Name: development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Timo Fritsch för utmärkt djurvård. Vi tackar medlemmarna i Köster och Steinert labs för stöd och hjälpsamma diskussioner. Vi tackar dr Dandan Han för att han läste manuskriptet. Vi erkänner tacksamt finansiering av den federala staten Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Allt djurarbete som beskrivs här utfördes i enlighet med rättsliga bestämmelser (EU-direktiv 2010/63, licens AZ 325.1.53/56.1-TUBS och licens AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Beredning av lågsmältning saros, gelplatta och mikroinjektion/mikrogavagenålar
<ol><li>Lös upp 0,08 g låg smältning smälter (Materialbord, agarose A2576) i 10 ml 30% Danieau s medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 m MHEPES (pH = 7,2) och 17,...

<ol>
	<li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis.">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab.">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li><li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile.">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li><li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance.">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li><li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain,+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078.">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li><li>P&#233;pin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea:+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec.">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li><li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters.">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li><li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish.">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile.">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li><li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish.">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li><li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile.">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li><li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgavage+of+Zebrafish+Larvae.">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease.">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li><li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis.">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li><li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation.">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li><li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1.">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li><li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract.">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li><li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda.">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58 (2011).</li><li>D&#237;az-Pascual, F., Ort&#237;z-Sever&#237;n, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Ch&#225;vez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae.">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li><li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+(Danio+rerio).">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li></ol>

De presenterade metoderna ändrar och utökar en befintlig metod för att infektera zebrafisklarver genom att utföra både injektion och mikrogavage10,14. Det visar också en metod för att studera anaeroba patogener med zebrafisk larver22. Dessutom underlättar protokollet analysen av medfödda immuncellsvar in vivo på CDI och vid kolonisering av C. difficile i zebrafisk. Metoden är reproducerbar och lätt att genomföra i ett...

C. difficile är ett gram-positiv, spore-bildande, anaeroba, och toxinproducerande bacillus som är den främsta orsaken till allvarliga infektioner i mag-tarmkanalen1. Typiska symtom på CDI inkluderar diarré, buksmärta, och dödlig pseudomembranous kolit, och det kan ibland leda till döden1,2. Bevis har visat att värd immunsvar spelar en avgörande roll i både progression och resultatet av denna sjukdom3. Förutom immunsvaret är den inhemska tarmmikrobiota avgörande för uppkomsten och patogenesen vid CDI4. Under det senaste årtiondet har både antalet fall och dödligheten i CDI ökat avsevärt på grund av uppkomsten av en hypervirulent stam av C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bättre förståelse av underliggande immunmekanismer och mikrobiotas roll under CDI kommer att bidra till att leda till ny terapeutisk utveckling och framsteg, vilket möjliggör bättre kontroll av denna epidemi.
Flera djurmodeller, såsom hamster och mus, har utvecklats för att ge insikt i immunförsvaret mot C. difficile7,8. Emellertid, rollen av medfödda immunceller är fortfarande dåligt förstås, särskilt eftersom medfödda immuncell beteende beror främst från histologisk analys eller odlade celler in vitro. Därför kommer upprättandet av en transparent zebrafisk modell för att avslöja det medfödda immunsvaret mot C. difficile inuti en levande ryggradsdjur organism underlätta sådana studier. Zebrafisk larver har ett funktionellt medfött immunförsvar, men de saknar adaptivt immunförsvar fram till 4-6 veckor efterbefruktning9. Denna unika funktion gör zebrafisklarver till en utmärkt modell för att studera det isolerade svaret och funktionen hos medfödda immunceller i CDI.
Denna rapport beskriver nya metoder med zebrafisk larver för att studera interaktioner mellan C. difficile och medfödda immunceller, såsom makrofager och neutrofiler. Först presenteras ett lokaliserat mikroinjektionsprotokoll som inkluderar C. difficile inoculum och färgning. Med hjälp av in vivo confocal time-lapse imaging, svaret från neutrofiler och makrofager mot infektionsstället registreras, och fagocytos av bakterier av neutrofiler och makrofager observeras. Det har dock rapporterats att själva injektionen orsakar vävnadsskador och leder till rekrytering av leukocyter oberoende av bakterierna10. Därför beskrivs därefter ett noninvasive microgavage-protokoll för att leverera C. difficile i zebrafisklarvernas tarm. Tidigare studier har visat att inhemska gastrointestinala mikrobiota skydda en värd mot kolonisering av C. difficile11. Därför används gnotobiotiska zebrafisklarver också för att predisponera zebrafisken som är infekterade 12. Därefter utförs tarmdissektion för att återställa livskraftig a. difficile och validera varaktigheten av deras närvaro i zebrafisk tarmkanalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td>Ultra-low gelling agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low-melting (LM)</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8050</td>
			<td>It is used in agarose plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BacLight Red Bacterial Stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B35001</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Heart-Infusion Broth</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X916.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass (wild-type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td>Injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridioides difficile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>open-source platform</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal needle puller</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X (LAS X)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro injector</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5253000017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurocholate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a larval zebrafish infection model for clostridioides difficile

