Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
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Estamos agradecidos a Timo Fritsch por su excelente cuidado animal. Agradecemos a los miembros de los laboratorios de Koster y Steinert el apoyo y las discusiones útiles. Agradecemos al Dr. Dandan Han por leer críticamente el manuscrito. Agradecemos la financiación del Estado Federal de Baja Sajonia, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).

Todo el trabajo animal descrito aquí se realizó de acuerdo con las regulaciones legales (DIRECTIVA UE 2010/63, licencia AZ 325.1.53/56.1-TUBS y licencia AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Preparación de agarosa de baja fusión, placa de gel y agujas de microinyección/microgavage
<ol><li>Disolver 0,08 g de agarosa de baja fusión(Tabla de materiales, agarosa A2576) en 10 ml del medio de Danieau al 30% (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. 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L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

Los métodos presentados modifican y amplían un enfoque existente para infectar las larvas de peces cebra mediante la realización de inyección y microvaage10,14. También demuestra un enfoque para estudiar patógenos anaeróbicos con larvas de peces cebra22. Además, el protocolo facilita el análisis de las respuestas innatas de las células inmunitarias in vivo sobre el CDI y sobre la colonización de C. difficile en el pez c...

C. difficile es un bacilo grampositivo, formador de esporas, anaeróbico y productor de toxinas que es la principal causa de infecciones graves en el tracto gastrointestinal1. Los síntomas típicos de la ICD incluyen diarrea, dolor abdominal y colitis pseudomembranosa fatal, y a veces puede llevar a la muerte1,2. La evidencia ha demostrado que las respuestas inmunitarias del huésped desempeñan un papel crítico tanto en la progresión como en el resultado de esta enfermedad3. Además de la respuesta inmunitaria, la microbiota intestinal autóctona es crucial para la aparición y la patogénesis de la CDI4. En la última década, tanto el número de casos como la tasa de mortalidad de la CDI han aumentado significativamente debido a la aparición de una cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una mejor comprensión de los mecanismos inmunitarios subyacentes y el papel de la microbiota durante la CdC ayudará a dar lugar a nuevos desarrollos y avances terapéuticos, lo que permitirá un mejor control de esta epidemia.
Varios modelos animales, como el hámster y el ratón, se han desarrollado para proporcionar una visión de la defensa inmune contra C. difficile7,8. Sin embargo, el papel de las células inmunitarias innatas todavía se entiende mal, particularmente porque el comportamiento innato de las células inmunitarias se deriva principalmente del análisis histológico o de las células cultivadas in vitro. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo transparente de pez cebra para revelar la respuesta inmune innata a C. difficile dentro de un organismo vertebrado vivo facilitará tales estudios. Las larvas de peces cebra tienen un sistema inmunitario innato funcional, pero carecen del sistema inmunitario adaptativo hasta 4-6 semanas después de la fertilización9. Esta característica única hace que las larvas de pez cebra sean un excelente modelo para estudiar la respuesta aislada y la función de las células inmunitarias innatas en la ICD.
Este informe describe nuevos métodos que utilizan larvas de peces cebra para estudiar las interacciones entre C. difficile y las células inmunitarias innatas, como macrófagos y neutrófilos. En primer lugar, se presenta un protocolo de microinyección localizado que incluye C. difficile inoculum y tinción. Utilizando imágenes confocales in vivo de lapso de tiempo, se registra la respuesta de neutrófilos y macrófagos hacia el sitio de la infección, y se observa la fagocitosis de bacterias por neutrófilos y macrófagos. Sin embargo, se ha informado de que la inyección en sí causa daño tisular y conduce al reclutamiento de leucocitos independientes de la bacteria10. Por lo tanto, posteriormente se describe un protocolo de microgavage no invasivo para administrar C. difficile en el intestino de las larvas de peces cebra. Estudios anteriores han demostrado que la microbiota gastrointestinal indígena protege a un huésped contra la colonización de C. difficile11. Por lo tanto, las larvas de pez cebra gnotobióticas también se utilizan para predisponer el pez cebra que están infectados 12. Después, la disección intestinal se realiza para recuperar la C. difficile viable y validar la duración de su presencia en los tracto intestinales del pez cebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides difficile infección (CDI) se considera una de las infecciones gastrointestinales más comunes asociadas a la atención médica en los Estados Unidos. Se ha descrito la respuesta inmune innata contra C. difficile, pero se entienden menos los roles exactos de los neutrófilos y los macrófagos en la CDI. En el estudio actual, las larvas de Danio rerio (pez cebra) se utilizan para establecer un modelo de infección por C. difficile para tomar imágenes del comportamiento y la cooperación de estas células inmunitarias innatas in vivo. Para monitorear C. difficile, se ha establecido un protocolo de etiquetado utilizando un tinte fluorescente. Una infección localizada se logra mediante microinyección etiquetada C. difficile, que crece activamente en el tracto intestinal del pez cebra e imita el daño epitelial intestinal en CDI. Sin embargo, este protocolo de infección directa es invasivo y causa heridas microscópicas, que pueden afectar los resultados experimentales. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo de microgavage más no invasivo. El método consiste en la entrega de células C. difficile directamente en el intestino de las larvas de peces cebra por intubación a través de la boca abierta. Este método de infección imita de cerca la ruta de infección natural de C. difficile.

