Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Vi er takknemlige til Timo Fritsch for utmerket dyrepleie. Vi takker medlemmene av Köster- og Steinert-laboratoriene for støtte og nyttige diskusjoner. Vi takker Dr. Dandan Han for kritisk lesing av manuskriptet. Vi anerkjenner takknemlig finansiering av den føderale delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Alt dyrearbeid som er beskrevet her ble utført i samsvar med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63, lisens AZ 325.1.53/56.1-TUBS og lisens AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Fremstilling av lav smeltende agarose, gelplate og mikroinjeksjon/mikrogavagenåler
<ol><li>Oppløs 0,08 g lav smeltende agarose (Materialbord, agarose A2576) i 10 ml 30% Danieaumedium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) og 17,4 mM NaCl, la...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile.">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li><li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance.">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li><li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain,+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078.">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li><li>P&#233;pin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea:+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec.">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li><li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

De presenterte metodene endrer og utvider en eksisterende tilnærming for å infisere sebrafisk larver ved å utføre både injeksjon og mikrogavage10,14. Det demonstrerer også en tilnærming til å studere anaerobe patogener med sebrafisk larver22. I tillegg forenkler protokollen analysen av medfødte immuncelleresponser på CDI og ved kolonisering av C. vanskelig i sebrafisk. Metoden er reproduserbar og lett å gjennomføre i e...

C. difficile er en gram-positiv, sporedannende, anaerob og toksinproduserende bacillus som er den ledende årsaken til alvorlige infeksjoner i mage-tarmkanalen1. Typiske symptomer på CDI inkluderer diaré, magesmerter og dødelig pseudomembranøs kolitt, og det kan noen ganger føre til død1,2. Bevis har vist at vertenimmunresponser spiller en kritisk rolle i både progresjonen og utfallet av denne sykdommen3. I tillegg til immunresponsen er urbefolkningens tarmmikrobiota avgjørende for utbruddet og patogenesen til CDI4. I det siste tiåret har både antall tilfeller og dødeligheten av CDI økt betydelig på grunn av fremveksten av en hypervirulent stamme av C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bedre forståelse av underliggende immunmekanismer og mikrobiotaens rolle under CDI vil bidra til nye terapeutiske utviklinger og fremskritt, noe som gir bedre kontroll over denne epidemien.
Flere dyremodeller, som hamster og mus, har blitt utviklet for å gi innsikt i immunforsvaret mot C. vanskelig7,8. Imidlertid er rollen til medfødte immunceller fortsatt dårlig forstått, spesielt siden medfødt immuncelleatferd hovedsakelig er avledet fra histologisk analyse eller kultiverte celler in vitro. Derfor vil det å etablere en gjennomsiktig sebrafiskmodell for å avsløre den medfødte immunresponsen mot C. vanskelig inne i en levende virveldyrorganisme legge til rette for slike studier. Sebrafisk larver har et funksjonelt medfødt immunsystem, men de mangler det adaptive immunforsvaret til 4-6 uker etter befruktning9. Denne unike funksjonen gjør sebrafisk larver en utmerket modell for å studere den isolerte responsen og funksjonen til medfødte immunceller i CDI.
Denne rapporten beskriver nye metoder ved hjelp av sebrafisk larver for å studere interaksjonene mellom C. vanskelig og medfødte immunceller, som makrofager og nøytrofiler. For det første presenteres en lokalisert mikroinjeksjonsprotokoll som inkluderer C. difficile inoculum og farging. Ved hjelp av in vivo-konfokal time-lapse-avbildning registreres responsen av nøytrofiler og makrofager mot infeksjonsstedet, og fagocytose av bakterier av nøytrofiler og makrofager observeres. Det har imidlertid blitt rapportert at injeksjonen i seg selv forårsaker vevsskade og fører til rekruttering av leukocytter uavhengig av bakteriene10. Derfor beskrives en ikke-invasiv mikrogavageprotokoll for å levere C. difficile inn i tarmen av sebrafisklarver senere. Tidligere studier har vist at urfolk gastrointestinal mikrobiota beskytte en vert mot kolonisering av C. vanskelig11. Derfor brukes gnotobiotiske sebrafisk larver også til å predisponere sebrafisken som er smittet 12. Etterpå utføres tarmdisseksjon for å gjenopprette levedyktig C. vanskelig og validere varigheten av deres tilstedeværelse i sebrafisk tarmkanaler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides difficile infeksjon (CDI) anses å være en av de vanligste helse-assosierte gastrointestinale infeksjoner i USA. Den medfødte immunresponsen mot C. difficile er beskrevet, men de eksakte rollene til nøytrofiler og makrofager i CDI er mindre forstått. I den nåværende studien brukes Danio rerio (sebrafisk) larver til å etablere en C. vanskelig infeksjonsmodell for å forestille seg oppførselen og samarbeidet til disse medfødte immuncellene in vivo. For å overvåke C. vanskelig, en merking protokoll ved hjelp av en fluorescerende farge er etablert. En lokalisert infeksjon oppnås ved mikroinsprøyting merket C. difficile, som aktivt vokser i sebrafisk tarmkanalen og etterligner tarmepitelskaden i CDI. Denne direkte infeksjonsprotokollen er imidlertid invasiv og forårsaker mikroskopiske sår, noe som kan påvirke eksperimentelle resultater. Derfor er en mer ikke-invasiv mikrogavage protokoll beskrevet her. Metoden innebærer levering av C. difficile celler direkte inn i tarmen av sebrafisk larver ved intubasjon gjennom åpen munn. Denne infeksjonsmetoden etterligner nøye den naturlige infeksjonsruten til C. vanskelig.