Clostridioides difficile infektion (CDI) anses vara en av de vanligaste hälso-associerade gastrointestinala infektioner i USA. Det medfödda immunsvaret mot C. difficile har beskrivits, men de exakta rollerna för neutrofiler och makrofager i CDI är mindre förstådda. I den aktuella studien används Danio rerio (zebrafisk) larver för att upprätta en C. difficile infektionsmodell för att avbilda beteendet och samarbetet hos dessa medfödda immunceller in vivo. För att övervaka C. difficilehar ett märkningsprotokoll med ett fluorescerande färgämne upprättats. En lokaliserad infektion uppnås genom microinjecting märkt C. difficile, som aktivt växer i zebrafisk tarmkanalen och härmar tarmepitelskador i CDI. Detta direkta infektionsprotokoll är dock invasivt och orsakar mikroskopiska sår, vilket kan påverka experimentella resultat. Därför beskrivs ett mer noninvasive microgavage-protokoll här. Metoden innebär leverans av C. difficile celler direkt i tarmen av zebrafisk larver genom intubation genom den öppna munnen. Denna infektion metod nära härmar den naturliga infektionen vägen av C. difficile.

C. difficile är strikt anaerob, men kromofor av fluorescerande proteiner kräver vanligtvis syre att mogna. För att lösa detta problem användes ett fluorescerande färgämne för att fläcka levande C. difficile celler som aktivt växte (R20291, en ribotyp 027 stam; Bild 1A). Med hjälp av Gal4/UAS-systemet genererades stabila transgena zebrafisklinjer för levande avbildning, där mpeg1.1 eller lyZ-initiativtagarna drev uttrycket av E...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile at JoVE.com

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presenteras här är en säker och effektiv metod för att infektera zebrafisk larver med fluorescerande märkt anaeroba C. difficile genom mikroinjektion och noninvasive microgavage.