C. difficile es estrictamente anaeróbico, pero el cromóforo de las proteínas fluorescentes generalmente requiere oxígeno para madurar. Para superar este problema, se utilizó un tinte fluorescente para manchar las células vivas de C. difficile que estaban creciendo activamente (R20291, una cepa ribotipo 027; Figura 1A). Utilizando el sistema Gal4/UAS, se generaron líneas estables transgénicas de peces cebra para imágenes en vivo, en las que los prom...

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Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.

Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Este método puede responder a la pregunta clave sobre el papel del sistema inmunitario innato en la infección por Clostridium, como si y cómo los macrófagos reconocen o fagocitos de este patógeno. La principal ventaja de este método es que se puede aplicar a muchas bacterias anaeróbicas diferentes, que el tiempo de infección puede ser manipulado, y que la administración oral representa la infección humana normal mucho más cerca. Después del cultivo, transfiera un mililitro del cultivo a una cubeta espectrofotómetro, y mida el OD600.Transfiera la cantidad requerida a un tubo fresco de 1,5 mililitros para alcanzar un OD final de uno a 1,2 en un mililitro de volumen final. Lave una vez con un mililitro de 1X PBS y centrifugar a 5.000 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Resuspend en un mililitro de 1X PBS.Añadir tres microlitros de solución de trabajo del tinte fluorescente preparado en la suspensión bacteriana de un mililitro. Incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de eso, lavar el Clostridioides difficile manchado una vez con 1X PBS para eliminar el tinte residual, y resuspend en un mililitro de 1X PBS para lograr un OD600 de 1.0.En primer lugar, coloque una gota de 0,8% de agarosa de baja fusión sobre las larvas de pez cebra en un plato de Petri para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque el plato Petri sobre hielo durante 30 a 60 segundos para permitir que la agarosa de bajo derretimiento se solidifique.Añadir 30%Danieau medio que contiene 0.02%a 0.04%tricaína para cubrir la agarosa. Para preparar la solución inyectable, añada un microlitro de 0,5% rojo fenol en solución PBS en nueve microlitros del inóculo Clostridioides difficile teñido con tinte. Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección utilizando un microcargador.Monte la aguja cargada en un micromaniprógrafo y colóquela bajo un microscopio estéreo. Ajuste la presión de inyección entre 600 y 900 hectopascales. Ajuste el tiempo de inyección en 0,1 a 0,3 segundos para obtener nanolitros de 0,5 a 1,0.Ajuste la aguja en el micromaniprógrafo en un ángulo de aproximadamente 45 grados, apuntando hacia las larvas incrustadas. Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal, cerca del poro urogenital. Perforar a través de la agarosa, luego el músculo con la punta de la aguja.A continuación, insértelo en el lumen intestinal e inyecte de 0,5 a 1,0 nanolitros de Clostridioides difficile. Utilice un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas, y utilice una punta flexible de Microfúnte para recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales. En una placa de agarosa del 1,5% con ranuras, coloque una gota de 0,8% de agarosa de baja fusión sobre las larvas de pez cebra para cubrir.Ajuste suavemente las larvas con las cabezas orientadas hacia la erguida en ángulos de 45 grados en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Operar suavemente la aguja a través de la agarosa, luego en la boca de las larvas de pez cebra, a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro de la bombilla intestinal anterior, presione el pedal de inyección para liberar 0.5 a una nanolitros de cultivo de bacterias.Llena el lumen