C. difficile er strengt anaerobt, men kromforavfluorescerende proteiner krever vanligvis oksygen for å modnes. For å overvinne dette problemet ble en fluorescerende farge brukt til å flekke levende C. vanskeligceller som vokste aktivt (R20291, en ribotype 027 belastning; Figur 1A). Ved hjelp av Gal4/UAS-systemet ble stabile transgene sebrafisklinjer generert for levende bildebehandling, der mpeg1.1- eller lyZ-arrangørene drev uttrykket...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presentert her er en sikker og effektiv metode for å infisere sebrafisk larver med fluorescerende merket anaerob C. vanskelig ved mikroinjeksjon og ikke-invasiv mikrogavage.

Utvikling av en Larval Zebrafish Infeksjon Modell for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Denne metoden kan svare på det viktigste spørsmålet om rollen til medfødt immunsystem i Clostridium-infeksjonen, som om og hvordan makrofager gjenkjenner eller fagocytose dette patogenet. Den største fordelen med denne metoden er at den kan brukes på mange forskjellige anaerobe bakterier, at infeksjonstiden kan manipuleres, og at oral administrasjon representerer den normale menneskelige infeksjonen mye nærmere. Etter kultering, overføre en milliliter av kulturen til en spektrofotometer cuvette, og måle OD600.Overfør den nødvendige mengden til et friskt 1,5-milliliter rør for å nå en endelig OD på en til 1,2 i en milliliter endelig volum. Vask en gang med en milliliter 1X PBS, og sentrifuge ved 5000 ganger g i tre minutter ved romtemperatur. Resuspend i en milliliter 1X PBS.Tilsett tre mikroliter med arbeidsløsning av det tilberedte fluorescerende fargestoffet i en milliliter bakteriell suspensjon. Inkuber prøven i 15 minutter ved romtemperatur i mørket. Deretter vasker du de beisede Clostridioides difficile en gang med 1X PBS for å fjerne gjenværende fargestoff, og gjenbruk i en milliliter 1X PBS for å oppnå en OD600 på 1,0.Først legger du en dråpe på 0,8% lavsmeltende agarose på sebrafisklarver i en petriskål for å dekke. Juster larvene forsiktig til en sidestilling. Plasser petriskålen på is i 30 til 60 sekunder slik at den lavtsmeltende agaroseen kan stivne.Legg til 30% Danieau medium som inneholder 0,02% til 0,04% trikain for å dekke agarose. For å forberede injeksjonsoppløsning, tilsett en mikroliter på 0,5% fenolrød i PBS-oppløsning i ni mikroliter av fargestofffarget Clostridioides difficile inoculum. Legg i en kalibrert mikroinjeksjonsnål med injeksjonsoppløsningen ved hjelp av en mikrolaster.Monter den lastede nålen i en mikromanipulator, og plasser den under et stereomikroskop. Juster injeksjonstrykket mellom 600 og 900 hektokokker. Still injeksjonstiden til 0,1 til 0,3 sekunder for å få 0,5 til 1,0 nanoliter.Sett nålen i mikromanipulatoren i en ca. 45-graders vinkel, og pek mot de innebygde larver. Plasser nålespissen over mage-tarmkanalen, nær den urogenielle poren. Pierce gjennom agarose, deretter muskelen med nål spissen.Sett den deretter inn i tarmlumen, og injiser 0,5 til 1,0 nanoliter clostridioider difficile. Bruk et fluorescensmikroskop til å overvåke de injiserte larver, og bruk en fleksibel Mikroloader-spiss for å plukke opp de riktig injiserte larver for konfokal avbildning. I en 1,5% agarose plate med spor, plasser en dråpe på 0,8% lavsmeltende agarose på sebrafisk larver for å dekke.Juster larvene forsiktig med hoder vendt oppreist i 45-graders vinkler i sporet og haler mot veggen av sporet. Bruk forsiktig nålen gjennom agarose, deretter inn i munnen av sebrafisk larver, gjennom spiserøret. Når spissen av nålen er inne i den fremre tarmpæren, trykk på injeksjonspedalen for å frigjøre 0,5 til en nanoliter av bakteriekultur.Fyll tarmens lumen. Ikke la det flyte over fra spiserøret eller cloaca. Trekk forsiktig nålen ut av sebrafiskens