Utveckling av en Larval Zebrafish Infektion Modell för Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Denna metod kan svara på den centrala frågan om den roll som medfödda immunsystemet i Clostridium infektion, som om och hur makrofager erkänna eller fagocytose denna patogen. Den största fördelen med denna metod är att den kan tillämpas på många olika anaeroba bakterier, att infektionstiden kan manipuleras, och att oral administrering representerar den normala mänskliga infektionen mycket närmare. Efter odling, överför en milliliter av kulturen till en spektrofotometer cuvette, och mäta OD600.Överför den erforderliga mängden till ett nytt 1,5-milliliterrör för att nå en slutlig OD på en till 1,2 i en milliliter slutlig volym. Tvätta en gång med en milliliter av 1X PBS, och centrifug vid 5, 000 gånger g i tre minuter vid rumstemperatur. Resuspend i en milliliter av 1X PBS.Tillsätt tre mikroliter av arbetslösning av det beredda fluorescerande färgämnet i en milliliter bakteriedjutningen. Inkubera provet i 15 minuter i rumstemperatur i mörker. Därefter tvättar du den färgade Clostridioides difficile en gång med 1X PBS för att avlägsna restfärgämne, och återanvända i en milliliter av 1X PBS för att uppnå en OD600 på 1,0.Först placera en droppe på 0,8% lågsmältande agarose på zebrafisk larver i en petriskål för att täcka. Justera larverna försiktigt till ett lateralt läge. Placera petriskålen på is i 30 till 60 sekunder så att den lågsmältande agarosen kan stelna.Lägg till 30%Danieaus medium som innehåller 0,02%till 0,04%-trikain för att täcka agaros. För att förbereda injektionslösning, tillsätt en mikroliter av 0,5%fenolrött i PBS-lösning i nio mikroliter av det färgämnesfärgade Clostridioides difficile inokulat. Ladda en kalibrerad mikroinjektionsnål med injektionslösningen med hjälp av en Microloader.Montera den laddade nålen i en mikromanipulator, och placera den under ett stereomikroskop. Justera insprutningstrycket mellan 600 och 900 hektopascal. Ställ in injektionstiden på 0,1 till 0,3 sekunder för att få 0,5 till 1,0 nanoliter.Ställ in nålen i mikromanipulatorn i en cirka 45 graders vinkel, som pekar mot de inbäddade larverna. Placera nålspetsen ovanför mag-tarmkanalen, nära den urogenitala poren. Pierce genom agaros, sedan muskeln med nålspetsen.Sedan sätter in den i tarmlumen, och injicera 0,5 till 1,0 nanoliter av Clostridioides difficile. Använd ett fluorescensmikroskop för att övervaka de injicerade larverna, och använd en flexibel Microloader-spets för att plocka upp de korrekt injicerade larverna för konfokal avbildning. I en 1,5%agarosplatta med spår, placera en droppe 0,8% lågsmältande agarose på zebrafish larver att täcka.Justera larverna försiktigt med huvudena vända upprätt i 45-graders vinklar i spåret och svansar mot väggen i spåret. Försiktigt manövrera nålen genom agarose, sedan in i munnen av zebrafish larver, genom matstrupen. När spetsen på nålen är inne i främre tarmlampan, tryck på injektionspedalen för att frigöra 0,5 till en nanoliter av bakterier kultur.Fyll tarmens lumen. Låt det inte svämma över från matstrupen eller kloaca. Dra försiktigt tillbaka nålen från zebrafiskens mynning.Efter sondmatning, rädda de infekterade zebrafish larverna från agarose med en flexibel Microloader spets genom att först skära agarose bort, sedan genom att lyfta larverna. Överför dessa larver till sterila 30%Danieau's medium, och skölj två gånger. Efter att ha sövt zebrafisklarverna, tillsätt 200 till 300 mikroliter av 1%lågsmältande agarose för att täcka de sövda larverna.Placera den infekterade regionen av larverna mot en glasrutschbana så nära som möjligt. Låt agaros stelna på is i 30 till 60 sekunder. Dränka agargen i 30%Danieaus medium som innehåller 0,02%till 0,04%trikain.Fortsätt att avbilda larverna med ett konfokallascanningmikroskop. Efter att ha avlivat de infekterade zebrafisklarverna, sätt in en nål i dorsalstammen av zebrafisklarver nära huvudet för att immobilisera zebrafisken. Ta bort huvudet bakom gälarna med en lansett.Sätt in en andra nål i mitten av ryggstammen. Sätt in en tredje nål i buken av zebrafisken, och dra tarmen ut ur kroppshålan. Använd en mikroinjektionsnål för att överföra 10 till 15 tarmar till ett 1,5-milliliterrör som innehåller 200 mikroliter sterila 1X PBS.Homogenisera tarmarna med en mortelstöt för att störa vävnaden och förbereda homogenates. Se till att mortelstöten når botten av röret för att störa alla tarmar helt. I homogenatet, lägg Clostridioides difficile uppfödning medium som innehåller D-cycloserine och cefoxitin, med eller utan taurocholat, och inkubera i en anaerob kammare.I denna studie når både neutrofiler och makrofager infektionsställena. Exemplet av en aktiverad macrophagefagocytizing två bakterier visar röjningen vid fagocytosis och matsmältning av den märkta Clostridioidesen difficile. Den microgavage att leverera fluorescens-märkt Clostridioides difficile i intestinala lumen av macrophage och neutrophil reporter linjer på fem dagar efter befruktning härmar den naturliga vägen för Clostridioides difficile infektion.Neutrofiler och makrofager visade dock inte uppenbar migration till mag-tarmkanalen i upp till 12 timmar efter microgavage. Under tiden försvann fluorescens av den märkta Clostridioides difficile efter cirka fem timmar efter mikroförgift. Intestinala prover 24 timmar post-infektion var dissekeras och visade bakterietillväxt.Inga bakterier växte i kontrollgruppen. Vid senare tidpunkter, inkuberade prover växte endast i det medium som innehåller TCA, vilket tyder på att totala Clostridioides difficile i tarmen hade bildat sporer. 16S rDNA PCR identifierade den odlade bakterien som Clostridioides difficile, som producerar specifika PCR-amplikoner med förutsägbar storlek runt 800 baspar.Bakteriekulturer som odlades på en CHROMID-platta framträdde som typiska svarta kolonier, vilket ytterligare indikerade att bakterier från zebrafisktarmarna var Clostridioides difficile. Att arbeta med anaeroba bakterier kräver att de aeroba stegen hålls korta eftersom det påverkar bakteriernas biologi förstås. Medfödd immuncell i zebrafiskar kan manipuleras.Till exempel kan de dechiffrera mekanismen för de medfödda immuncellsvaren på infektionen. Vår metod indikerade att zebrafisk kan vara ett verktyg för att studera anaerob patogen från mänsklig tarm. För att arbeta med multiresistenta patogener krävs att lämpliga säkerhetsåtgärder vidtas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analysera<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migration använder Cell Transplantationer och Time-lapse avbildning i Zebrafish embryon

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utveckling av en etanol-inducerad Fibrotisk Lever modell i Zebrafish att studera stamceller-medierad Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En mångsidig Monteringsmetod för Long Term avbildning av zebrafisk utveckling

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissekering av Larvernas Zebrafish gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av Larval zebrafiskar som ett djur-modell för att undersöka Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Electroretinogram inspelning i Larval Zebrafiskar använder A roman konformade Sponge-tip elektrod

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...