은 여전히 제대로 이해되지 못하며, 특히 선천성 면역 세포 행동은 주로 조직학적 분석 또는 시험관 내 배양 세포로부터 유래되기 때문에. 따라서, 살아있는 척추동물 유기체의 내부 C. difficile에 대한 선천적인 면역 반응을 밝히기 위해 투명한 제브라피시 모델을 확립하는 것은 그러한 연구를 용이하게 할 것이다. Zebrafish 유충은 기능성 선천성 면역 계통을 가지고 있지만, 수정 후 4-6주까지 적응면역계가결여되어 있다 9. 이 독특한 특징은 제브라피쉬 애벌레를 CDI에서 선천적인 면역 세포의 고립된 반응과 기능을 연구하는 훌륭한 모델로 만듭니다.
이 보고서는 대식세포와 호중구와 같은 C. difficile과 선천적인 면역 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 제브라피쉬 애벌레를 사용하는 새로운 방법을 설명합니다. 첫째, C. difficile 접종 및 염색을 포함하는 국소화된 미세 주입 프로토콜이 제시된다. 생체 내 공초점 시간 경과 이미징을 사용하여 감염 부위를 향한 호중구 및 대식세포의 반응이 기록되고 호중구 및 대식세포에 의한 박테리아의 식세포가 관찰됩니다. 그러나, 주사 자체가 조직 손상을 일으키고박테리아(10)와무관하게 백혈구의 모집을 유도하는 것으로 보고되었다. 따라서, 제브라피시 유충의 장으로 C. 디피실을 전달하는 비침습적 마이크로개지 프로토콜이 이어서 기술된다. 이전 연구는 토착 위장 미생물C. difficile의식민지에 대 한 호스트를 보호 하는 것을 입증했다 11. 따라서, 그놈제브라피쉬 유충은 또한 12개의감염된 제브라피시를 걸리기 위해 사용된다. 그 후, 장 해부는 실행 가능한 C. difficile을 복구하고 제브라피시 장관에서 자신의 존재의 기간을 확인하기 위해 수행됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

클로스트리디오이드 디피실 감염(CDI)은 미국에서 가장 흔한 의료 관련 위장 감염 중 하나로 간주됩니다. C. difficile에 대하여 타고난 면역 반응은 기술되었습니다, 그러나 CDI에 있는 호중구 및 대식세포의 정확한 역할은 보다 적게 이해됩니다. 현재 연구에서는, Danio rerio (zebrafish) 애벌레는 생체 내에서 이러한 선천적 면역 세포의 행동과 협력을 이미징하기 위한 C. difficile 감염 모델을 확립하는 데 사용됩니다. C. difficile을모니터링하기 위해 형광 염료를 사용하는 라벨링 프로토콜이 확립되었습니다. 국소화된 감염은 제브라피시 장관에서 활발하게 자라며 CDI의 장 상피 손상을 모방하는 C. difficile이라는 라벨이 붙은 마이크로주입에 의해 달성됩니다. 그러나, 이 직접적인 감염 프로토콜은 침략적이고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 현미경 상처를 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 더 비침습적 마이크로게이지 프로토콜은 여기에 기술된다. 이 방법은 열린 입을 통해 삽관에 의해 제브라피시 유충의 장으로 직접 C. difficile 세포의 전달을 포함한다. 이 감염 방법은 C. difficile의자연 감염 경로를 밀접하게 모방합니다.

C. difficile는 엄격하게 혐기성입니다, 그러나 형광성 단백질의 발색단은 일반적으로 성숙하기 위하여 산소를 요구합니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 형광염료를 활발히 성장시킨 살아있는 C. 디피실 세포를 염색하는 데 사용되었다(R20291, 리보형 027 균주; 그림 1A). Gal4/UAS 시스템을 사용하여, mpeg1.1 또는 lyZ 프로모터가 Gal4 의존적 ?...

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Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.