del intestino. No deje que se desborde del esófago o cloaca. Retire suavemente la aguja de la boca del pez cebra.Después de la gavage, rescatar las larvas de pez cebra infectadas de la agarosa con una punta flexible de Microloader cortando primero la agarosa, luego levantando las larvas. Transfiera estas larvas al medio estéril de 30%Danieau y enjuague dos veces. Después de anestesiar las larvas de pez cebra, agregue de 200 a 300 microlitros de 1% de agarosa de bajo derretimiento para cubrir las larvas anestesiadas.Coloque la región infectada de las larvas contra un tobogán de vidrio lo más cerca posible. Deje que la agarosa se solidifique sobre hielo durante 30 a 60 segundos. Sumerja la agarosa en el medio de Danieau al 30%que contiene 0,02% a 0,04%tricaína.Proceda a la imagen de las larvas con un microscopio de escaneo láser confocal. Después de eutanasiar las larvas de pez cebra infectadas, inserte una aguja en el tronco dorsal de las larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar el pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.Inserte una segunda aguja en el centro del tronco dorsal. Inserte una tercera aguja en el abdomen del pez cebra y extraiga el intestino de la cavidad corporal. Utilice una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de 1X PBS estéril.Homogeneizar los intestinos con un peste para interrumpir el tejido y preparar homogeneizaciones. Asegúrese de que el pestillo llegue al fondo del tubo para interrumpir todos los intestinos por completo. En los homogeneizas, añadir Clostridioides difficile medio de cría que contenga ciclonestrina D y cefoxitina, con o sin taurocholato, e incubar en una cámara anaeróbica.En este estudio, tanto los neutrófilos como los macrófagos llegan a los sitios de infección. El ejemplo de un fagocito de macrófago activado que fagoticiona dos bacterias muestra la limpieza por fagocitosis y la digestión de la etiqueta Clostridioides difficile. El microgavage para entregar Clostridioides difficile con etiqueta de fluorescencia en el lumen intestinal de las líneas de reportero de macrófagos y neutrófilos a los cinco días después de la fertilización imita el camino natural de la infección por Clostridioides difficile.Sin embargo, los neutrófilos y macrófagos no mostraron una migración obvia al tracto gastrointestinal hasta 12 horas después del microgage. Mientras tanto, la fluorescencia de la etiqueta Clostridioides difficile desapareció después de unas cinco horas después de la microgavage. Las muestras intestinales 24 horas después de la infección fueron diseccionadas y mostraron crecimiento bacteriano.No creció ninguna bacteria en el grupo de control. En puntos posteriores, las muestras incubadas sólo crecían en el medio que contenía TCA, lo que sugiere que el total de Clostridioides difficile en el intestino había formado esporas. 16S rDNA PCR identificó la bacteria cultivada como Clostridioides difficile, que produce ampecados específicos de PCR de tamaño predecible alrededor de 800 pares de bases.Los cultivos de bacterias cultivados en una placa CHROMID aparecieron como colonias negras típicas, lo que indicó además que las bacterias de los intestinos del pez cebra eran Clostridioides difficile. Trabajar con bacterias anaeróbicas requiere que los pasos aeróbicos se mantengan cortos porque eso influye en la biología de las bacterias, por supuesto. La célula inmune innata en el pez cebra puede ser manipulada.Por ejemplo, pueden descifrar el mecanismo de las respuestas innatas de las células inmunitarias a la infección. Nuestro método indicó que el pez cebra puede ser una herramienta para estudiar el patógeno anaeróbico del intestino humano. Trabajar con patógenos multirresistentes requiere que se tomen las medidas de seguridad adecuadas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...