munn.Etter gavage, redde de infiserte sebrafisk larver fra agarose med en fleksibel Microloader tips ved først å kutte agarose bort, deretter ved å løfte larver. Overfør disse larvene til sterile 30% Danieaus medium, og skyll to ganger. Etter å ha bedøvet sebrafisk larver, legg til 200 til 300 mikroliter på 1% lavtsmeltende agarose for å dekke bedøvede larver.Plasser den infiserte regionen av larver mot et glasssklie så nært som mulig. La agarose stivne på isen i 30 til 60 sekunder. Senk agarose i 30% Danieau medium som inneholder 0,02% til 0,04% trikain.Fortsett å bilde larver med et konfokal laserskanningsmikroskop. Etter euthanizing de infiserte sebrafisk larver, sett en nål inn i dorsal stammen av sebrafisk larver nær hodet for å immobilisere sebrafisk. Fjern hodet bak gjellene med en lansett.Sett en annen nål inn i midten av dorsalstammen. Sett en tredje nål inn i sebrafiskens underliv, og trekk tarmen ut av kroppshulen. Bruk en mikroinjeksjonsnål til å overføre 10 til 15 tarmer til et 1,5 milliliter rør som inneholder 200 mikroliter sterile 1X PBS.Homogeniser tarmene med en pestle for å forstyrre vevet og forberede homogenater. Sørg for at pestle når bunnen av røret for å forstyrre alle tarmene helt. I homogenatene, tilsett Clostridioides difficile oppdrett medium som inneholder D-cycloserine og cefoxitin, med eller uten taurocholate, og inkubere i et anaerobt kammer.I denne studien når både nøytrofiler og makrofager infeksjonsstedene. Eksemplet på en aktivert makrofag phagocytizing to bakterier viser clearing av fagocytose og fordøyelsen av merket Clostridioides vanskelig. Mikrogavaget for å levere fluorescens-merkede Clostridioides difficile inn i tarmlum av makrofag og nøytrofil reporter linjer på fem dager etter befruktning etterligner den naturlige banen til Clostridioides vanskelig infeksjon.Nøytrofiler og makrofager viste imidlertid ikke åpenbar migrering til mage-tarmkanalen i opptil 12 timer etter mikrogavage. I mellomtiden forsvant fluorescensen av de merkede Clostridioides difficile etter rundt fem timer etter mikrogavage. Tarmprøver 24 timer etter infeksjon ble dissekert og viste bakteriell vekst.Ingen bakterier vokste i kontrollgruppen. På senere tidspunkt vokste inkuberte prøver bare i mediet som inneholder TCA, noe som tyder på at totale Clostridioides difficile i tarmen hadde dannet sporer. 16S rDNA PCR identifiserte den voksne bakterien som Clostridioides difficile, som produserer spesifikke PCR amplicons av forutsigbar størrelse rundt 800 basepar.Bakteriekulturer dyrket på en CHROMID plate dukket opp som typiske svarte kolonier, som videre indikerte at bakterier fra sebrafisk tarmene var Clostridioides vanskelig. Arbeid med anaerobe bakterier krever at de aerobe trinnene holdes korte fordi det påvirker biologien til bakteriene selvfølgelig. Medfødt immuncelle i sebrafisk kan manipuleres.For eksempel kan de tyde mekanismen til de medfødte immuncelleresponsene på infeksjonen. Vår metode indikerte at sebrafisk kan være et verktøy for å studere anaerobt patogen fra menneskelig tarm. Arbeid med multiresistente patogener krever at passende sikkerhetstiltak tas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Ved hjelp av lys Sheet Fluorescensmikroskopi til bilde Sebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utvikling av en etanol-indusert Fibrotiske Liver Modell i Sebrafisk å studere stamceller-mediert hepatocytter Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Disseksjon av Larve Sebrafisk Gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av larver sebrafisk som et dyr-modellen for å undersøke Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Electroretinogram opptak i larver sebrafisk bruker A Novel koniske svamp-tip elektrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...