클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

이 방법은 클로스트리듐 감염에서 타고난 면역 체계의 역할에 대 한 주요 질문에 대답할 수 있습니다., 대식 세포가 인식 하거나 phagocytose이 병원 체. 이 방법의 주요 장점은 많은 상이한 혐기성 박테리아에 적용될 수 있고, 감염 시간을 조작할 수 있으며, 경구 투여가 정상적인 인간 감염을 훨씬 더 가깝게 나타낸다는 것입니다. 배양 후, 배양의 1 밀리리터를 분광광계 큐벳으로 옮기고 OD600을 측정한다.필요한 금액을 1.5밀리리터 튜브로 전송하여 최종 부피 1밀리리터에서 1-1.2의 최종 OD에 도달합니다. 1X PBS 1밀리리터, 원심분리기는 실온에서 3분간 5, 000배g으로 1회 세척합니다. 1X PBS의 1밀리리터로 재중단.1 밀리리터 세균 현탁액에 준비된 형광염의 작동 용액 3개를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 그 후, 스테인드 클로스트리디노이드 디피실을 1X PBS로 한 번 세척하여 잔류 염료를 제거하고 1X PBS의 1밀리리터로 재보설하여 1.0의 OD600을 달성한다.먼저, 페트리 접시에 제브라피쉬 애벌레에 0.8% 낮은 녹는 아가로즈를 놓습니다. 애벌레를 측면 위치로 부드럽게 조정합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 30~60초 간 놓아 저융 아가로즈가 굳어지도록 합니다.아가로즈를 커버하기 위해 0.02%에서 0.04%의 트리카인을 함유한 30%의 다니오의 배지를 추가합니다. 사출 용액을 준비하려면 PBS 용액에 0.5%페놀 레드의 마이크로리터 1개를 염색된 클로스트리디로이드 디피실 디피실 의 9마이크로리터에 넣습니다. 마이크로 로더를 사용하여 주입 용액으로 보정 된 미세 주입 바늘을로드합니다.로드된 바늘을 미세 조작기에 장착하고 스테레오 현미경으로 배치합니다. 600에서 900 헤코토퍼스칼 사이의 사출 압력을 조정합니다. 0.5 ~ 1.0 나노리터를 얻기 위해 주입 시간을 0.1 ~ 0.3초로 설정합니다.약 45도 각도로 미세 조작기의 바늘을 설정하여 임베디드 유충을 향합니다. 비뇨 생식기 공막 에 가까운 위장관 위에 바늘 끝을 놓습니다. 아가로즈를 관통한 다음 바늘 끝으로 근육을 관통합니다.그런 다음 장 루멘에 삽입하고 클로스트리디노이드 디피실의 0.5 ~ 1.0 나노 리터를 주입하십시오. 형광 현미경을 사용하여 주입된 애벌레를 모니터링하고 유연한 마이크로로더 팁을 사용하여 공초점 이미징을 위해 제대로 주입된 애벌레를 픽업합니다. 홈이 있는 1.5%의 아가로즈 플레이트에 0.8% 낮은 녹는 아가로즈를 제브라피시 애벌레에 놓아 덮습니다.홈과 꼬리의 45도 각도에서 머리를 똑바로 향하여 애벌레를 홈의 벽에 부드럽게 조정합니다. 아가로즈를 통해 바늘을 부드럽게 작동한 다음 식도를 통해 얼룩말 물고기 애벌레의 입으로 부드럽게 작동합니다. 바늘의 끝이 전방 장 전구 안에 들어가면 주사 페달을 눌러 박테리아 배양의 0.5 ~ 1 나노 리터를 방출하십시오.장의 루멘을 채웁니다. 식도 나 클로카에서 넘쳐 나오지 마십시오. 얼룩말의 입에서 바늘을 부드럽게 철회합니다.gavage 다음, 먼저 아가로즈를 잘라서, 다음 애벌레를 들어 올려 유연한 마이크로 로더 팁으로 아가로즈에서 감염된 제브라피스 애벌레를 구출. 이 애벌레를 멸균 30% Danieau의 배지로 옮기고 두 번 헹구세요. 얼룩말 물고기 애벌레를 마취 한 후, 마취 유충을 커버하기 위해 1 % 낮은 녹는 아가로즈의 200 ~ 300 마이크로 리터를 추가합니다.가능한 한 유리 슬라이드에 대해 애벌레의 감염된 부위를 가깝게 놓습니다. 아가로즈가 얼음 위에 30~60초 동안 굳어지게 합니다. 아가로즈를 30%의 다니오의 매체로 잠급하여 0.02%에서 0.04%의 트리카인을 함유하고 있습니다.공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 애벌레를 이미지화합니다. 감염된 제브라피쉬 유충을 안락사한 후, 제브라피시 유충을 머리 가까이에 있는 제브라피쉬 애벌레의 등갈 트렁크에 바늘을 삽입하여 제브라피시를 고정시하십시오. 랜싯으로 아가미 뒤의 머리를 제거합니다.등대 트렁크 의 중간에 두 번째 바늘을 삽입합니다. 제3 바늘을 제브라피쉬의 복부에 삽입하고 내장을 신체 구멍에서 끌어냅니다. 10~15개의 내장을 멸균 1X PBS 200 마이크로리터를 포함하는 1.5밀리리터 튜브로 옮기는 미세 주입 바늘을 사용한다.조직을 방해하고 균질화를 준비하기 위해 위장으로 내장을 균질화하십시오. 유봉이 튜브 의 바닥에 도달하여 모든 내장을 완전히 방해하도록하십시오. 균질에, 클로스트리디오이드 디피틸을 첨가하여 D-cycloserine및 세폭시틴을 함유하고, 타우로콜린산유무드, 혐기성 챔버에서 배양한다.이 연구에서는 호중구와 대식세포가 감염 부위에 도달합니다. 활성화된 대식세포 phagocytizing 2개의 박테리아의 예는 표기된 클로스트리디오이드 difficile의 phagocytosis 및 소화에 의한 청산을 보여줍니다. 5일 후 비옥식 후 대식세포 및 호중구 리포터 라인의 장 루멘에 형광 라벨이 부착된 클로스트리디노이드 디피실을 전달하는 마이크로가게이지는 클로스트리디노이드 디피실 감염의 자연적인 경로를 모방한다.그러나, 호중구와 대식세포는 microgavage 후에 12 시간까지 위장관에 명백한 이주를 보여주지 않았습니다. 그 동안, 라벨 클로스트리디로이드 difficile의 형광은 약 5 시간 후에 사라졌다 microgavage 후에. 감염 후 24시간 장 내 시료가 해부되었고 세균성장을 보였다.대조군에서 박테리아가 자라지 않았습니다. 나중에, 인큐베이션된 견본은 TCA를 포함하는 매체에서만 성장했습니다, 창자에 있는 총 클로스트리디노이드 difficile가 포자를 형성했다는 것을 건의합니다. 16S rDNA PCR은 성장한 박테리아를 클로스트리디로이드 디피실로 확인하여 예측 가능한 크기의 특정 PCR 앰플리콘을 약 800개의 기본 쌍을 생성합니다.CHROMID 플레이트에 자란 박테리아 배양은 전형적인 검은 식민지로 나타났으며, 이는 얼룩말 피시 장의 박테리아가 클로스트리디노이드 디피실임을 더욱 나타냈다. 혐기성 박테리아와 함께 작업하는 것은 물론 박테리아의 생물학에 영향을 미치기 때문에 호기성 단계가 짧게 유지될 것을 요구합니다. 제브라피시의 타고난 면역 세포를 조작할 수 있습니다.예를 들면, 그(것)들은 감염에 타고난 면역 세포 반응의 기계장치를 해독할 수 있습니다. 우리의 방법은 제브라피쉬가 인간의 창자에서 혐기성 병원체를 연구하는 도구가 될 수 있음을 지적했습니다. 다중 내성 병원균으로 작업하려면 적절한 안전 조치를 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...